第1章-免疫球蛋白及其超家族

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第一章 免疫球蛋白及其超家族,第一节 免疫球蛋白的结构,第二节 免疫球蛋白的生物合成和基因结构,第三节 免疫球蛋白的生物学功能,第四节 单克隆抗体及基因工程抗体,第五节 免疫球蛋白超家族的组成和特点,第一节 免疫球蛋白的分子结构与特性,免疫球蛋白是一类其分子结构和功能研究得最为清楚的免疫分子。关于免疫球蛋白分子的结构和功能的研究是现代免疫学中的一大突破。尽管抗体的发现很早，但由于在血清中存在的抗体分子不均一，即有异质性，故对其结构的研究十分困难。,自发现多发性骨髓瘤病人血清中含有均一的免疫球蛋白(单克隆,Ig,),后,在19591963年,R.Porter,和,G.,Edelman,采用酶及还原剂消化和分离免疫球蛋白技术,弄清了免疫球蛋白的基本结构,从而提出免疫球蛋白的结构模型。,2,3,4,一、免疫球蛋白的基本结构,五类免疫球蛋白,IgG,，,IgM,，,IgA,，,IgE,，,IgD,的单体分子结构都是相似的，即是由两条相同的重链(,heavy chain,H,链)和两条相同的轻链(,light chain,L,链)四条肽链构成的“,Y”,字形的分子,。,IgG,IgE,血清型,IgA,IgD,均是以单体分子形式存在的,IgM,是以五个单体分子构成的五聚体,分泌型的,IgA,是以二个单体构成的二聚体。,5,(一)重链(,heavy chain,H,链),重链大约是由 420440个氨基酸组成，分子重大约为5000077000，两条重链之间由一对或一对以上的二硫键(-,S-S-),互相连接。,重链从氨基端(,N,端)开始最初的110个氨基酸(约占整个重链的1/4)的排列顺序以及结构是随抗体分子的特异性不同而有所变化,这一区域称为,重链的可变区,(,variable region,简称,V,区,),它赋予抗体以特异性,。,在重链的可变区(,VH),内部,有四个区域的氨基酸最易发生变化,称为,高(超)变区,(,hypervariable,region),氨基酸残基位置分别位于 3137,51 58,8491,101110,其余的氨基酸变化较小,称为,骨架区,(,framework regions)。,6,重链（2）,其余的氨基酸(占重键的3/4)数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定,称为,稳(恒)定区,(,constant region,简称,C,区,)。,免疫球蛋白的重链有五种类型,-, ,由此决定了免疫球蛋白的类型,即,IgG,IgM,IgA,IgE,IgD,的重链分别为, ,。,因此同一种动物,不同种类免疫球蛋白的差别就是由重链所决定的。,7,(二)轻链(,light chain,L,链),轻链是由 213214 个氨基酸组成，分子量约为22500。两条相同的轻链其羧基端(,C,端)靠二硫键分别与两条重链连接。,轻链从氨基端开始最初的109个氨基酸(约占轻链的1/2)的排列顺序以及结构是随抗体分子的特异性变化而有差异,称为,轻链的可变区,(,variable region,V,区),与重链的可变区相对应,构成抗体分子的原结合部位,其余的氨基酸比较稳定,称为,轻链的恒定区,(,constant region,C,区)。,8,9,(三)免疫球蛋白的功能区(,domain of,immunoglobulin,),免疫球蛋白的多肽链分子可折叠形成几个由链内二硫键连接成的环状球形结构，这些球形结构称为,免疫球蛋白的功能区,(,domain)。,IgG,IgA,IgD,的重链有四个功能区,其中有一个功能区在可变区,其余的在恒定区,分别称为,VH.CH1,CH2,CH3；,IgM,和,lgE,有五个功能区,即多了一个,CH4。,轻链则有两个功能区,即,VL,和,CL,分别位于可变区和恒定区。免疫球蛋白的每一个功能区都是由约110个氨基酸残基组成。,10,1.,VH-VL,这是抗体分子结合抗原的所在部位。,2.,CH1-CL,为遗传标志所在。,3.,CH2,为抗体分子的补体结合位点,与补体的活化有关。 4.,CH3,与抗体的亲细胞性有关,IgG,同一些免疫细胞的,Fc,受体结合就是这个部位。,免疫球蛋白的这些功能区虽然功能不同，但其结构上却具有明显的相似性，即同源性(,homology),故又称免疫球蛋白的同源区。这种结构上的相似性提示这些功能区最初可能是由单一基因编码,通过基因复制和突变而衍生进化而成。,11,在轻链的可变区(,VL),内部有三个,高变区,氨基酸残基位置分别位于2632,4855,9095,这三个部位的氨基酸变化特别大。其余的氨基酸变化较小,称为,骨架区,。,免疫球蛋白的轻链根据其结构和抗原性的不同可分为,K(Kappa),型和,(Lambda),型两个型,各类免疫球蛋白的轻链都是相同的,而各类免疫球蛋白都有,K,型和,型两型轻链分子。,型和,型轻链的差别主要表现在,C,区氨基酸组成和结构的不同,因而抗原性不同,这也是轻链分型的依据。,12,13,Ig,的绞链区,在两条重链之间二硫键连接处附近的重链恒定区,即,CH1,与,CH2,之间大约30个氨基酸残基的区域为,免疫球蛋白的绞链区(,hinge region),由 25个链间二硫键、,CH1,尾部和,CH2,头部的小段肽链构成。,此部位与抗体分子的构型变化有关,当抗体与抗原结合时,该区可转动,以便一方面使可变区的抗原结合点尽量与抗原结合,可与不同距离的两个抗原表位结合,起弹性和调节作用;另一方面可使抗体分子变构,使其补体结合位点暴露出来。,免疫球蛋白的绞链区具有坚韧性,这与该部位含较多,脯氨酸残基,有关,14,15,二 免疫球蛋白的微细结构1. 轻链结构,所有抗体的轻链都可分成两类或两个同型，,K(Kappa),型和,(Lambda),。,每一轻链都形成,V,区和,C,区，各大约110个氨基酸。在,V,区，有3个超变区，分别为,CDR1, CDR2,和,CDR3,每一个大约10个氨基酸，其中,CDR3,最可变。,不同抗体分子的,CDR,之间序列的不同，引起了突起并具有独特的化学结构。,2. 重链结构,同轻链一样，重链残基变异最大的区域也集中于,CDR1, CDR2,和,CDR3,。,所有重链都可以表达成两种分子形式，区别在于最后一个,CH,功能的近羧基端氨基酸序列的不同。,血浆中的分泌抗体：末端带电的和亲水的氨基酸残基。膜抗体：包含大约26个不带电的亲水侧链后跟着数目不等的带电氨基酸形成胞质片段。亲水残基形成,a,-,螺旋，穿过膜脂质双层的亲水部分；氨基酸碱性侧链与膜表面的磷脂群相互作用。,17,尾片：重链,和,的分泌形式在近羧基端的最后一个,CH,功能区有一附加的延伸的非球形序列，称之。,连接链（,J,）：,为一附加的15,KD,多肽。以二硫键连接尾片，形成稳定的多聚体，如,IgM,的五聚体，,IgA,的二聚体。,所有的重链都有糖基化的,N,端，即含有与天冬氨酸侧链相连的,N,连接的寡糖基团。,18,back,19,3. 重链与轻链的连接,重链与轻链间的相互作用包括共价连接和非共价连接。,共价连接存在于以二硫键连接的轻链羧基端和重链,CH1,区；非共价连接主要来自于,CL,区与,CH1,区以及,VL,与,VH,之间的疏水作用。,20,二 抗体分子与抗原的结合,生物性抗原的结构特征,抗体与抗原结合的结构基础,抗体与抗原结合的亲和力和亲合力,21,一 生物性抗原的结构特征,磷脂或磷脂多糖复合物,：抗原决定簇完全具有大分子共价结构的功能,蛋白质,：相邻的氨基酸残基形成的表位称为线,形决定簇。长度大约6个氨基酸。大多数情况,下，自然状态下的线形决定簇不能与抗体结合，只有当蛋白质变性的时候才能结合。线形氨基酸序列不同部位的氨基酸残基通过折叠形成空间结构，称为构象决定簇。,23,针对某一线性决定簇和构象决定簇的特异性抗体可用来确定某一蛋白处于变性状态还是自然状态。,蛋白质可能倾向于共价修饰，如磷酸化或特异性的蛋白裂解，改变共价结构，可产生新的抗原表位。（图）,大分子物质可形成多个抗原决定簇。如蛋白质由单体构成，具有多价性，可与一个抗体上的多个结合位点或多个抗体结合。,24,二 抗原与抗体结合的结构基础,不同抗原特异性抗体的,VL,和,VH,不同，变化多位于超变区内。,超变区中的变化，既可通过自发突变，也可通过特异性点突变产生，最终改变抗原结合的特异性。,晶体衍射分析显示，形成伸展的环，暴露在抗体的表面，与抗原发生作用。,抗原抗体晶体衍射分析显示，超变区氨基酸能与抗原紧密结合。,CDR3,结合最紧密且变异最大。,25,三 抗体与抗原结合的亲和力和亲合力,亲和力或结合力,：在抗原抗体反应体系中，如果抗体比抗原的浓度低的多，那么在平衡时抗体分子结合抗原的比率取决于抗原分子的浓度和抗原抗体结合的强度。在这一状态下，能使一半的抗原形成复合物，而另一半游历状态的抗原浓度可衡量结合力或亲和力的大小。,抗原浓度以体积摩尔浓度测定，称为相互作用的解离常数（,K,d,),K,d,越小，亲和力越大。,在天然的血清中，含有某一特殊抗原而具有不同亲和力的抗体混合物中，主要依靠,CDR,准确的氨基酸序列。,亲和力的成熟,：一个抗体分子的平均亲和力可通过重复免疫而增强。,亲合力,：所有位点结合力的总和称为亲合力。,第二节 免疫球蛋白的生物合成和基因结构一. 抗体库的多样性,抗体库：每一个体能产生抗体特异性的总和。,初级抗体库：个体在对不同抗原初次免疫应答中产生的所有抗体的总和。这取决于免疫之前就存在并表达明确抗原特异性膜,Ig,分子的,B,细胞克隆数目，每一个体估计有约10,9,或更多。,28,二,B,淋巴细胞的成熟,前,B,细胞：胞质中出现重链, （,包括,V,区和,C,区），与一种非免疫球蛋白结合，该蛋白的作用是防止新合成的,链降解和促进膜免疫球蛋白的合成。,不成熟的,B,细胞：合成,K,和,链，与重链结合，组装成,IgM,暴露于细胞表面，作为抗原的特异受体。受抗原刺激后，不能增殖和分化。一旦遇到抗原（多为自身抗原），就会产生不反应性或耐受性。,29,一旦一个,B,细胞合成出一种完整的重链和轻链，就不能再产生另外一种带有不同,V,区的重链和轻链。,成熟的,B,细胞：进入外周血液循环和淋巴组织，膜上带有,IgM,和,IgD,具有相同的,V,区,和抗原特异性，对抗原刺激能产生应答。有些,B,细胞并不表达,IgD,。,除非遇到抗原刺激，否则经过3-4天的半衰期后死亡。,激活的,B,细胞：成熟的,B,细胞遇到抗原刺激后形成的。细胞发生增殖和分化，分泌性,Ig,增多，而膜,Ig,减少，并表达, 。,一部分不分泌抗体，形成记忆细胞。,30,浆细胞：产生高水平分泌,Ig,，,建立初次和再次的免疫应答。,亲和力成熟：尽管每一,B,细胞克隆的成员都表达同样的,V,区，但当对抗原应答时也会发生抗体,V,区精细的变化，特别是分泌性抗体和抗原特异性,B,细胞膜,Ig,的平均亲和力在抗原刺激后随之增加，并且再次应答时明显高于初次应答，即亲和力成熟。,31,32,B,细胞产生,Ig,的两个特征,每一,B,细胞克隆及其子代仅对一种抗原决定簇是特异的。在两套亲本的,Ig,等位基因中，只有一套在,B,细胞克隆的最早成熟时期表达，称为等位基因排斥。这是,B,和,T,淋巴细胞抗原受体的共同特征。,每一,B,细胞克隆只能产生一种,K,链或一种,链，称为亲链同型排斥。,33,三 免疫球蛋白的基因结构,免疫球蛋白（,Ig,）,分子由,IGK,IGL,和,IGH,基因编码。这些基因定位于不同的染色体。1965年,Dreyer,和,Bennett,提出假设认为，,Ig,的,V,区和,C,区由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。1976年,Hozumi,和,Tonegawa,应用,DNA,重组技术证实了这一假设。,Tonegawa,因在免疫球蛋白基因结构研究方面有重大突破而获1987年诺贝尔生理和医学奖。,35,（一）免疫球蛋白基因的结构1.,Ig,重链可变区（,V,区）基因,重链基因座位于14号染色体。,V,区基因由,V,、,D,、,J,三种,基因片段经重排后形成。编码重链,V,区基因长约10002000,kb,，,包括,V,、,D,、,J,三种,基因片段。每个,V,基因片段上游有,L,基因片段，编码约20-30个疏水性氨基酸的信号肽。,36,重链,V,基因片段：小鼠，可分为9个家族，每个家族含有2-60个成员不等，这些家族多为集散分布。人，共65个基因片段，至少有7个家族，各家族成员混杂分布。,V,基因片段编码可变区约98个氨基酸残基，包括,CDR1,和,CDR2,。,重链,D,基因片段：,D(diversity),是指多样性。在,Ig,基因结构中，,D,H,基因片段在,V,H,基因的3,端，,D,基因片段编码重链,V,区大部分,CDR3,。,人类,D,H,片段,有27个。,重链,J,基因片段：,J（joining）,是指连接，是连接,V,和,C,基因的片段，位于,D,H,基因的3,端。,J,H,编码约15-17个氨基酸残基，包括重链,V,区,CDR3,中,除,D,H,编码外的其余部分和第四骨架区。人有9个,J,H,基因片段，其中6个有功能。,37,2.,Ig,重链恒定区（,C,区）基因,重链恒定区由多个外显子组成，位于,J,基因片段的下游，相隔1.3,kb,，,每个外显子编码一个结构域，铰链区由单独的外显子编码。,大多数分泌的,Ig,重链,C,端片段（尾端）是由最后一个,C,H,外显子的3,端编码，而,链的,尾端由一个单独的外显子编码。编码膜,Ig,C,端区段（40-70,aa,）,由1-2个附加的外显子编码，距编码分泌型重链的最后一个外显子的3,端至少1.4,kb,。,小鼠,C,H,基因,约占2000,kb,其外显子从5,端到3,端排列是5,-,C,-,C,-,C,3,-,C,1-,C,2b-,C,2a-,C,-,C,-3,。,人,C,H,基因,功能片段有9个，排列为5,-,C,-,C,-,C,3,-,C,1-,C,1-,C,2-,C,4-,C,-,C,-3,。,38,3.,Ig,链基因,在人类，该基因座位于22号染色体，,V,有30个，可分为,V,1-,V,10,十个家族，,主要是,V,1-,V,3，,进化上比较保守。,与,H,链和,链不同，,J,和,C,成对排列，4个,J,和4个,C,基因片段分别形成,J,1-,C,1,、,J,2-,C,2、,J,3 -,C,3,和,J,4,-,C,4,。,39,4.,Ig,K,链基因,人类该基因座位于2号染色体，,V,K,基因片段有40个，编码,V,区,N,端的1-95位氨基酸，包括,CDR1,CDR2,和部分,CDR3,。,根据核苷酸同源性，,V,K,可分为7,个,家族或亚群。,J,K,基因位于,V,K,基因的3,端，有5个片段，编码,V,区靠近,C,端侧的第96-108氨基酸。,C,k,只有一个，编码,C,区（109-214）。所有,K,轻链具有同一结构的,c,区。,40,41,42,43,44,第三节 免疫球蛋白的生物学功能一.,B,细胞抗原受体的膜,Ig,抗原与表达在,B,细胞表面的膜受体(Ig)特异性结合和识别。研究表明，细胞表面Ig通过多价抗原发生的交联导致,B,细胞激活。,Ig,分子超变区独特的决定簇即独特位，独特位的集合构成其独特型。抗独特型抗体与反应性淋巴细胞表面,Ig,连接，即可调节免疫应答的强度。,45,46,二. 中和抗原的反应,毒素，药物，病毒，细菌和一些寄生虫通过结合到细胞表面特异性,Ig,而引起细胞损伤,分泌性,Ig,由于异物上的抗原决定簇结合而阻碍损伤的发生，减轻毒性或炎症过程。,47,三.,Ig,介导的特异性功能1.,IgG,和,IgM,激活补体,游离的,IgG,和,IgM,不能,结合补体中的,C,1q,因此补体系统不能被激活，,C,1q,可,与免疫复合物中的聚集的,F,c,结合。,C,1q,通过,IgG,的,C,2,区发生相互作用，不同的,IgG,亚型触发补体活化的能力不同，依次为,IgG3IgG1IgG2,而,IgG4,则无此功能。,分泌型,IgM,以多聚体存在，但,C,1q,由于空间位阻的影响，不能与循环中,IgM,的三维结构结合。但,IgM,结合到细胞表面能改变,Ig,的构象，使,C,1q,能与,Fc,片段结合。,48,2.,IgG,和,IgM,调理增强吞噬作用,单核细胞和中性粒细胞都表达,IgG,分子的,Fc,段受体，至少有3种不同类型的,Fc,受体，每一种都对不同的,IgG,亚型有不同的亲和力和选择性。且白细胞表面三种,IgG,的的,Fc,受体都含有,Ig,样区，同属于,Ig,超家族成员。通过,Fc,受体，,IgG,分子结合或披覆于抗原颗粒上，结合的,IgG,就能增强细胞的吞噬作用，称为调理作用。,IgG1,和,IgG3,调理,作用最强。,另外，补体,C3b,片段也可与白细胞的,C3b,受体结合，,C3b,有免疫复合物激活补体产生，因此而产生间接的调理作用和增强吞噬作用。,49,50,51,3.,IgG,、,IgE,和,IgA,在,抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用,抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（,ADCC,）：,在,ADCC,中，结合抗体主要是由白细胞上的低亲和力,Fc,受体介导的。在,NK,细胞中，,IgG,具有两种不同的功能。一是选择性地杀伤结合,IgG,的靶细胞，而不杀伤未结合,IgG,的细胞。二是,Fc,受体的出现（可能是聚集）激活,NK,细胞，合成和分泌细胞因子如,TNF,和,IFN-,以及释放颗粒，引起溶细胞作用。,嗜酸性粒细胞能表达,IgE,或,IgA,抗体的,Fc,受体,引起,ADCC,主要针对寄生虫如蠕虫。嗜酸性粒细胞中的碱性蛋白质能杀死蠕虫。,52,53,54,4.,IgE,在超敏反应中的作用,肥大细胞和嗜碱性粒细胞表达高亲和力的,IgE,分子的,Fc,段受体，该受体在缺乏抗原的情况下也能与,IgE,单体结合。特异性抗原能引起,IgE,分子及其聚集，从而导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放炎性和血管活性介质，合成脂源性介质和细胞因子，引发速发性过敏反应。,55,5.,IgA,介导的黏膜免疫,IgA,能选择性地穿过肠或黏膜覆盖器官的黏膜屏障。,IgA,总,含量最高，但血浆中较少。,器官的上皮细胞，能表达特异性二聚体,IgA,分子的,Fc,受体，称为分泌蛋白或,S,蛋白，,S,蛋白能与上皮细胞基底面的,IgA,结合，结合的,IgA,通过囊泡转运从细胞移动到黏膜表面，发挥功能。,56,6. 母体,IgG,在新生儿免疫中的作用,母体的,IgG,穿过胎盘进入胎儿循环中，而,IgA,由母体分泌到乳汁中，新生儿由肠道吸收至血液。,7.,IgG,介导的免疫应答反馈抑制,聚集的,IgG,或含,IgG,的抗原抗体复合物结合到,B,细胞表面的,Fc,受体上，可以抑制这些,B,细胞的激活，称为抗体反馈。,第四节 单克隆抗体,Khler,和,Milstein,在1975年建立了体外淋巴细胞杂交瘤技术,用人工的方法将产生特异性抗体的,B,细胞与骨髓瘤细胞融合,形成,B,细胞杂交瘤,这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性,又具有,B,细胞分泌特异性抗体的能力,由克隆化的,B,细胞杂交瘤所产生的抗体即为单克隆抗体。,59,一. 单克隆抗体的生产过程,B,细胞的制备：,纯化抗原免疫,Balb,/c,等纯系小鼠，免疫2-3次，间隔2-4周，末次免疫后3-4天，取脾脏，制成10,3,/,ml,的脾细胞悬液，为亲本的,B,细胞。,骨髓瘤细胞的制备：,用与免疫相同来源的小鼠骨髓瘤细胞，其本身不分泌免疫球蛋白，且具有某种营养缺陷。可用,Sp2/0,或,NS-1,其缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（,HGPRT,酶），不能在,HAT,培养基上生长。培养至对数生长期，细胞数达10,5,-10,6,/,ml,。,60,饲养细胞的准备：,常用的细胞有小鼠胸腺细胞，小鼠腹腔巨噬细胞等。其作用一是减少培养板对杂交瘤细胞的毒性，二是巨噬细胞能清除部分死亡的细胞。,培养基选择：,常用,HAT,培养基，,H,为次黄嘌呤，,T,为胸腺嘧啶核苷，二者都是旁路合成,DNA,的原料，,A,是氨甲喋呤，是细胞合成,DNA,的阻断剂。在该培养基中，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。,细胞融合：,将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入融合剂（50%,PEG4000,）。,依次用,HAT, HT,和完全,DMEM,培养。,61,检测抗体：用,RIA, ELISA,反向间接血凝试验检测抗体，筛选抗体阳性孔。,杂交瘤细胞的克隆化：阳性孔应尽早克隆化，一是为了获得单个克隆；二是防止杂交瘤细胞因染色体丢失而丧失分泌抗体的能力。一般需反复克隆3-5次方能使杂交瘤细胞稳定。方法有：有限稀释法，显微操作法，软琼脂平板法等。,62,单克隆抗体的生产,在动物体内诱生单克隆抗体：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，瘤细胞无限繁殖，导致腹水产生，每毫升腹水约可产生5-20,mg,体外细胞培养：大量培养杂交瘤细胞，收集培养液，获得大量的单克隆抗体。,微球技术制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞包于特制的微球内，进行大量发酵培养,。,63,HAT,选择培养基(,DMEM),H,为次黄嘌呤(,hypoxanthine,),T,为胸腺嘧啶核苷(,thymidine,),A,是氨基喋呤(,aminoplerin,),在该培养基中,未融合的骨髓瘤细胞不能生长,因它缺乏,HGPRT,酶不能利用分路途径合成,DNA,内源性的合成又受到氨基喋呤的阻断;至于未融合的脾细胞则在2周内自然死亡;所以只有融合的杂交瘤细胞才能在该培养基中生长。,64,单克隆抗体的优点与应用,单克隆抗体具有无可比拟的优越性,具有高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低并可大量生产等优点。,在血清学技术方面,单克隆抗体用于血清学技术,进一步提高了方法的特异性.重复性.稳定性和敏感性,同时使一些血清学技术得到了标准化和商品化,即作成诊断试剂盒。,在免疫学基础研究方面,单克隆抗体作为一种均质性很好的分子,用于对抗体结构和氨基酸顺序的分析,促进了对抗体结构的探讨;应用单克隆抗体对淋巴细胞表面标志以及组织细胞相容性抗原的分析, 推动了免疫学的发展。,65,通过采用杂交瘤技术,制备出肿瘤细胞特异性抗原的单克隆抗体,然后与药物或毒素连接制成免疫毒素(,immunotoxin,)，,又称生物导弹,用于肿瘤的临床治疗,这在医学上已获初步成效。,利用单克隆抗体的特异性,可将单克隆抗体与琼脂糖等偶联制成亲和层析柱,可从混合组分中提取某种抗原成分。此技术可与基因工程疫苗的研究相结合,即先用单克隆抗体作为探针,筛选出保护性抗原成分或决定簇,然后再采用,DNA,重组技术表达目的抗原。,66,三、基因工程抗体(,gentic,engineering antibody),基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构(如,Fc,片段),从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷(如鼠源单克隆抗体在人体内使用会引起抗体产生而降低其效果,Fc,片段的无效性和副作用)。,基因工程抗体的制备过程首先是获得抗体基因片段,然后将抗体基因片段导人真核细胞(如杂交瘤细胞)或原核细胞(如大肠杆菌),使之表过具有免疫活性的抗体片段。,目前基因工程抗体有以下几种类型：,嵌合抗体 重构型抗体 单链抗体,Ig,相关分子 噬菌体抗体,67,基因抗体的类型,(一)嵌合抗体(,chimeric,antibody),又称杂种抗体,是指在同一抗体分子中含有不同种 属来源抗体片段的抗体。,迄今构建的嵌合抗体多为“鼠-人”类型,也就是抗体的,Fab,或,F(,ab,) 2,来源于鼠类,而,Fc,片段来源于人类。,(二)重构型抗体(,reshaping antibody),将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体,Fab,骨架区的编码基因中,再将此,DNA,片段与人免疫球蛋白恒定区基因相连,然后转染杂交瘤细胞,使之表达嵌合的,V,区抗体。,(三)单链抗体(,single-chain antibody),又称,FV,分子。是由,VL,区氨基酸序列与,VH,区氨基酸序列经肽连接物(,linker),连接而成。,68,(四),Ig,相关分子,可将抗体分子的部分片段(如,V,区或,C,区)连接到与抗体无关的序列上(如毒素),就可创造出一些,Ig,相关分子,例如可将有治疗作用的毒素或化疗药物取代抗体的,Fc,片段,通过高变区结合特异性抗原,连接上的毒素可直接运送到靶细胞表面，起生物导弹的作用。,(五)噬菌体抗体(,Phage antibody),是将已知特异性的抗体分子的所有,V,区基因在噬菌体中构建成基因库,用噬菌体感染细菌,模拟免疫选择过程,具有相应特异性的重链和轻链可变区即可在噬菌体表面呈现出来。,69,第五节 免疫球蛋白超家族,免疫球蛋白超家族（,immunoglobulin superfamily,IgSF,）,是由,Williams,在20世纪80年代初提出，研究发现许多细胞膜表面分子和机体某些蛋白分子多肽折叠方式与,Ig,相似，在氨基酸组成上,Ig,可变区或/和恒定区有较高的同源性，它们可能从同一祖先基因进化而来。编码这些多肽链的基因称为免疫球蛋白基因超家族，其编码产物称为免疫球蛋白超家族。,IgSF,主要以膜分子形式存在，也有游离的形式。,70,72,一 免疫球蛋白超家族的组成,IgSF,主要包括淋巴细胞受体（,Ig,及,BCR, TCR/CD3, NK,细胞受体），,MHC,抗原及其相关分子，免疫球蛋白,Fc,段受体，多种黏附分子和分化抗原，以及与神经系统功能有关的黏附分子等。,IgSF,分子,种类至少有数百种，分布十分广泛。如1/3的白细胞分化抗原属于,IgSF,。,IgSF,73,不同组,IgSF,结构域的类型和数目特点,在,Ig,和淋巴细胞受体中，5条,Ig,重链各含一个,V,区，3-4个,C1,区；2条轻链各含一个,V,区和,C1,区；,TCR,4,条链各含条轻链各含一个,V,区和,C1,区；,MHC,抗原及相关分子只含一个,C1,区，,MHCI,类分子重链,1，2,结构域以及,MHC II,1，,结构域具有多态性，但其结构不属于,IgSF,;,免疫球蛋白,Fc,受体基因除,Fc,R,外均定位于1号染色体；除,polyIgR,外，其余,IgFc,受体有二至三个,C2,区。,74,MCSFR、PDGFR,和,SCFR,阳都有五个,IgSF,结构域，其中远膜侧四个,C2,结构域，近膜端一个,V,样区，这些受体以同源二聚体方式结合相应配体，胞浆区有,PTK,结构。,IL-6R,链、,gp130、IL-11R,链和,G-CSFR,的胞膜外结构除,N,端各含有一个,C2,样区外，靠近胞膜侧各有一个细胞因子受体结构域和一个或四个,III,型纤连蛋白结构域。,与神经组织细胞功能有关的,IgSF,分子中，合有五个以上,C2,区的,IgSF,分子大都以分布在神经系统为主，而含有一至二个,V,样区，分子质量相对较小的,IgSF,分子在神经系统和免疫系统均有分布。,75,二、免疫球蛋白超家族的特点,(一),IgSF,的结构特点,应用,x,射线衍射晶体分析法已对多种,IgSF,分子的结构域进行了分析，包括,IgV,和,C,结构域，,MHCI, II,类分子的一些结构域，,CD4,第一、二结构域和三、四结构域等。,IgSF,结构域是以其独特的、称之为免疫球蛋白折叠(,Ig foId,),形成的球形结构。每个,Ig,折叠中有两个,片层(,P1eated sheet)，,每个片层包括3-5个反平行的折叠股。每个折叠股有510个氨基酸残基。绝大多数18,SF,结构域的两个,片层之间有一对保守的二硫键连接，使其形成稳定的球状结构。每个折叠片层的核心是由,A、B、E、D,和,G、F、C,折叠股组成。,根据,片层中折叠股的组成，形成二硫键的两个半肮氨酸之间氨基酸的数目，以及同,IgV,区或,C,区同源的程度，,IgSF,结构域可分为,V,组、,C1,组和,C2,组。,76,(1),V,组,V,组(或称,V,样区)中两个,p,片层是由,ABEDGFCCC”,九个折叠股组成，两个半肮氨基酸之间的氨基酸数量较多。具有,IgSF,v,样的分子除,Ig,重链、轻链的,v,区和,TCR, ,的,V,区外，还有,CD4,第一、三结构域，细胞因子受体,M-CSF、SCFR、PDGFR,靠近胞膜的结构域，以及表达于免疫系统和神经系统中外周髓磷脂糖蛋白(,P0,和脊髓灰质炎病毒受体(,PVR),等。,(2),C1,组,C1,组中两个半胱氨酸之间约含50-60个氨基酸残基，含有,ABEDCFC,七个,折叠股。,B,和,C,折叠股之间的特征性序列为,G1y,Phe,几,y,ko,，,具有,C1,结构域的分子有,Ig,重链和轻链,c,区，,TCR, ,链,C,区，,MHCI,类分子,3结构域，,MHCII,类分子,2,3,，,以及,MHC,样分子,CD1,等靠近胞膜的结构域。,77,78,(3),C2,组,C2,组结构域由,ABEDGFC,七个,折叠股组成，在,E-F,折叠股有,V,样区的保守序列,但形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸数约为50。这种结构似介于,V,和,C1,结构域之间。含有,C2,结构域的,IgSF,分子种类最多，分布也最广泛，包括,CD3,分子中的, ,链，大多数具有,IgSF,的细胞因子受体，以及表达在神经系统中的,IgSF,分子。,80,(二),IgSF,的功能特点,IgSF,的功能是以识别为基础，因此又称为识别球蛋白超家族。,Ig,折叠形成一个紧密的球状结构，提供了与不同球状结构多肤或化学基团粘附的分子基础，使之发挥不同的生物学功能。,IgSF,很可能最早起源于原始的具有教附功能的基因，通过复制和突变衍生形成了识别抗原、细胞因子受体、,IgFc,段受体、细胞问教附分子以及病毒受体等不同的结构域。,IgSF,识别的基本方式有以下几种。,81,1.,IgS,F,和,Ig,SF,相互识别,IgSF,分子相互识别中有同嗜性的相互作用和异嗜性相互作用两种形式。,(1)同嗜性的相互作用 如相同神经细胞教附分子(,NCAM),之间的相互作用，血小板内皮细胞粘附分子-1(,PECAM1，CD31),的相互识别，这类分子胞膜外区具有56个,C2,结构域。,(2)异嗜性相互作用 如,CD2,与,LFA3，CD4,与,MHC,量类分子的单态部分(,2,和,2)，,CD8,与,MHCI,类分子的单态部分(,3等之间的相互作用。,82,2,IgSF,和整和素相互识别,如,ICAM,一1(,CD54)、ICAM,一2(,CDl,02)、,ICAM,一3(,CD50),与,LFA,一1(,CDlla,CDl8)，VCAM,一1(,CDl,06)与,VLA,一4(,CD49dCD29,之间的相互作用。有研究发现，,IgSF,第一个结构域中,Cx34C,基序是结合整合素分子的位点，在整合素分子上与此相结合的基序为,LESFI,。,83,3,IgSF,和其他分子的相互识别,包括,TCR,识别,MHC I,类或,II,类分子与抗原肽复合物，,ICAM1,与粘蛋白样结构,CD43(1eukoaidin),结合，髓磷脂相关糖蛋白(,MAG),与细胞外基质胶原和肝素结合，,CD56,结合类肝素硫酸盐，,CD22,结合,CD54RO,以及细胞因子受体识别细胞因子等。,84,