微生物学和寄生虫学质量控制

Textmasterformate durch Klicken bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,Klicken Sie, um das Titelformat zu bearbeiten,Page,77,实验动物微生物质量与动物实验,实验动物传染病流行的基本环节,实验动物微生物学和寄生虫学分类,合格动物群中常见微生物和寄生虫污染及控制,实验动物微生物学和寄生虫学质量检测,传染源,传播途径,易感动物,一、实验动物传染病流行的基本环节,传染源,（,1,）人源性,（,2,）动物源性,引起传染的条件,（,1,）要有病原性和一定的毒力,（,2,）侵入体内的病原体要达到一定的数量,（,3,） 病原体要有适当的侵入门户,传播途径,切断传播途径是控制传染病的主要措施。,（,1,）、直接传染：健康动物与患病动物（包括携带病原体动物）直接接触而感染。如狂犬病病毒、猴,B,病毒、艾滋病病毒等。,水平传播：实验动物群体中互相的传播。传播途径包括消化道、呼吸道或皮肤粘膜创伤等。如沙门氏菌常经消化道感染；仙台病毒常经呼吸道；布氏杆菌病常由配种直接感染等。,垂直传播：由母体通过胎盘将病原体传给胎儿，例如支原体、细小病毒等。,间接传播,（一）非生物性传播：,a,、经空气飞沫、尘埃传播；,b,、以饲料、垫料传播；,c,、经饮水和饮水用具传播；,d,、经笼器具传播。,（二）生物性传播：,a,、节肢动物：苍蝇、蚊子、蟑螂、蚤、虱、蜱、螨等。,b,、野生动物：,野生啮齿类动物,，常携带各种病原体，例如携带流行性出血热病毒的野鼠的尿污染实验动物的垫料、饲料。,c,、实验动物：从外部新购入的实验动物，未经严格检疫和隔离。,d,、饲养、实验人员不注意卫生防疫传染病原体；有些人兽共患病，也可经人传播给实验动物，例如结核、布氏杆菌病等。,易感动物,1,）种类（品种）,2,）年龄,3,）营养状况,4,）机体的抵抗力,5,）机体防御器官状况,传染源、传播途径和易感动物是传染病传播的三个基本环节，缺少任何一个环节，新的传染病就不可能发生，也不可能造成传染病在实验动物中的流行。而当传染病流行已经形成时，切断任何一个环节，流行即告终止。,传染源,传播途径,易感动物,在医学和兽医学研究领域，,疫苗接种,和,药物治疗,是预防传染病的有效手段。 但是实验动物一般不采取疫苗接种和药物治疗，主要由于实验动物的特殊性：,1,、应用疫苗或治疗制剂可能干扰实验结果。,2,、经过治疗或免疫的动物，外表健康，但可能,是带菌或带毒者，可能成为潜在的传染源。,3,、对于小型实验动物，治疗措施可能在经济上,不合算,实验动物卫生防疫主要包括以下几个方面的内容：,1,、平时的预防措施,2,、发生疫病时的扑灭措施,3,、消毒措施,4,、隔离措施,物理性消毒,（,1,）高压蒸汽消毒,：,103.4 Kpa, 121.3, 15-30min,。可杀死芽孢在 内的所有微生物。饲料、垫料、器具等消毒。,（,2,）高热煮沸：,器械、笼具、水瓶等消毒,100 (20min),。,（,3,）干烤消毒：,可达,180-280(15min30min),，消毒效果较好。,（,4,）火焰消毒：,温度可达,300 ,，主要用于不锈钢,笼具、金属器械、墙壁的消毒。,（,5,）照射：,紫外线、,-,射线等，用于空气、饲料、垫,料和器具的消毒。,化学消毒,是使用化学药物,喷洒、浸泡、熏蒸,等，以达到消毒灭菌的目的。常用化学消毒方法包括液体消毒和蒸汽消毒。,（,1,）液体消毒剂：包括石炭酸、过氧乙酸、来苏水、次氯酸等。,（,2,）熏蒸消毒：包括福尔马林和三聚甲醛等。,实验动物微生物微生物学,和寄生虫学分类,二、实验动物微生物学和寄生虫学等级分类,普通动物（,conventional animal,）,CV,清洁动物（,clean animal,）,CL,无特定病原体动物（,specific pathogen free animal) SPF,无菌动物（,germ free animal,）,GF,悉生动物（,gnotobiotic animal) GN,普通动物,conventional animal(CV),必须是不携带主要人兽共患病病原体和动物烈性传染病的病原体。,饲养条件,饲育在开放环境里,使用的垫料和饲料,只消毒不灭菌,;,其饮水须符合城市饮用水标准。,适用范围,只能用于教学实验和某些科研工作的预实验，不能用于科学研究和发表论文的实验。,清洁级动物（,clean animal,）,CL,亦称最少疾病动物（,minimal disease animal),此类动物必须是不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体，又不携带对动物危害大和对科学研究影响大的病原体。,饲养环境,清洁级动物常来自屏障环境的,SPF,动物的后代或降级。饲育使用的垫料、饲料、引用水和用具等均应经过高压蒸汽消毒；或饮用水经过酸化，饲料经过钴（,co60,）辐射灭菌。工作人员需穿无菌服进入屏障环境进行饲养和实验。,适用范围,课题研究和论文发表，以及研制新药，生物制品，保健食品，化妆品等科学实验。,无特定病原体动物（,specific pathogen free animal) SPF,不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体；不携带对动物危害大和对科学研究影响大的病原体；还不携带主要潜在感染或条件致病菌和对科学实验影响大的病原体的动物。,饲养环境,SPF,动物的饲育，一般是先培育出无菌动物，然后再将其后代转移到屏障环境中进行繁育建群。工作人员需穿无菌服装才能进入屏障环境进行饲育或试验操作。,适用范围,适用于大多数科研工作。,无菌动物 （,germ free animal,）,GF,无菌动物是指：动物体内外无可检出的一切生命体的动物。,饲养环境,子宫摘除术（剖腹产）,饲育在隔离环境（隔离器内）,一切用品经过严格包装、严格灭菌后，通过传递仓送入,隔离器,通过手套进行间接实验操作,。,悉生动物（,gnotobiotic animal) GN,动物体内外所携带的生命体是已知的,普通级动物 清洁级动物,SPF,级动物,无菌动物 悉生动物,项 目,GF,SPF,CV,传 染 病,无,无,有或可能有,寄 生 虫,无,很少,有或可能有,实 验 结 果,准确,较准确,有疑问,应 用 动 物 数,少量,少量,多或大量,长期实验效果,可能好,可能好,困难,死 亡 率,很低,低,高,长期实验存活率,约,100,约,90,40,左右,实验标准设计,可能,可能,不可能,统 计 价 值,很好,较好,不准确,实验结果的价值,很高,高,有疑问,不同微生物学等级的实验动物比较,实验小鼠和大鼠病毒学检测标准,国家或,国际组织,动 物,应排除,病毒项目,ICLAS,小鼠,/,大鼠,14/9,中国,小鼠,/,大鼠,5+6/7,芬兰,小鼠,/,大鼠,16/8,日本,小鼠,/,大鼠,8/9,美国,小鼠,/,大鼠,（,9,）,10/8,澳大利亚,小鼠,/,大鼠,13/8,荷兰,小鼠,/,大鼠,11/10,小鼠应排除病毒项目,淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒,汉坦病毒,鼠痘病毒,小鼠肝炎病毒,仙台病毒,小鼠肺炎病毒,呼肠孤病毒,III,型,小鼠细小病毒,小鼠脑脊髓炎病毒,小鼠腺病毒,多瘤病毒,Lymphocytic Choriomeningitis Virus,Hantavirus,Ectromelia Virus,Mouse Hepatitis Virus,Sendai Virus,Pneumonia Virus of Mice,Reovirus type III,Minute Virus of mice,Theilers Mouse Encephalomyelitis Virus,Mouse Adenovirus,Polyoma Virus,大鼠应排除病毒项目,汉坦病毒,仙台病毒,小鼠肺炎病毒,呼肠孤病毒,III,型,大鼠细小病毒,RV,株,大鼠细小病毒,H-1,株,大鼠冠状病毒,/,大鼠延泪腺炎病毒,Hantavirus,Sendai Virus,Pneumonia Virus of Mice,Reovirus type III,Rat Parvovirus,Rat Parvovirus,Rat Coronavirus/Sialodacryoadenitis Virus,实验动物微生物学标准,国家或,国际组织,动 物,细菌真菌,支原体,ICLAS,小鼠,/,大鼠,13/12,中国,小鼠,/,大鼠,8+8/9+7,芬兰,小鼠,/,大鼠,11+9/10+9,日本,小鼠,/,大鼠,10/10,美国,小鼠,/,大鼠,（,16,）,13/12,澳大利亚,小鼠,/,大鼠,12/12,荷兰,小鼠,/,大鼠,7/18,合格动物群中常见微生物和寄生虫污染及控制,普通级动物中弓形虫（,Toxoplasma gondii,）污染,弓形虫是一种人畜共患的寄生虫，小鼠，大鼠，地鼠，豚鼠，家兔和非人灵长类实验动物及猫，牛，羊，猪等都能感染。,弓形虫是细胞内寄生虫，根据不同发育阶段分为五型：,滋养体和包囊出现在中间宿主体内,，,裂殖体，配子体和卵囊只出现在终宿主猫体内。,传播途径,任何动物食入弓形虫的包囊，卵囊或活体，都能受到感染而患弓形虫病。猫科动物的粪便中，常带有卵囊。可以污染草原、牧场、蔬菜、水果等。猫的身上和口腔内常常有弓形虫包囊和活体。直接接触猫易受感染。狗的身上和口腔内常有包囊或活体，养狗的人不小心可能感染。其他家畜、家禽，如：鸡、鸭、鹅、猪、牛、马、羊等动物体内有时带弓形虫包囊和活体。所以食用肉、蛋奶也可能感染，鱼肉体内有时也有弓形虫包囊或活体。鱼也是一个传染源，另外某些吸血昆虫，叮咬人时也可以感染。市售的各种肉制品、香肠、火腿肠、罐头也都可以成为传染源。奶制品、奶油制品、蛋类制品、蛋糕、各类饼干、点心、冰点有时也能成为传染源。,经猫消化道侵入肠上皮细胞发育繁殖,滋养体,弓形虫感染可引起肠粘膜和肠系膜淋巴、心、眼、肾上腺、脾、脑、肺、肝、胎盘及肌肉组织的坏死和损伤。,小鼠感染后会严重影响实验结果,弓形虫感染会改变白血病、乳腺癌、肝癌对化学致癌物的反应性。,影响妊娠期胎儿发育,弓形虫污染的预防,实验动物设施内要保持清洁，定期消毒，严格阻断猫及其排泄物对设施、饲料、垫料和饮水的污染。尽一切可能消灭野鼠。,清洁级动物中的仙台病毒,仙台病毒属于副粘病毒科,副粘病毒属,与人类,HA,2,病毒同被归入副流感病毒,型,它们之间有密切的抗原关系,现在认为,:,啮齿类实验动物是仙台病毒唯一自然宿主。,感染途径,空气和接触途径是病毒传播和扩善的方式。仙台病毒除了鼻内途径外，其它途径均不引起小鼠的自然感染。鼻腔冲洗物或唾液，肺。,偶尔可在肾、肝、脾、等器官发现病毒，,但在尿、血和肠内则没有病毒。,不同品系小鼠对仙台病毒感染的易感性和敏感性明显不同。,在自发性流行中抵抗力大的小鼠如,SJL/j,等死亡率接近,0,，高度易感小鼠如,Swiss,裸鼠则可接近,100,。,感染的裸鼠其疾病症状出现的时间比有免疫机能的小鼠稍晚，并伴有进行性消瘦。在较长的时间里陆续死亡。,仙台病毒在鼠群中引起两种基本类型的感染,慢性：不明显的感染，在,CV,鼠群中长期存在。离乳不久至,6,周龄的小鼠，,感染率很高，伴有血清学的转变，病鼠逐渐康复。,急性：显形感染，一般持续,2-7,个月，以后自愈或转为不显形感染。,临床证状：呼吸困难，新生仔鼠死亡，离乳率显著减低，成,年鼠妊娠期延长。,普通级鼠群中仙台病毒感染是最难控制的病毒感染之一。,凡新引进的动物必须经,8,周检疫,(,检查引入动物和“哨兵”动物的病毒抗体,),。,一旦在屏障环境内的鼠群中检出仙台病毒抗体阳性，若不及时清除所有被感染动物，将导致屏障设施的失败。,2.,暂停繁殖，在相对静止条件下保存这种非繁殖群直至感染消除,(,约,2,个月,),，然后恢复繁殖。,两种方法,1.,消灭已感染鼠群,重引符合标准的种鼠或用无菌技术剖腹取胎重建繁殖群。,小鼠肝炎病毒,(MHV),属冠状病毒科，冠状病毒属，与人冠状病毒,(,普通感冒，或肺炎,),，大鼠冠状病毒,(,新生大鼠肺炎,),，大鼠唾液腺病毒,(,唾液腺，泪腺炎,),同属。有多种毒株。,小鼠肝炎病毒是实验小鼠重要的病毒感染之一。呈现世界范围分布，无明显的季节性。临床表现为肝炎，脑炎和肠炎。,多数情况下是亚临床或慢性感染。,急性发病的临床症状：被毛粗乱，小鼠倦怠，营养不良，脱水，体重减轻。同笼老鼠挤做一团，肌肉震颤，尿色变深，针刺时不愿移动等。老龄老鼠倾向于发生脱水和消瘦。,传播途径,MHV,传播方式有经空气和接触两种。,小鼠是唯一能自然感染,MHV;,通过脑内接种,可实验感染棉鼠,大鼠和地鼠,但兔和豚鼠无反应,。,MHV,是普通级实验小鼠难以清除的病毒之一。,进行剖腹取胎术,结合屏障环境内维持饲养,才能培育无,MHV,感染的清洁级以上小鼠。,必须注意,MHV,垂直传播的可能性。,预防,/,处理,定期检测，有利及时发现屏障环境内的鼠群中鼠肝炎病毒感染。,重新引进符合标准的种群,无菌技术剖腹取胎重建繁殖群,同步交配代乳方法重建繁殖群,暂停繁殖方法重建繁殖群,同步交配的方法,采用同步交配,把,MHV,阳性鼠群中怀孕母鼠自然分娩的新生鼠在分娩后的,24,小时内传给符合标准的代乳鼠带乳。然后在代乳鼠,3,周龄,6,周龄和,12,周龄进行血清学检测,可获,MHV,阴性小鼠。,暂停繁殖法：,从感染群中移去所有新生鼠,离乳鼠和妊娠鼠。停止繁殖,15,周,可排除感染。,15,周后出生的第一代新生在,3,4,周龄,MHV,血清阳性,四周后因从母方获得的抗体衰退而血清阴性。 在第二代小鼠,3,9,周龄,MHV,血清阴性。,SPF,级实验动物中的细菌污染,绿脓杆菌,金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯氏杆菌,Pseudomonas aerugiosa,Staphylococcus aures,Klebsiella pneumoniae,绿脓杆菌,绿脓杆菌是动物和人类胃肠道的一种常在菌。实验动物可通过口咽和胃肠途径感染，常可在小鼠的口咽部和肠道发现。,该菌可导致远交群小鼠,(Swiss-Webster),和近交系小鼠,(C3H),斜颈和转圈症状，被看作是小鼠疾患的主要细菌病原。对免疫环境遭受损害或抑制的宿主，绿脓杆菌可穿过局部淋巴环境和血管环境，导致致死性败血症。,传播,在常规小鼠群的饮水器中能检到绿脓杆菌,在温暖、潮湿的环境中（如,SPF,饲养室的淋浴更衣处）也常检到这种菌。,正常人皮肤中也可携带绿脓杆菌，由,SPF,屏障环境内的工作人员带入屏障环境。,预防,定期对,SPF,小鼠进行微生物学监测，,及时淘汰被感染的鼠群。,对屏障环境的淋浴更衣室常规进行彻,底打扫消毒灭菌并要求进入屏障环境,的工作人员严格执行操作规程和个人,防护用品的穿戴。,通过酸化,(,用盐酸调正,PH2.5),氯化,(10ppm),饮水来预防饮水器对,SPF,小鼠的感染,金黄色葡萄球菌,在小鼠皮肤和粘膜上，常检到致病的金黄色葡萄球菌和一般不致病的表皮葡萄球菌。虽然金黄色葡萄球菌还没有被广泛看作实验小鼠的原发性疾病，但有些文献中报道了其作为皮肤感染，淋巴感染或粘膜感染病原学因子。,感染,小鼠自发性葡萄球菌感染与小鼠品系，营养及屏障环境的操作管理有关。,幼鼠比成年鼠易感。无胸腺裸小鼠因缺少保护性被毛，并缺乏,T-,细胞，而经常发生皮肤和眼窝的葡萄球菌感染。,主要传播途径,据对,SPF,设施的细菌学监测发现，从健康,SPF,小鼠分离的金黄色葡萄球菌的噬菌体型常与从动物管理员体表分离的品系一致。,从有临床症状的感染动物最常分离到的凝固酶阳性葡萄球菌的培养和噬菌体型也能从动物管理员那儿分离到。,预防,/,处理,定期检测及时淘汰患鼠,酸化饮用水,将饲料和垫料彻底消毒灭菌,经常更换垫料,饲养人员和实验人员严格执行隔离措施和操作细则,肺炎克雷伯氏杆菌,克雷伯氏杆菌是人和动物的肠道常在菌，是一种人和动物泌尿，呼吸道感染有关的条件性致病菌,小鼠自发爆发的疾病临床症状是：食欲不振，弓背，被毛粗乱，打喷嚏及呼吸加快。,预防,/,处理,为了从受感染的小鼠中清除这种病原体，很可能需要进行剖腹产和严格的屏障环境。,三、实验动物微生物学和寄生虫学质量检测,检测目的,检测方法,检测规则,检测目的,排出人兽共患病，确保从事实验动物生产的饲养人员和动物实验的科研或教学人员身体健康,排出危害实验动物的常见病多发病，确保实验动物种群的健康，为生命科学研究提供合格的试验动物。,1,）对新引进的普通级动物进行检疫，防止人兽共患病原体或动物烈性传染病带入实验动物种群，或传播给试验人员,2,）定期对生产繁殖的试验动物种群进行抽样检测，及时了解实验动物生产群体微生物学和寄生虫学质量；必要时作出淘汰或降级处理,3,）当实验动物种群发生传染病流行时，检出感染途径，提出控制或预防措施。,4,）对实验动物生产或实验设施进行静态和动态检测，及时掌握实验动物环境条件，了解是否符合实验动物国家标准。,研究确定试验动物微生物学和寄生从学登记标准的划分，和不同等级实验动物的微生物学和寄生虫学质量控制指标。,确保使用实验动物的药品和生物制品的质量，保证进行动物实验的科学研究成果和各种动物试验结果的可能性、准确性和重复性。,检测方法,国内外通用,比较成熟,便于交流。,可操作性强，检测结果易判断，检测率较高。,易实现标准化和规范化，便于推广。,国家推荐性标准,实验动物 微生物学检测方法,1,4 GB/T14926.1,14926.64,2001,实验动物 寄生虫学检测方法,GB/T18448.1,18448.10,2001,实验动物病毒学检测方法,目前我国对实验动物病毒学检测通常使用血清学方法，包括：,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,免疫荧光试验（,IFA,）,免疫酶染色试验（,IEA,）,血球凝集（,HA,）和血球凝集抑制（,HI,）试验,实验动物细菌学检测方法,通常采用细菌分离和培养方法。根据培养基上菌落特征，将分离到的可疑菌落作生化鉴定。,1,）检测人员的实际工作经验，直接影响到其对检测结果的判断准确性。,2,）对部分细菌，如沙门氏菌，支原体等已开展血清学方法检测。,3,）泰泽氏病原体不能在人工培养基上生长，目前还以病变组织压片镜检进行检测，并结合病理学检查结果作出判断。,实验动物寄生虫检测方法,通常在光学显微镜下查找寄生虫的虫体、虫卵或孢子。对人兽共患的弓形虫，则采用各种血清学的方法进行检测。,检测规则,检测频率,拟以间隔,2,3,个月为宜。在实验动物的国家标准中，即规定：每,3,个月至少检测,1,次。,病原体刚侵入实验动物群体时,较易分离到病原体,;,当流行趋于平静，可能分离不到病原体,但特异性抗体的检出率上升。通常在,2,3,个月内，抗体检出率不会下降太大。,随着时间的推移，某些个体的抗体效价水平下降，以及由于流动平后新生的非感染动物增加，使抗体阳性动物的检出大量减少。,取样数量,通常对于动物群体中感染率高的病原体，只需少量采样就能检出；而当感染动物比例低时，若不增加取样数量，就可能漏检。,因此可根据实验动物群体中病原体的感染率决定取样数量。如病原体感染率为,1,，要检出感染动物至少应取样,100,只。,病原体检测必须的取样数量,感染率,%,检测可信度,99,95,90,90,2,2,1,80,3,2,2,70,4,3,2,60,5,4,3,50,7,5,4,40,9,6,5,30,13,9,7,20,21,14,11,10,44,29,22,试验动物不同生产群体取样数量,群体规模，只,取样数量，只,5,100,500,10,500,20,每只隔离器检测,2,只,活体取样,对实验动物的活体取样未作规定。,无特殊要求时，对鸡、兔、犬和猴的活体取样，可在生产繁殖设施内进行。,