外源性DNA残留检测原理及过程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,外源性DNA残留检测原理及过程,培训资料（QC内部）,1,外源DNA残留理论,供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。,2,DNA变性过程,3,理论详解,变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低2530左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性,4,理论详解,影响复性速度的因素很多，同样条件下，DNA顺序简单的分子复性很快，如polydT和polydA由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。DNA片段的大小也影响变性的速率，因为DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。同样条件下，同一种DNA浓度愈高，复性速度也愈快。溶液的离子强度对复性速度也有影响，通常盐浓度较高时，复性速度较快。,5,理论详解,有人最早对DNA变性过程进行深入研究的。它们所获得的结果表明，在达到Tm值时，两条DNA单链分离开。如果在加热之后慢慢地冷却，则出现部分复性，即DNA的一部分回复到双螺旋结构。复性的程度取决于DNA浓度及信息含量的多少。病毒DNA（信息含量少）比哺乳动物DNA容易复性，而DNA浓度较高时，有利于复性，快速冷却使DNA仍然处于变性状态，这时自由单链成链线团结构。对这种情况，人们称之为螺旋-线团转化过程（helix-coil-transition）。快速冷却时消光系数固然有所下降，但比天然DNA的数值始终要大,6,实验过程流程图,7,DNA探针标记,1.用灭菌注射水稀释阳性DNA到62.5ug/ml，取16 L 阳性对照DNA溶液(含DNA1ug)加Eppendorf 管。,2. 置100 水浴10 分钟，然后即刻冰浴冷却。,3 .加4L Kit 1(DIG-High Prime)到已经变性的DNA管中，混合后简单离心。,4 .置37 水浴 温育过夜。,5 .置65温育10分钟，以终止标记反应。,8,样本的处理,1.阳性对照 ：用TE缓冲液稀释阳性DNA对照至1000ng/mL、然后依次10倍稀释成100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL。,2.阴性对照：采用TE缓冲液为阴性对照。,3.供试品、阳性对照和阴性对照加样。,注：,供试品按抗体1人份剂量按700mg计，检测加样量含1/100人份剂量，即7mg。供试品可根据实际蛋白浓度，计算加样量。阳性对照和阴性均加样100ul。,9,装膜点样,1.将裁剪好的膜预先用TE缓冲液浸湿，然后把杂交膜装载于Bio-Rad 点样器上。,2 .所有阳性和阴性对照DNA、以及待检样本分别置100水浴10 分钟后即刻冰浴冷却。,3. 以8000rpm转速 离心 5 分钟。,4 .取上清液点样，阴性对照和阳性对照点样量100 L，供试品为实际的计算量。DNA标准阳性对照范围从 100 ng 至 10 pg /点。,5.阳性对照梯度点为一排，供试品、阴性对照另点一排；点样完毕后，再用TE缓冲液冲洗一次，取出杂交膜用铅笔做好标记。,6.膜放到紫外灯下，紫外交联1个小时，然后将膜放入烤箱80烘烤2小时固定DNA。,10,杂交,1.预杂交 ：将点样的膜放入杂交液中40下预杂交30分钟。,2 .探针变性 ：将探针放入100水浴5 min，即刻放入冰盒冷却变性；,3 .将变性的DNA探针加入预热的杂交缓冲液 DIG Easy Hyb (约需3.5 mL/100 cm2 膜面积) ，充分混匀。,4 .点样膜经预杂交后，丢弃预杂交溶液，代之以探针/杂交混合物。,5 .置40 温育16 小时以上。,6. 使用过的DNA探针杂交缓冲液 DIG Easy Hyb可以保存在-15-25中反复使用几次,使用前在68加热10分钟使用。,11,洗涤,用洗涤液A洗涤2次，每次约50 mL，每次5min。,09.5.2 在65-68下，用洗涤液B洗涤2次，每次约50 mL，每次15min。,显色,12,显色,1.用20mL洗涤缓冲液洗涤5分钟。,2 .用封闭液20mL封闭30分钟。,3. 弃去封闭液，加入新封闭液10mL，加入kit 4（Anti-Digoxigenin-AP Conjugate）4L浸泡30min。,4. 用100ml洗涤缓冲液洗涤15分钟，共两次。,5. 用20ml检测缓冲液平衡2min，加入临用新制的显色液（200L的kit 5（NBT/BCIP）,到10ml检测缓冲液）在暗处反应，注意不要振摇。,6 .斑点出现后，用10mL TE缓冲液洗涤，终止反应。,数据分析及结果判定,7. 阳性对照梯度是否清晰可见，而且所生色斑深浅应具有色差梯度。,8.样品色斑与阳性对照色斑比较，确定样品DNA量的范围。,9. 报告结果，抗体原液呈现的斑点颜色应浅于阳性对照100pg点斑点颜色。,13,图例（未酶切）,14,酶切后,15,结束,谢谢,16,