禽病学实验指导

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,2,实验一 新城疫血凝与血凝抑制试验,目的意义：,掌握血凝试验（,HA,）与血凝抑制试验（,HAI,）,的基本方法；,体会,HA,与,HAI,在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。,基本原理：,许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。,3,器材及试剂,:,待检病毒,:,鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；,待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；,生理盐水、,1%,鸡红细胞、,96,孔,V,形微量血凝板、加样器等。,4,（一）血凝试验（,HA,）：,取,96,孔板，按以下步,骤操作：,1,、第一排,1-12,孔各加生理盐水,50ul,，第二排,1-12,孔加生理盐水,50ul,为红细胞对照；,2,、吸,50ul,病毒液于第一排第,1,孔，混匀后取,50ul,至第,2,孔，依次稀释至第,12,孔，弃去,50ul,，各,孔经倍比稀释后稀释度依次为,2,-1,2,-12,。,实验步骤,5,3,、第一排,1-12,孔及第二排,1-12,孔各加,1%,鸡红细,胞,50ul,，微型震荡器震荡,2min,混匀。,4,、室温静置,10-30,分，观察结果。,5,、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即,HI,效价，用,2,n,表示。,6,血凝试验流程图,7,（二）血凝抑制试验（,HAI,）,：取一,96,孔板，按以下步骤操作：,1,、,4,个单位抗原的制备：按,HA,试验测出的病毒血凝价除以,4,即为,4,个单位血凝素的稀释度。,2,、待检血清的稀释：第一、二、三排,1-12,孔各加生理盐水,50ul,，于第一排第,1,孔中加入,50ul,待检血清，反复吹吸,3-5,次混匀后，取,50ul,至第,2,孔混匀，吸取,50ul,至第,3,孔,，依次稀释至第,12,孔，弃去,50ul,，经倍比稀释，血清的稀释倍数为,2,1,2,12,。,8,3,、第一、二排,1-12,孔各加,4,个单位血凝素,50ul,，微量震荡器震荡,2min,混匀；,4,、室温静置,20min,；,5,、第一、二、三排,1-12,孔各加,1%,鸡红细胞,50ul,，微量震荡器震荡,2min,混匀混匀。,6,、室温静置,10-30,分，观察结果；,9,7,、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三排为红细胞对照，红细胞应全部沉降。以待检血清能完全抑制病毒凝集红细胞的最高稀释倍数为血清的,HAI,效价，用,2,n,表示。,10,血凝抑制试验流程,11,实验二 病毒的鸡胚培养,目的意义：,了解禽源病毒鸡胚培养的意义及用途,掌握病毒鸡胚培养的基本方法,基本原理：,鸡胚培养是培养某些病毒常用方法,此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。病毒接种鸡胚的途径有多种，主要有卵黄囊接种、绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、羊膜腔接种途径等，应根据需要选择适当的途径。,12,卵黄囊,胚体,羊膜囊,绒毛尿囊腔,气室,鸡胚结构模式图,13,器材及试剂,:,病毒：鸡新城疫病毒弱毒疫苗；,鸡胚：,9-11,日龄白壳受精卵；,孵卵箱、检卵灯、钢针、注射器、,2.5%,碘酒、,75%,乙醇、固体石蜡、眼科剪、眼科镊等。,14,实验步骤,:,1 .,准备鸡胚：接种前用检卵灯观察是否为受精卵,及其活力。,2,接种（绒毛尿囊腔途经）：,（,1,）在检卵灯下，用铅笔勾出气室及胚胎的,位置，并在尿囊膜血管较少的地方作记号。,（,2,）消毒：用碘酒消毒气室蛋壳，酒精脱碘，,用灭菌钢针在记号处打一孔。,15,（,3,）接种病毒：用,18mm,针头的,1ml,注射器吸,取鸡新城疫病毒，针头通过打出的孔进针，刺入尿囊腔，注入,0.1ml,。,（,4,）用融化的石蜡封闭小孔，,39,孵化器中,孵化,72h,。,16,3,收获：,接种后每,4,小时照蛋一次，弃去,24h,内死亡胚。,（,1,）鸡胚放入普通冰箱内冷藏,12h,，使胎血凝固。,（,2,）分别用碘酒和酒精消毒卵壳，用灭菌剪刀除去气室卵壳及壳膜，撕开下面的尿囊膜。,（,3,）将鸡胚稍倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液待检。,（,4,）观察鸡胚的发育及是否有无病变。,17,实验三 鸡白痢平板凝集试验,目的意义：,了解平板凝集试验在鸡白痢诊断及监测中的应用,学习鸡白痢平板凝集试验的操作方法。,基本原理：,细菌等颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。直接凝集反应可分为玻片凝集与试管凝集。凝集试验是疾病诊断及体内抗体水平测定的常用方法。,18,19,器材及试剂,:,抗原,和血清：,鸡白痢凝集抗原、鸡白痢标准阳性血清、阴,血清、待检血清,生理盐水、玻片、加液枪（,20-200ul,）、接种环等。,实验步骤,:,1.,取一洁净玻片，用蜡笔划成方可格，编号,2.,各方格分别加被检血清,0.08,、,0.04,、,0.02,、,0.01ml,。,3.,将凝集抗原摇匀，重直滴一滴于各格血清上。,4.,用火柴棒混匀，摊开直径,1cm,左右。,20,5.,静置,3-4,分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记反应结果：,+,：出现大片凝集，液体完全透明，即,100%,凝集,+,：有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即,75%,凝集,+,：有可见的凝集片和颗粒，液体不甚透明，即,50%,凝集,+,：仅仅可以看见颗粒，液体混浊，即,25%,凝集,-,：液体均匀混浊，无凝集现象,（同时应设阳性、阴性血清及抗原对照）,6.,结果判定：,21,实验四 鸡传染性法氏囊病琼脂扩散试验,目的意义：,掌握琼脂免疫扩散试验的操作技术,体会其在鸡传染性法氏囊病诊断及监测中的意义,基本原理：,鸡传染性法氏囊病病毒抗原与相应抗体在适当电解质存在下结合，在半固体琼脂中扩散,经过一定时间形成肉眼可见的沉淀物，据此判断是否存在相应的抗原或抗体，作为诊断鸡传染性法氏囊病的依据之一。,22,器材及试剂,:,生理盐水、琼脂糖、硫柳汞、平皿、打孔器、移液器、吸头 等。,实验步骤,:,1,、制板,:,加融化的,1%,琼脂于洁净玻片或培养皿内，厚,2.5-3.0mm,。,2,、打孔：待琼脂凝固后打孔，多为梅花形，一般孔径,3-4mm,，孔距,4-5mm,。,3,、加样：于中央孔加入标准沉淀抗原，周围,1,、,4,孔内加阳性血清对照，,2,、,3,、,5,、,6,孔为待检血清。,23,4,、加样完后，将琼脂板置于湿盒中，,37,扩散,24-48h,。,5,、结果判定：若待检血清与抗原孔之间出现白色沉淀线，则表示阳性，若不出现沉淀线，为阴性。,若用于检测血清效价，则以出现沉淀线的血清最高稀释倍数表示（,2,n,）。,用于两种抗原比较时，沉淀线有多种情形，应具体分析。,24,25,制板,打孔,封底,加样,置湿盒中,扩散,琼脂扩散试验流程图,26,实验五 禽霍乱的诊断,目的意义：,认识禽霍乱病原巴氏杆菌两极染色的特性,熟悉禽霍乱的诊断方法和步骤,认识病原菌分离鉴定在禽病诊断中的作用,基本原理：,禽巴氏杆菌病又称为禽霍乱，主要表现为败血症，即实质器官的出血、肿大与坏死。巴氏杆菌在病禽组织内呈典型的两极着色，纯培养物呈卵圆形或短杆状；在血或血清琼脂上生长良好，呈露珠样小菌落并有不同颜色的荧光；能发酵多种糖；多杀性巴氏杆菌能致死小白鼠、家兔等。故常依据形态特征、培养特性、生化特性和动物实验等来鉴定。,27,器材及试剂,:,病料：患病鸭组织（肝、脾、肺）或体液,（血、胸腹腔渗出液）；,培养基：,5-10%,兔血琼脂平板；,动物：小白鼠或成年健康家兔；,无菌生理盐水、吸管、注射器、针头、酒精,灯等。,28,实验步骤,:,（一）形态学检查：病料或心血涂片，瑞氏染色。,（二）培养特性检查：将病料接种于血琼脂平板,37,培养,24h,。,（三）生化鉴定：,29,鸭 霍 乱 心 血 涂 片中的多杀性巴氏杆菌,30,（四）动物回归实验：将病料剪碎并研磨，用灭菌生理盐水制成,1:10,悬液，也可将血琼脂平板培养物制成悬液，皮下注射小白鼠，,0.1-0.3ml/,只。注意观察小鼠的表现，待发病死亡后，即行解剖，观察小鼠病变，用肝、脾触片或心血涂片，瑞氏染色镜检，,应有两极浓染的球杆菌,。同时上述病料接种血琼脂平板，次日观察细菌生长情况和菌落特征。,31,临床症状,病理变化,触片染色镜检,培养特性,生化特性,血清学试验,初步诊断,动物回归试验,确诊,流行病学调查,32,