分子诊断技术在结核病诊治中应用

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子诊断技术在结核病诊治中应用,全球结核病流行状况,WHO report,，,2013,全球结核病流行状况,全球结核感染人数,2004,年后处于下降趋势,HIV,患者并发结核病数量处于平稳阶段,中国结核感染人数全球排名第二,WHO report,，,2013,全球结核病流行状况,WHO report,，,2013,全球结核病流行状况,全球结核死亡人数处于下降趋势,斯威士兰结核病感染率最高,WHO report,，,2013,全球结核病流行状况,Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously treated cases have MDR-TB,There were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012,On average, an estimated 9.6% of MDR-TB cases have XDR-TB,WHO report,，,2013,全球结核病流行状况,2012,年全球新发结核病例为,860,万人，中国占总数的,12%,在,860,万新病例中约,110,万人（,13%,）为,HIV,阳性，这些病例的,75%,在非洲,每年约有,130,万人死于结核病，我国为,25,万,结核病每,24,秒钟就杀死,1,人,预计未来,20,年还将有,3600,万人死于结核病。,全球每年有,45,万新发,MDR-TB,，大约,万为,XDR-TB,流 行现 状,感染人数多,死亡人数多,耐药患者多,潜伏感染多,“4,多,”,WHO report,，,2013,结核病诊治中存在的问题,预防问题,诊断问题,治疗问题,医疗问题,检验人员最关心的问题,根据不同分子水平及技术特点来选择诊断检测体系,细菌载,体疫苗,DNA,疫苗,灵敏度,特异性,标本类型,目的用途,费用,实验平台,检测时间,方法选择,方法选择的影响因素,Sputum,涂片,MTB,培养,孵育,4-8,周,（阳性）,药敏试验,观察,孵,育,4,周观察生长情况,涂片,（阳性）,分子诊断技术,液体培养及药敏试验,平均时间,2-3,个月,平均时间,20,天,只需,2,小时,-2,天,涂阳,=60-98%,有结核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定,IGRAs,、,TST,等,RNA,水平,DNA,水平,蛋白质水平,恒温扩增 变温扩增,鉴定,鉴定,+,耐药,结核病分子诊断,扩增 杂交,LAMP,、,SDA,芯片、,RT-PCR,SAT,、,TMA,FISH,、,Probe,分子诊断适宜技术的选择,与,QFT-GI,为,IGRAs,实验,潜伏性结核（,LTBI,）,结核菌素试验（,TST,）,QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI),蛋白质水平,全血,IFN-,释放分析技术,(IGRA),结核感染者体内存在特异的效应,T,淋巴细胞，效应,T,淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（,IFN-,）。因此，检测效应,T,淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。,由于效应,T,细胞,存活时间很短,，而且,具有特异性,，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。,基于,IGRA,原理的产品目前已被,美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本,等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中,-,干扰素释放实验,酶联免疫斑点技术,培养滤液蛋白,10,（,CFP 10,）,早期抗原靶,6,（,ESAT-6,）,一、,T-SPOT,技术基础,T-SPOT,由结核杆菌基因组,RD1,区相同的操纵子编码的蛋白,所有的卡介苗（,BCG,）均丢失该基因序列,绝大多数的环境分枝杆菌也不存在,RD1,区,结核杆菌特异抗原,ESAT-6,与,CFP 10,抗原,Plama,PBMCs,Gel Barrier,Erythrocytes,检测过程,分离,PBMCs,加入,PBMCs,与结核特异抗原,37,孵育,16-20,小时,PBMCs,特异抗原,-,干扰素抗体,加入标记二抗，孵育,1,小时,加入显色液，终止反应,观察结果：,1,个斑点,=1,个效应,T,细胞,结果判断图,阴性结果,阳性结果,空白对照,抗原,A,ESAT-6,抗原,B,CFP10,阳性对照,（,PHA,）,潜伏性结核（,LTBI,）诊断技术比较,IGRAs,与,TST,相比，具有更高的灵敏度和特异性,IGRAs,与,BCG, NTM,无交叉反应，,TST,有交叉反应,难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者,小于,5,岁儿童、免疫力低下患者不适合采用,IGRAs,检测,试剂成本非常高,costs,（费用）,availability for clinicians and other health workers,（医疗水平）,patient acceptability,（患者是否接受）,ease of distribution and storage,（实验平台）,核酸扩增技术,核酸扩增技术,反应条件,扩增产物,检测方法,代表公司,RT-PCR,热循环,DNA,实时,Roche,RT-LAMP,恒温,DNA,Eiken,GenoType MTBDRplus,热循环,DNA,Hain Lifescience,CPA,恒温,DNA,优思达,NASBA,恒温,RNA,bioMerieux,TMA,恒温,RNA,终点,Gen-Probe,SAT,恒温,RNA,实时,仁度,SAT,：,Simultaneous Amplification and Testing (RNA,仁度,),CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,优思达,),LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan),TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen-Probe),GenoType MTBDRplus,：,(Hain Lifescience),NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (RNA,OT),RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging),HDA：Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB),RNA,拷贝数,DNA,拷贝数,生命力旺盛的病原体,RNA,转录活跃,较好的愈后指标,交叉污染少,TMA,、,SAT,优点,RNA,作为临床分子诊断靶标,二、,SAT,技术,同一温度下（,42,），以,RNA,为起始模板,，通过,M-MLV,反转录酶产生一个双链,DNA,拷贝,，然后利用,T7 RNA,多聚酶,从,DNA,拷贝上产生多个（,100,1000,个）,RNA,拷贝；每一个,RNA,拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的,探针,和这些,RNA,拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况,RNA(+),Forward Primer,RT,RNase H activity,Reverse Primer,RT,T7,100-1000 copies,Molecular Beacon,Reverse Primer,Forward Primer,RT/RNase H activity,RNA(+),DNA(-),DNA(-),DNA(-),DNA(-),DNA(+),RNA(-),RNA(-),RNA(-),DNA(+),DNA(+),TB-SAT,操作步骤,阳性结果,阴性结果,恒温扩增,-42C,RNA,检测,-,起始靶标与扩增产物都是,RNA,扩增产物的污染更少,-RNA,环境中易降解,更高的扩增效率,-30,分钟内扩增,10,亿倍,反应稳定,-,抑制物少,高灵敏度、特异性,活菌检测,操作简单、快速,MTBDRsl-,鉴定,XDR,MTBDRplus-,鉴定,MDR,MTBC-,鉴定,MTB,复合群,MTBCM-,鉴定,MTB,和,NTM,分类,Gene-Probe(TMA/Hain),技术,三、,MTBC-,鉴定,MTB,复合群,(TMA,技术,),方法名称：,HPV,（,Hybridization Protection Assay,）,-,杂交保护分析法为,Gen-probe,公司专利,原理：,以,rRNA,为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群,检测设备：,LEADER 50i,HPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct):,2.5h,报告，直接从标本中检测结核菌,HPA-Accuprobe:,1h,报告，用菌落或自动培养系统的菌,样本,细胞溶解,目标,r-RNA,释放,MTD,技术路线,杂交体,rRNA,AE,AE,AE,AE,AE,AE,AE,AE,60C,15,分钟,加入探针,探针,杂交,AE,AE,AE,选择性试剂,60C,化学发光读数仪,荧光检测,MTD,技术特点,MTD,结核分枝杆菌检测技术特点,采用分子技术快速鉴定（,小时,）结核分枝杆菌复合群,标本可以是,涂片阴性或者阳性,的痰标本；也可以是培养物,唯一获得,FDA,推荐,的凃阴样本快速检测技术,检测,RNA,，,RNA,只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）,采用,TMA,恒温扩增,，不使用,PCR,仪器，无需专业的,PCR,实验室认证,HPA,杂交保护分析技术：,灵敏、特异,严格的,实验室防污染技术,：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染,MTD,结核分枝杆菌的直接检测意义,TB,与其他分枝杆菌区分,AIDS,患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染,龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）,提高,TB,检出率,CSF,、胸腹水等,疑似患者,长期低热、,ESR,持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、痰,TB,菌,MTD,检测,DNA,作为临床分子诊断靶标,四、,MTBDRplus-,鉴定,MDR,方法名称：,耐多药结核病,(MDR-TB),快速诊断为,Hain Lifescience,公司,专利,原理：,采用,线性探针技术,（,Line-Probe,或称,DNA-Strip,）检测结核分枝杆菌复合群,利福平,(rpoB),和异烟肼,(katG,和,inhA),等结核治疗药物的,耐药基因,来判断,TB,体内耐药性,MTBDRplus:,6h,报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果,抗结核药物,靶基因,编码的产物,靶区域和突变率,最常见突变位点,耐药水平,RFP,rpoB,RNA,聚合酶,亚单位,RRDR,81,bp,，,95,Codon531,，,30-75,高,INH,katG,过氧化氢酶,-,过氧化物酶,整个基因，,60-95,S315T,，,60-95,高,INH,inhA,烯酰基还原酶,调节区，,25,inhA-15,低,INH,ahpC-Promoter,过氧化物酶,启动区，,12%,低,PZA,pncA,吡嗪酰胺酶,整个基因，,68-97,无特定位点,高,EMB,embB,阿拉伯糖基转移酶,ERDR,少数密码子，,47-94,Codon306,，,47-89,高,SM,rpsL,核糖体蛋白,S12,Codons,43,和,88,，,40-95,K43R,，,40-90,高,SM,rrs,16S,rRNA,多个碱基，,29%,513,位、,905,位碱基，,各占,10.3%,低,喹诺酮类,gyrA,gyrB,DNA,旋转酶,67106,位,75-94%,Codon90,94,高,结核耐药,的分子,机制,MTBDRplus,技术路线,DNA,提取,PCR,扩增,探针杂交,结果判读,结果解释,野生型：有杂交带显色为“,+”,，表示未发生突变,耐药突变位点：有杂交带显色为“,+”,，表示发生突变,敏感：所有野生型探针“,+”,和所有耐药位点探针“,-”,耐药：对应药物有,1,条野生型探针“,-”,或有,1,条耐药位点“,+”,优势,快速检测,RFP,和,INH,的耐药,时间短、操作简单、安全高,特异性和灵敏度较高、重复性好,主观因素影响小、更为可靠,不足,不能检测所有药物的耐药基因型,缺少,ahpC-oxyR,间隔序列范围,不能取代传统细菌学检测、只能作为参考,技术特点,MTBDRplus,技术,方法,结果,比例法药敏结果,耐药,敏感,灵敏度（,%,）,特异度（,%,）,符合率（,%,）,MTBDRplus,RFP,耐药,48,0,98.0,100.0,98.5,敏感,1,16,RFP,（涂阳）,耐药,39,12,95.1,92.1,92.7,敏感,2,140,INH,耐药,45,0,86.5,100.0,89.7,敏感,7,16,INH,（涂阳）,耐药,63,0,98.4,100.0,99.5,敏感,1,129,MTBDRplus,技术性能参数,J Clin Microbiol.,2010 Aug;45(8):2635-40. Epub 2007 May 30,MTBDRplus,技术性能参数,中国人群存在一定数量的,KatG S315N,突变,WHO,、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在,6,小时,内给出药敏鉴定结果,可以做,一线结核药物,（异烟肼 利福平）、,二线结核药物,的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）,标本可是涂片阳性的,痰标本,，或是,培养物,技术步骤简单,：核酸提取、,PCR,扩增、核酸杂交仪检测,每个试剂条上自带质控：,CC,杂交质控、,AC,扩增质控、,TUB,结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的,可信度,HAIN-,结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点,五、交叉引物恒温扩增技术,(Cross Priming Amplification, CPA),本试剂盒将病原体,DNA,扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入,两对,TB,特异性引物、一对特异性探针,，同时一次性完成,TB DNA,的扩增及杂交过程，然后用,3,号一次性,核酸检测装置,对,TB,感染进行定性诊断，其检测,灵敏度为,10,个病原体，高特异引物,设计确保了结果的可靠性。由于待测样本的扩增（,PCR,管盖和石蜡油双重保护）和检测过程均在,物理封闭条件,下完成，所以本试剂盒具有防止实验室扩增物,交叉污染,，防止假阳性的效果,杭州优思达公司,CPA,技术原理图,A:,引入交叉引物位点,B:,交叉引物扩增,C:,检测产物,CPA,技术路线图,核酸提取,痰液,石蜡油,反应液,试剂配制,63 2,恒温扩增,金属浴,防污染检测装置,取出反应管,15-30,分钟,读取结果,有色颗粒,抗,A,抗体,双重标记的,特异性扩增物,阳性,抗抗体,有色颗粒,抗,A,抗体,停留，显色,试纸条检测结果判读原理图,抗体包被的颗粒,有色颗粒,抗,A,抗体,阴性,无特异性扩增物,抗抗体,有色颗粒,抗,A,抗体,无抗抗原,有色颗粒流出,停留，但无色,结果的判读,阳性：,试纸条出现,两条红色条带,，一条位于质控区（,C,线），一条位于检测 区（,T,线）且其强度,L4,（与附带的色卡比较）。表明样本中含有结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限,阴性,：,试纸条质控区（,C,线）出现一,条红色条带,，检测区（,T,线）没有条带或者其强度,L4,（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，或其水平低于本试剂盒的最低检出限,无效,：,试纸条质控区（,C,线）,未出现条带,。表明试剂盒已损坏、失效或者操作有误,恒温扩增,-CPA,CAP,技术,CPA,的优势：快速，简单，灵活，稳定,A,ffordable,低价,:,不需昂贵的设备和分子实验室,S,ensitive,灵敏：,10,个菌,/ml,；与快培比较：,87%,S,pecific,特异：能鉴别人型和牛型结核分枝杆菌,U,ser-friendly,容易使用：不需,PCR,仪,操作简单,R,apid/robust,快速,/,稳定：样本到结果,2,小时,E,quipment,-free,无仪器：仅需离心机、水浴锅或金属浴,D,eliverable,易储运：不需冷链运输。装置可储存于室温,ASSURED,CPA,技术性能参数,六、环介导恒温扩增技术,(Loop-Mediated Isothermal Amplification,，,LAMP ),环介导恒温扩增法是日本荣研化学独立研发的一种“简便、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。它的特征是针对目标,DNA,链上的,六个区段,设计,四个不同的引物,，然后再利用,链置换反应,在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型,DNA,合成酶、基质等共同置于,一定温度下,（,60-65,）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在,15min-1h,内实现,10,9,-10,10,倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断,不需要使双链,DNA,先变性成单链,扩增反应在,等温,下可持续进行,扩增,效率极高,针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列,仅使用一种链置换,DNA,聚合酶，,成本低廉,扩增产物是在同一条,DNA,链上互补序列周而复始形成大小不一的结构,当模板是,RNA,时，仅需加入,逆转录酶,即可与,DNA,一样进行扩增,LAMP,技术原理动画图,LAMP,方法建立阶段所需的试剂,DNA,扩增,RNA,扩增,模板,DNA,引物,FIP,F3,BIP,B3,BstDNA,聚合酶,dNTPs,反应缓冲液,模板,RNA,引物,FIP,F3,BIP,B3,BstDNA,聚合酶,逆转录酶,dNTPs,反应缓冲液,LAMP,技术结果判读原理图,LAMP,法结果判断方式,-,目视检查混浊,LAMP,法结果判断方式,/,-,目视检查绿色荧光,/,浊度检测仪,扩增反应在等温条件（,60,65,）下连续进行,可以使用简便、廉价的扩增装置,扩增效率高、可在短时间内完成扩增,可在短时间内得出结果,有非常高的特异性,可得出“扩增反应发生,=,有目的菌存在”的结论,产生大量扩增产物，检测方法简便,无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视 方法确认扩增结果,从扩增到检测可在,1,个反应试管内（封闭系统）完成,可防止由于扩增产物产生的污染,从,RNA,经一步反应可完成扩增,无需另外进行逆转录反应,小结,LAMP,技术特点,LAMP,技术的应用领域,食品领域,食物中毒致病菌的检测,食品的卫生管理,食物中毒的防止,临床领域,病原菌,、,病毒的检测及鉴定,通过,SNP,多态性分型决定用药量,农业领域,植物病害的早期发现及蔓延防止,转基因作物的检测,环境领域,环境、水中病原微生物的检测,工业领域,工业产品用大量,DNA,的生产成为可能,畜牧业领域,雌雄性别判断,病原微生物的检测,遗传病的发现,LAMP,技术性能参数,七、,DNA,微阵列（基因芯片）技术,DNA,微阵列或芯片技术是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个,寡核苷酸探针，或将液相合成的探针,由微阵列器或机器人点样于,尼龙膜或硅片,上，再与,放射性同位素或荧光物标记的,DNA,或,cDNA,杂交,，用于分析,DNA,突变及多态性、,DNA,测序、监测同一组织细胞在不同状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域,博奥生物,基因芯片技术操作流程,样品制备,试剂配制,杂交,激光共焦扫描,软件判读,分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（,DNA,微阵列芯片法）,同时快速检测,17,种分枝杆菌：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟,-,脓肿、草、不色、海,-,溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍及耻垢。,分离株或者痰样本均可检测。,通 量：,同时检测,17,种分枝杆菌,速 度：,6,小时,versus,传统,4,周,灵敏度：,10,3,CFU/,反应,特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读,结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（,DNA,微阵列芯片法）,基于,rpo,B/,kat,G/,inh,A,的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）,通 量：,两,种一线抗结核药物,、,8,个突变位点,速 度：,6,小时,versus,传统,48,周,灵敏度：,10,3,CFU/,反应,特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读,基因芯片技术特点,基因芯片技术性能参数,分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（,DNA,微阵列芯片法）,结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（,DNA,微阵列芯片法）,（基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究）,基因芯片检测和,DNA,测序结果的符合率为,100%,绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别是,、, 、,-,中华检验医学杂志,2011,年第,9,月第,34,卷第,9,期,MTC,和,NTM,的测序符合率分别为,100%,和,%,TB,分离株鉴定灵敏度和特异性分别为,99.6%,和,100%,各项技术比较,检测方法,性能,检测时间,耗费,扩增效率,靶分子,储运要求,温度,实验平台要求,传统培养,特异性好，灵敏度低,鉴定,+药敏：2-3月,较大,-,抗原,一般,普通孵育,较高,T-SPOT,特异性与灵敏度较,TST好,24 h,高,-,ESAT-6与CFP 10抗原,高,二氧化碳孵育,较高,PCR,特异性与灵敏度较好,2.5h,较高,较高,DNA,高,热循环,高,SAT,特异性极好，灵敏度好,2 h,较低,极高,RNA,一般,恒温,较低,TMA,特异性极好，灵敏度好,2.5 h,较低,-,RNA,一般,恒温,较低,各项技术比较,检测方法,性能,检测时间,耗费,扩增效率,靶分子,储运要求,温度,实验平台要求,Hain,特异性与灵敏度较好,鉴定,+耐药：6 h,高,较高,DNA,高,热循环,较高,CPA,特异性与灵敏度极好,2 h,极低,高,DNA,低,恒温,低,LAMP,特异性极好，灵敏度好,2 h,极低,高,DNA,低,恒温,低,基因芯片,特异性极好，灵敏度好,鉴定,+耐药：6 h,高,高,DNA,高,热循环,高,Hain,特异性与灵敏度较好,鉴定,+耐药：6 h,高,较高,DNA,高,热循环,较高,Thank You!,谢谢观赏,