临床生化自动化分析仪

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,教学目标和要求,掌握,自动生化分析仪的分析方法类型及其 特点，连续监测法的理论,K,值，必选的分析参数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析仪与手工法比较的优点和缺点。,熟悉,分立式自动生化分析仪的基本结构，备选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和分析仪性能指标。,了解,某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常用分析仪的分析性能。,2,自动生化分析仪,由电脑控制，将生化分析中的取样(,sampling)、,加试剂、混匀、保温反应、检测(,detect)、,结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(,cleaning),等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。,3,自动生化分析技术的应用,提高了临床生化检验质量和速度；,减轻检验人员的劳动强度；,节约样品和试剂；,增加检验项目；,提高检测精密度，减少实验误差；,并且有利于临床检验标准化的实现,。,4,自动生化分析仪按其工作方式不同分为,连续流动式,(,continuousstreaming movementstyle),或管道式：已很少用,离心式,(,centrifugation style),：已很少用,分立式,(,discretestyle)：,应用最广泛,干片式,(,drying style) ：,急诊多用,5,第一节 分立式自动生化分析仪的结构,完全,模仿手工操作,方式设计，各部分结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等 。,6,一、基本结构,（一）样品盘或样品架,样品盘,（,specimen disc）,：放置待测样品的转盘，可放置一定数量的,样品杯（,specimen cup）,或不同规格的,采血试管,，,通过样品盘的转动来控制,不同样品的进样。,7,样品架,（,specimen stock）：,每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为5只或10只）。样品架的移动通过,样品传送带,来进行。样品架 上 的,条形码,（,barcode）,或编,码孔可识别样品,架,号,及样品,位置号,。,8,样品架的优点,随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；,通过样品架的,移动能将样品传,送到另一个,分析,模块,（,analysis,die-block）,甚至,另一台分析仪上,再进行分析。,9,（二）试剂室和试剂瓶,转盘式试剂室,（,reagent chamber）：,内装放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置3045种试剂瓶。,试剂瓶容量一,般为10100,ml。,通过试剂转盘的,转动来选用不同,试剂。,10,试剂架式试剂室,：可放置容量为250,ml500ml,的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条,试剂管路,及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无,交叉污染,。,但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。,11,大型分析仪同时备有,第一试剂室,和,第二试剂室,，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。,对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘,上的任意位置，仪,器能自动识别试剂,的种类、批号和有,效期。试剂室均具,有,冷藏装置,，可将,试剂保存在410。,12,（三）反应杯和反应盘,反应杯,（,reaction cup）,是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光径不同分析仪有0.50.7厘米不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。,13,反应盘,（,reaction disc）：,100只或更多的反应杯围成一圈组成。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘恒速圆周运动经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。,14,（四）取样和加试剂装置,1,取样装置,（,sampling assembly）：,由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量,吸取样品并加入到反,应杯。,不同分析仪的取样,容量有不同的范围，,一般为235,l，,步,进0.1微升不等。,15,取样针设有电子,液面感应器,，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。适用于不同的采血试管上机测定,16,多数加样装置设有,防撞功能,，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有,阻塞报警功能,，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测,。,17,取样针防交叉污染（,crossing,contamination,）,措施,绝大多数采用,水洗方式,（又有瀑布式和涌泉式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；,也有采用,化学惰性液,（,chemical inertiafluid）,膜的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。,18,2加试剂装置,加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为20350,l。,步进15微升不等，取样精度在1微升左右。,注射器方式,：组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示,试剂剩余量,。,灌注式,：具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴，不存在各试剂间的交叉污染。,19,大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的,第一试剂,和,第二试剂,，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。,20,（五）,混匀与,搅拌装置,反应杯里的样品与试剂通过,搅拌棒,搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为,旋转式搅拌,，也有,震动式搅拌,方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。,21,（六）温控和定时系统,温控系统,使反应杯浸浴在恒温环境：,恒温,循环水浴方式,：温度传递速度快，保养要求较高。,恒温,空气浴方式,：温度传递速度不如恒温水浴循环方式，保养简单。,温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度0.1。规定温度可有37和30两种选择，一般固定在37。,22,定时系统,：,不同分析仪对检测吸光度的,间隔时间,有不同的规定，,反应时间,min,内，个别分析仪可以设定为15或22,min,等。,23,（七）光路和检测系统,自动生化分析仪以,紫外可见分光光度法,为其中心和主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由,光源,、,单色器,和,检测器,组成。,24,1光源（,light source,）,一般为,卤素钨丝灯,（,halogentungsten filamentlamp），,也有采用长寿命的,氙灯,（,xe lamp），,要求在340800,nm,波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。,25,2单色器（,monochromato,）,干涉滤光片,（,interference filter）,分光系统：常带有340、380、405、500、550、600、660,nm,等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以,转盘旋转的方式来选择波长,。这种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常用，且不能同一时刻进行多波长检测。,光栅,（,raster）,分光系统：常在340（或293）800,nm,范围内选择1013种固定的单色光。,26,前分光和后分光方式,光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比色溶液的方式为,前分光,。目前以后分光方式为多见，其优点是单色器中没有转动部分，双波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精度和速度。,27,光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数，,后分光方式,选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算。,28,3检测器（,detector,）,由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。,29,（八）数据处理系统,具有多种数据处理功能。,计算测定结果,判断结果准确性,保存各种数据,自我诊断功能,30,（九）清洗系统,反应杯,清洗装置,：一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。,清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，加入,清洗剂,（,detergent）,冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，然后做,杯空白,的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。,31,样品针、试剂针和搅拌棒清洗,一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。,清洗剂可配有1至3种可供选择，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。,32,二、组合式自动分析仪,（一）,组合式自动生化分析仪,将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即,分析模块,进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于,离子选择电极,的电解质分析模块，甚至还可组合建立在,免疫发光,分析原理的免疫分析模块。,33,组合式分析仪,34,（二）实验室自动化系统,（,laboratory automation system,，,LAS,）,包括,样品前处理系统,、,样品输送系统,和,各样品分析系统,。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增加，只需添加需要的新模块，将其安装连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。,35,样品前处理系统,能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。,也可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室的全自动化。,36,第二节 生化自动化分析方法概要,一、分析方法分类,（一）,终点法,（,end assay）,被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法,。,该法称为平衡法更为恰当。从,时间-吸光度曲线,来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。,37,终点时间的确定,根据时间-吸光度曲线来确定，,根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。,38,1,一点终点法,（,one point end assay）,在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。,结果计算公式：待测物浓度,C,U,=（,待测吸光度,A,U,试剂空白吸光度,A,B,）K,K,为校准系数,39,图,4-3,一点终点法反应曲线,A,单试剂一点终点法,B,双试剂一点终点法,40,2,两点终点法,（,two point end assay）,在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。,计算公式为：,C,U,=（,待测吸光度,A,2,待测吸光度,A,1,）K。,41,图,4-4,两点终点法反应曲线,A,单试剂两点终点法,B,双试剂两点终点法,42,该法能有效地消除溶血(,hemolysis)、,黄疸（,icterus）,和脂浊（,lipo-turbid）,等样品本身光吸收造成的干扰。,图4-5 血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线,43,（二）固定时间法,（,fixed-time assay）,指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法 。,计算公式与两点终点法相同，,C,U,=(A,2,-A,1,)K。,44,图,4-6,固定时间法反应曲线,A,单试剂固定时间法,B,双试剂固定时间法,该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。,45,（三）,连续监测法,（,continuous monitoring assay）,又称,速率法,（,rate assay），,是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（,A/min）,计算结果。,46,图,4-7,连续监测法反应曲线,A,单试剂连续监测法,B,双试剂连续监测法,47,酶促反应的线性段,1,及,5,值偏小，而,2,3,4,，,故,A,1,点至,A,4,点属线性段,48,连续监测法的优点,可以确定线性期并计算,A/min，,根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。,酶活性（,U/L）,A/min,理论（或校准）,K,值。,代谢物浓度,C,U,=A/min,校准,K,值。,49,1理论,K,值,多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：,酶活性 (,U/L)=A/min,将此式中 以,K,来表示，即为,理论,K,值,可作为分析参数输入到分析仪中。,50,采用理论,K,值的前提,应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。,51,由于,摩尔吸光系数,受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论,K,值。,52,（1）,NADH,（,NADPH,）,摩尔吸光系数的测定,NADH（NADPH）,没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用,NADH,或,NADPH,标准液来校正仪器，须通过有,NAD,+,(NADP,+,),参与的反应途径。,53,用已糖激酶 (,HK),或葡萄糖脱氢酶(,GD),方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与,NADH,的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。,根据公式,A=bC，,已知比色杯光径,b,和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度,A,后便可计算出,NADH（NADPH）,的摩尔吸光系数,为,A/bC。,54,测定方法,葡萄糖标准液浓度为1,Ommo1/L(0.01mol/L)，L，,酶试剂加入量为335,L，cm，,在340,nm,测得吸光度为0.465，则实测,NADH,摩尔吸光系数,= 6424，即在此台分析仪上,340,nm,波长处测得,NADH（NADPH）,的摩尔吸光系数为6424，,而理论上,NADH（NADPH）,的,为6220。,55,（2）“色素原”酶促产物在405,nm,波长摩尔吸光系数的测定,有许多酶底物为人工合成的“色素原”底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405,nm,波长具有吸收峰。,ALP,底物,磷酸对硝基苯酚 (4-,Nitrophenyl phosphate，4-NPP),经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-,Nitrophenol，4-NP),GGT,底物,-L-,谷氨酰对硝基苯胺,(,-L-Glutamyl-p-nitroanilide),或,-L-,谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(,-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan),经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(,p-Nitroaniline，4-NA),或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-,amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。,56,以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例,试剂：, 4-,NP,标准储存液(1,Ommo1/L), 4-NPmmo1/L，mol/L AMP,缓冲液稀释而成), 底物缓冲液(,l5mmol/L 4-NPPmol/L AMP-HCL,缓冲液中，37,土0.02)。,57,测定,方法,4-,NP,标准液加入量为5,L，,底物缓冲液加入量为350,L，,波长405,nm，cm，,温度37，测定得吸光度为,A,1,；,另用蒸馏水代替4-,NP,标准液，按上述方法测定其吸光度为,A,2,，4-NP,标准液吸光度,A= A,1,- A,2,，,若测得,A,为0.460，则实测4-,NP,摩尔吸光系数18662,58,2,校准,K,值,酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用,校准,K,值,为好，但必须有两个先决条件：必须使用配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有,溯源性,。,59,（四）透射比浊法,抗原与相应的抗体结合形成的,免疫复合物,，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行,透射比浊,（,transmission turbidimetry）,测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做,多点校准,，再经,非线性回归,，求出抗原或抗体的含量。,60,二、常用生化检测项目分析方法举例,1终点法检测,常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。,61,2固定时间法,苦味酸法测定肌酐采用此法,。,62,3连续监测法,对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、,谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。,63,4透射比浊法,透射比浊法,可用于测定产生浊度反应的项目，多数属,免疫比浊法,，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“,O”、,类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。,64,第三节 分析参数设置,各种测定项目的,分析参数,（,analysisparamete）,大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。,65,一、分析参数介绍,（一）,必选分析参数,1,试验名称,（,test code）,2,方法类型,（也称反应模式）(,assay mode),3,反应温度,4,主波长,（,primary wavelength）,5,次波长,（,secondary wavelength）,6.,反应方向,（,response direction）,66,7,样品量,（,sampling volum）,常量、减量和增量。,8,第一试剂量,（,first reagent volum）,一般20-300,l,9,第二试剂量,（,second reagent volum）,同上。,10,总反应容量,（,total reacting volum）,一般180-350,l，,个别仪器能减少至120,l。,11,孵育时间,（,incubate time）,12,延迟时间,（,delay time）,67,13,连续监测时间,（,continuous monitoring time）,一般为60120,s，,不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）,14,校准液,（,calibrator）,个数及浓度,15,校准,K,值,（,calibrate coefficient）,或理,论,K,值,16,线性范围,（,linearity range）,17,小数点位数,（,decimal point digit）,68,（二）备选分析参数,这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。,69,1,样品预稀释,设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。,2,底物耗尽值,（,substrate exhaust limit）,在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确,。,70,3,前区检查,免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（,A）,设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。,4,试剂空白吸光度范围,超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。,71,5,试剂空白速率,连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。,6,方法学补偿系数,用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。,7,参考值范围,对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示,。,72,（三）某些参数的特殊意义,1,最小样品量,一般分析仪的最小样品量是2,l，l,的。,2,最大试剂量,对方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，很重要。,73,3弹性速率,（,flexrate）,在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如,AST,可从1000,U/L,扩展至2000,U/L，,从而减少稀释及重测次数、降低成本。,74,4标本空白速率,以胆红素干扰碱性苦味酸法测定肌酐为例,：样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505,nm,有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。,75,设置空白速率以消除胆红素干扰,若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图4-8。,76,空白速率法消除胆红素对肌酐测定的干扰,图,4-8,77,二、单波长和双波长方式,（一）概念,采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为,单波长方式,。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。,使用一个主波长和一个次波长的称,双波长方式,。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。,78,（二）双波长的作用,消除噪音干扰;,减少杂散光影响;,减少样品本身光吸收的干扰：当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长方式可以部分消除这类光吸收干扰。,79,（三）次波长的确定方法,当被测物的主波长确定之后，根据干扰物吸收光谱特征选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。,一般来说，次波长应大于主波长100,nm。,以主波长与次波长吸光度差来计算结果。,80,三、单试剂和双试剂方式,反应过程中只加一次试剂称,单试剂方式,，加两次试剂便为,双试剂方式,。,双试剂方式分析的优点是：,可提高试剂的保存稳定性；,能设置两点终点法；,在某些项目检测时能消除非特异性化学反应,干扰。,81,双试剂方式消除非特异性化学反应干扰举例,血清,ALT,测定时，血清中原有酮酸也可与试剂,LDH,起反应，使结果偏高。若先加入缺乏,-,酮戊二酸的第一试剂，使原有酮酸与,LDH,反应，之后加入含有,-,酮戊二酸的第二试剂，启动,ALT,酶促反应生成丙酮酸，这些丙酮酸与,LDH,反应消耗的,NAD,能真正反映,ALT,活性，从而消除以上副反应的影响。,82,四、测定过程的自动监测,1试剂空白监测 ：,每瓶试剂在使用前先自动检测试剂空白吸光度；,每个样品测定前均检测试剂空白吸光度。为某些先加试剂后取样品的分析仪所采用。,83,2试剂空白变化速率监测,设置此项监测后，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。,在以监测,NAD（P）H,减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率速率可监测并消除由,NADH,自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。,84,3样品信息监测,由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600,nm570nm、700nm/660nm,和505,nm/480nm,吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。,85,4结果可靠性监测,（1）终点监测,（2）线性期监测,将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；,取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。,86,5底物消耗的监测,在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要,。,87,底物消耗监测,图,4-9,88,6方法线性范围监测,每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。,89,四、分析参数设置举例,以肌酸激酶测定为例。,1. 肌酸激酶试剂盒通用参数,样品量50,l，,第一试剂1000,l，37,保温5,min，,加第二试剂500,l，,延时2,min,在340,nm,读第一点吸光度，连续监测2,min。,90,样品量235,l，,第一试剂量20270,l，,第二试剂量20270,l，,总反应容量180350，吸光度监测周期18,s，,总反应时间10,min，min，4.5min，9.5min。,91,3. 参数设置如下,（1）按比例减少样品量和各试剂量，使反应液总容量在分析仪180350,l,范围内。选择样品量为10,l，,第一试剂200,l，,第二试剂100,l，,这时反应液总容量是310,l。,或者选择样品量为8,l，,第一试剂160,l，,第二试剂80,l，,这时反应液总容量是248,l。,92,min,为第二试剂加入点。,min，,换算成监测时间为第16，17点之间，加上2,min,延时，则在第24监测点为第一点吸光度，并连续选择24-31监测点。,93,（,4）计算,K,值：根据样品量10,l，,第一试剂200,l，,第二试剂100,l，,代入计算公式,则,K = = = 4984,也可以采用肌酸激酶的校准品，执行校准程序来得到校准,K,值。,94,4对新设置的反应参数进行试运行,在开始运行时，分析仪会对各反应参数之间的逻辑合法性进行检测，如果反应参数中出现逻辑性错误，则分析仪会显示错误信息并停机，这时可以根据提示信息对反应参数进行修改。,95,第四节自动生化分析仪 工作过程和操作方法,一、工作过程,在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（,procedure）,进行工作。,96,1,取样加试剂和混匀,样品盘转动使样品进入待测位置,样品针定量吸取样品加入一反应杯,反应盘旋转,试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置,试剂针定量吸取试剂加入反应杯,搅拌机构将反应杯内液体进行搅拌混匀,97,2保温反应和吸光度检测,反应盘旋转,反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应,当该反应杯通过检测窗口时被检测得到一个吸光度值,按规定的间隔时间检测吸光度值直至总反应结束,总反应时间一般为10,min，,如果18,s,为检测吸光度的间隔时间（,interval time），,则10,min,得到34个吸光度值，若15,s,为间隔时间，则得到40个吸光度值。,98,3计算并显示或打印结果,分析仪根据各测光点读数对某一检测项目进行结果计算，并显示或打印出每个项目的报告，也可按标本显示或打印出全部项目的累积。即待某样品指定的项目测试完毕，便显示或打印检测结果。,99,二、操作方法,（一）操作前的各项检查,（1）正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。,（2）确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。,（3）进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。,100,（二）校准,分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行,校准,（也称定标），得出一个该项目的,校准系数（,K）,。,校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（,K=,校准品浓度/校准品吸光度）。,101,1校准方式,有单点校准、两点校准和多点校准,单点校准,：校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，,两点校准,：若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；,多点校准,：当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等。,102,2对校准的要求,（1）选择合适（配套）的校准品,（2）如有可能校准品应溯源到参考方法或,参考物质。,（3）确定校准的频度。,103,（4）如有下列情况发生时，必须进行校准：,改变试剂的种类或批号；,仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护,或者更换了重要部件；,质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了,实验室规定的接受限。,104,（三）质控品测定,质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于,分析仪的批测定,，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。,105,所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序：,设定有关,质控参数,，如每个质控品的批号、靶值和标准差；,选择质控图的方式，如均值标准差质控图；,质控结果的统计分析，,分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表及质控图的形式在屏幕上显示。,106,可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为,失控,则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。,通过对质控结果的分析，可以了解某项目的分析精密度和准确度的改变。,107,（四）检测项目的输入与测定,1项目输入,（1）逐项输入,：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。,108,（2）项目组合输入,：把与疾病相关的检验项目,组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。,（3）批量输入,：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。,109,多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还可选择：,是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定；,测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。,2进行测定,110,3急诊检验,几乎所有全自动生化分析仪都具备“,急诊优先,”的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或,专用样品架,以或急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。,111,（五）样品的减量与预稀释方式,样品的预稀释方式,是指在分析过程中仪器首先对样品做自动稀释，然后进行测定。,操作过程,:,a.,样品针吸取一定量样品，加入反应杯，,b.,试剂针把稀释液加入已取样品的反应杯，并搅拌混匀，,c.,由取样针在已稀释的反应杯里吸取已稀释的样品，加至另一个反应杯进行分析测定。,样品预稀释的优点,：稀释过程自动化，能使用到高达100倍或更高的稀释比例。,缺点,：需占用3个取样周期(,sampling cycle)。,112,（六）分析仪的维护,分析仪的常规维护(,maintenanc),是保证分析仪能够正常运行的重要手段。分析仪要严格根据操作手册的要求进行维护。,每天维护,每周维护,不定期维护,113,（七）分析仪数据连网,分析仪的数据连网是指分析仪与实验室电脑网络系统之间分析数据的互传与共享。连网的实现是通过分析仪的数据接口以及接口软件来完成。通过连网，能使来自分析仪的结果数据在网络软件的强大功能下得到进一步的处理，如报告单的格式（形式）更加为医生与患者所接受；患者的信息与对应的检验结果能长期保存；结果的分析与管理更为完善。,114,三、自动化分析与手工操作的比较,（一）,优点,1. 检测速度快,2. 检测灵敏度高,3. 检测准确度高,4. 检测精密度高,5. 样品和试剂用量减少,6. 其他 :能精确地控制反应时间 ;能精确,地控制反应温度 ;能进行复杂的结果计算。,115,（二）缺点,1. 选择次波长较困难,2. 操作时间受限,3. 操作复杂性受限 :加试剂的次数受限制;无法做复杂的操作;选择和改变反应温度困难,4. 样品量/试剂量的比例受限制,5. 不适宜做参考方法,6. 仪器维护和保养较复杂,116,第五节,干片式生化分析仪简介,一、仪器结构,（一）,干片试剂,干片试剂的结构从上到下一般分为,展开层、试剂层、显色层,和,支持层,，见图4-10。,（二）,检测仪器,也有半自动和全自动之分,117,干化学的原理（1）试剂结构,Sample,散布层,试剂层,显色层,支持层,118,二、分析原理,（一）分析过程,1,展开层,待测样品定量加到干片试剂，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。展开层还能为反射光检测提供一个具有反射的背景。,2,试剂层,样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。,119,3,显色层,化学反应的产物在显色层与显色试剂起呈色反应。,支持层,为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。,4,吸光度检测,整个过程经过一个规定的时间，由反射光度计进行检测分析。光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层，一部分光线被吸收，另一部分光线则反射到接收器被检测。待测物浓度越高，光线被吸收越多，检测到的反射光越弱，因而待测物浓度与吸光度成正比。（图4-10）,120,干化学的原理（2）,反应过程演示,121,干化学的原理（3）比色,展开层,试剂层,显色层,支持层,接收器,122,（二）分析方法原理,以,血氨测定,为例，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝（,Bromphenol Blue）,其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反应产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605,nm,进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10,l，,反应时间5,min，,波长605,nm。,123,第六节 自动生化分析仪性能评价,全自动分析仪,将取样至出结果的全过程都自动完成。操作者只要把样品放在分析仪一定的位置上，输入要测定的项目代号，仪器就会根据分析程序自动地进行操作，并打印出测定结果。举例来说，一台分析速度为1600测试/,h,的分析仪，工作4小时所完成的工作量，如果用手工操作，一般需要10到15个人工作1天。另外由于全自动化操作，并且分析仪设有完善的测定过程监测功能，因此人为主观误差因素很小，检测精密度大大提高。,124,半自动分析仪,根据其工作原理叫自动比色仪可能更恰当，其共用流动式比色杯，反应液之间互染率大。其优点是结构简单，价格便宜。缺点有： 交叉污染较重，反应液间相互影响不可避免。每个项目检测后均需冲洗才能进行下一个项目测定，速度慢。分析过程中的某些步骤需手工完成（如加试剂、取样、混合、保温等）。这类仪器体积小，结构简单，价格低，分析仪的测定过程监测功能较为简单，也存在一定的主观误差。目前更多地用于小型实验室或研究性实验或教学中。,125,一、分析速度,1,通道(,channel),数量,通道数主要与分析仪所能容纳的试剂瓶数量有关，因为试剂瓶数量决定分析仪同时能测定的项目数。半自动分析仪属单通道分析仪，一次只能分析一个项目，要等一个样品或一批样品相同的项目测定完毕后才能分析另一个项目，因此分析效率很低。多通道分析仪可同时任选多种测定项目检测，因此分析效率高。,126,每加一次样品或试剂的时间为一个取样周期。取样周期决定了分析仪的工作速度。对于单针取样的分析仪，如取样周期为10,s，,理论上每60,min,可取样360次，则其工作速度为360测试/,h；s，,则理论工作速度为800测试/,h，,依此类推。,2,取样周期,127,只有一组加试剂装置的分析仪在做双试剂法测定时，加第二试剂也要占用一个取样周期，使工作速度减半；如果有两组加试剂装置，因在另一试剂吸取位置添加第二试剂，所以工作速度不变。,128,一次同时能容纳的样品量也即批处理样品量，分析仪对每批样品进行测定的前后均有一个启动过程和停止过程，这两个过程各需要数分钟到十数分钟不等。因此，若批处理样品量大，则分析速度快。,3,一次能容纳的样品数量,129,试剂瓶容量小，对检测频率高的项目（如葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶等），可能会出现在某批样品测定中试剂不够的情况，此时需中断测定添加试剂，而使检测效率下降。正因为如此，对这类高频率出现的检测项目，有时设置两个试剂瓶位置。,4,试剂瓶容量,130,5,合适的项目组合,具双圈反应盘（一般有2402个反应杯）的分析仪有两套光电检测器，能同时对内外圈的反应杯进行吸光度检测。这种系统具有两支取样针，1个样品被两支取样针同时吸取两份样品，分别加于内外圈反应杯，其加试剂装置可同时在两个反应杯中加两种不同的试剂。,131,s，,理论上每小时可得到1600个测试。如果系统具有4支取样针，1个样品被4支样品针同时吸取4份样品，放到双圈反应盘的内外4个反应杯中，然后同时加4种不同的试剂。这时如果取样周期为6,s，,则理论上每小时可得到2400个测试。,132,在双圈反应杯、2支取样针或4支取样针系统，一次能同时对一个样品的2个或4个检测项目吸取样品，,这2个或4个检测项目便需组合在一起测定,。也就是说，如果一个样品同时需要检测该2个或4个项目，则能使分析仪发挥最大的分析效率；若某一样品只需要检测该组合项目中的1项或1-3项，则该分析仪的分析效率便不能最大程度地发挥。,133,6,组合式自动生化分析仪,其分析速度为各分析模块分析速度的加和。如两台每小时分别为2400、800个测试的分析模块，可组合成理论上最大分析速度为每小时3200个测试的分析仪；两台同样为每小时1600个测试的分析模块，也能组合成理论上分析速度为每小时3200个测试的分析仪。,134,二、分析仪性能指标,（一）准确度,吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。,135,（二）精密度,以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、搅拌棒、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。,136,（三）检测能力,1,检测方法,多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。,2,检测时间,分析仪通常可检测最长10,min,的反应，个别最长能检测15-22,min,甚至更长。,3.,加试剂次数,能加1-4种试剂，多数为2种。,137,4.,检测范围,能检测吸光度的最高值及其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。,138,（四,）,速度,影响分析速度的因素，包括本节一中所述的试剂瓶数、取样周期、反应杯数量、一次可容纳样品数量、试剂瓶容量和模块组合能力等。,（五）检测成本,反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量，以及保养维护消耗。,139,