微生物次级代谢产物生物合成的调节机制

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,4.4,微生物次级代谢产物生物 合成的调节机制,1,微生物的新陈代谢错综复杂，参与代谢的物质又多种多样，即使是同一种物质也会有不同的代谢途径，而且各种物质的代谢间存在着复杂的相互联系和相互影响。,微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节.,2,微生物的代谢调节主要依靠两个因素来实现，即调节参与代谢的有关酶的活性(激活或抑制)和酶量(诱导或阻遏)。,3,1 初级代谢对次级代谢的调节,微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。,4,如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体a氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制a氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。,5,6,2 碳代谢物的调节,一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用(表4-2)。,这种抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的结果，而是由于其代谢过程中产生的中间产物引起的。,7,葡萄糖效应,阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源(如葡萄糖和柠檬酸等)的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。,8,青霉素,发酵中加入葡萄糖，有利于菌体生长，却抑制了青霉素的合成；而在培养基中加入乳糖，由于乳糖需要水解为葡萄糖和半乳糖，因此利用较为缓慢，对青霉素的合成没有抑制作用。,9,放线菌素,的生物合成过程中抗生链霉菌生物合成吩恶嗪酮合成的酶(PHS)受到碳分解产物的调控，高浓度的葡萄糖强烈地阻遏其合成，但却不能阻遏经pPH24转化的变青链霉菌中PHS的合成，这个事实提示从抗生链霉菌中克隆到的DNA片段带有自己的启动子，没有产生葡萄糖效应的调节序列，或是在变青链霉菌中不存在参与调控的负调节蛋白。,10,常采用其他碳源,生物合成都受到葡萄糖的阻遏的许多次级代谢产物，如麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素.,新生霉素合成，如果培养基中柠檬酸和葡萄糖同时存在，菌体优先利用柠檬酸，此时不合成新生霉素，只有当柠檬酸被耗竭和出现二次生长时，菌体才开始利用葡萄糖并合成新生霉素。,11,对大肠杆菌的碳代谢物阻遏实质的研究表明阻遏作用是葡萄糖通过细胞膜进入细胞时被磷酸化，在脱磷酸化的过程中磷酸转移酶(PCT)系统灭活了腺苷酸环化酶，从而减少了细胞内的环腺苷酸(cAMP)的形成。,外源加入cAMP可以解除阻遏作用。,实验还证明这种分解代谢产物的阻遏作用是发生在转录水平上的。,12,13,3 氮代谢物的调节,蛋白质、黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；,无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源(胺盐、硝酸盐、某些氨基酸)时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成,.,14,谷氨酸和丙氨酸,能阻遏参与放线菌素合成的犬尿氨酸甲酰胺酶的形成，抑制放线菌素的合成；,半胱氨酸和甲硫氨酸,能阻遏参与链霉素生物合成的甘露糖苷链霉素合成酶的形成，影响链霉素的合成；,铵,能阻遏参与B-内酰胺抗生素生物合成的三肽合成酶(ACV)和脱乙酰氧头孢菌素C合成酶的形成，导致它们的合成受到抑制。,15,高浓度的NH,4+,和一些氨基酸阻遏利福霉素、放线菌素、氯霉素、白霉素和黄曲霉素等抗生素，这主要是因为NH,4+,与谷氨酰胺合成酶(GS)有关，浓度越高，GS活力越低，抗生素的合成能力也越低。,16,利福霉素的合成中，发现,硝酸盐,能促进其生物合成，原因：,硝酸盐的存在可以促进糖代谢和三羧酸循环酶系的活力以及琥珀酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的酶活力，从而为利福霉素的合成提供更多的前体；,硝酸盐可以抑制脂肪酸合成，使部分合成脂肪酸的前体乙酰CoA转为合成利福霉素脂肪环的前体；,硝酸盐还能促进菌体GS的活力， 使GS浓度降低,同样增加利福霉素前体的浓度。,17,18,4 磷酸盐的调节,过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯类、大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。,磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。,19,磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。,20,21,4.1 促进初级代谢、抑制次级代谢,磷酸盐对初级代谢途径中的许多酶,(,如磷酸果糖激酶、葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶,),有刺激作用，因而促进初级代谢，并提供大量的初级代谢中间产物以满足微生物快速生长对大分子生物合成的需要。初级代谢的加速，竞争了合成初级代谢产物和次级代谢产物共用的分叉中间体，从而抑制了次级代谢产物的合成。,22,4.2 抑制次级代谢产物前体的形成,磷酸盐抑制参与次级代谢产物前体合成酶的活性，从而抑制次级代谢产物前体的形成，影响次级代谢产物的生物合成。,如合成聚酮体的前体丙二酰,CoA,，是由磷酸烯醇式丙酮酸经羧化和脱羧而来的，磷酸盐对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有抑制作用，从而减少前体丙二酰,CoA,的浓度，进而影响次级代谢产物的合成。,23,肌醇是链霉素合成的一个前体，它由,6-,磷酸,-,葡萄糖环化酶催化形成，而磷酸盐能增加对环化酶有竞争性抑制作用的焦磷酸的合成，使得肌醇的合成受到抑制，抑制了链霉素的生物合成。,另外，过量的磷酸盐抑制单磷酸己糖途径，使碳代谢有利于糖酵解途径。,24,许多抗生素的生物合成与单磷酸己糖途径有关，如参与核苷类抗生素生物合成的核糖、芳香体结构抗生素的重要中间体莽草酸等，糖代谢途径的改变，减少了这些前体物质的供应，从而抑制次级代谢产物的合成。,25,4.3 阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成,次级代谢产物的生物合成是由一系列酶促反应完成的，磷酸盐阻遏次级代谢产物合成过程中一些关键酶的合成，从而抑制次级代谢产物的形成。,在链霉素合成中，转脒基酶和催化N脒基链霉胺磷酸化的链霉胺激酶都是链霉素生物合成的关键酶，这两种酶的合成均受到磷酸盐阻遏。,26,泰乐菌素,结构中氨基糖合成中的一些关键酶，如脱水酶、氧化还原酶和转甲基酶也都受到磷酸盐阻遏。,合成,杀念菌素,的前体，即对氨基苯甲酸(PABA)是次级代谢所特有的酶(对氨基苯甲酸合成酶)以分枝酸为底物合成的，对氨基苯甲酸合成酶的形成受到磷酸盐的强烈阻遏，它是在转录水平进行调控的，当磷酸盐的浓度达到75 mmol/L时，对氨基苯甲酸合成酶的mRNA的合成将下降95，10mmol/L的磷酸盐就能完全抑制其合成。,27,4.4 抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性,碱性磷酸酯酶是链霉素、紫霉素及万古霉素等抗生素生物合成中的一个关键酶，它催化一些中间体的脱磷酸反应，过量的磷酸盐抑制磷酸酯酶的活性。,磷酸酯酶的活性与链霉素的合成具有正相关性，如果培养基中磷酸盐的浓度合适，菌体在生长期磷酸盐将被利用，开始进入链霉素合成阶段时，可以立刻观察到碱性磷酸酯酶活力的增加。,28,在链霉素的生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应，过量的磷酸盐能抑制这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性，因而抑制链霉素的合成。特别值得一提的是链霉素合成的最后一个中间体是链霉素磷酸酯，必须经碱性磷酸酯酶的作用脱去磷酸根才能生成链霉素，过量的磷酸盐抑制了该酶的活性，使该反应不能顺利进行，导致无活性的链霉素磷酸酯的积累，抑制了具有抗菌活性的链霉素的合成。,29,4.5增加菌体能荷状态，促进初级代谢,能荷,可按下式计算：,EC()=(ATP+12ADP) (ATP+ADP+AMP)X100,30,通常情况下，高产的次级代谢产物产生菌株体内的ATP浓度比低产菌株低，细胞内ATP水平可以通过培养基中磷酸盐的浓度来调节。如果在培养基中加入过量的磷酸盐，可以大大提高菌体内ATP浓度，降低次级代谢产物的合成。,31,例如，在合成杀假丝菌素的灰色链霉菌培养液中添加5 mmol/L的磷酸盐，产生菌对氧的需要量显著增加，细胞内ATP浓度增大，抗生素的合成立即停止，同时还伴有RNA、DNA和蛋白质的合成速率恢复到菌体生长期的速率水平，促进了初级代谢；当磷酸盐被耗尽时，菌体的生长速率开始下降，抗生素的合成又重新开始。,32,在菌体迅速生长期，过量磷酸盐存在，可以使次级代谢产物合成酶类不能形成，也可以抑制次级代谢产物合成酶的活性，说明磷酸盐的调节是在转录水平上进行的。,33,5 ATP调节,ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。,四环素的生物合成,34,磷酸烯醇式丙酮酸,乙酰CoA,乙酰CoA羧化酶,丙二酰CoA,菌体生长期占主导地位,磷酸烯醇式丙酮酸,羧化酶,草酰乙酸,羧基转移酶,四环素合成期起决定作用,两条途径,35,因此，强化第二条途径有利于四环素的合成。而第二条途径中的草酰乙酸是TCA循环中的重要中间产物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量磷酸盐的强烈抑制，从而降低了草酰乙酸的生成，最终降低了四环素生物合成前体丙二酰CoA的浓度，影响四环素的生物合成。,36,4.6 酶的诱导调节,诱导酶需要有诱导物存在才能形成。,在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，如链霉素生物合成中的转脒基酶、甘露糖链霉素酶等。,甘露糖链霉素酶的形成需要a甲基甘露糖、甘露聚糖等诱导物的存在，其中以酵母的甘露聚糖的诱导效果为最好。,37,目前，底物的诱导机理虽然并不完全清楚，但这些诱导物确实起诱导作用，能提高次级代谢产物的产量。,38,例如，蛋氨酸能提高头孢菌素C的产量，其原因是蛋氨酸的诱导作用，而不是作为硫源的供给物；,又如，6-氨基葡萄糖-2-去氧链霉胺诱导卡那霉素生物合成中卡那霉素乙酰基转移酶的合成，它的加入可以提高卡那霉素的产量。,39,诱导酶合成的诱导剂有些需外源加入，称外源诱导剂，,有些是菌体代谢过程中自身产生的，则称内源诱导剂。,在抗生素的发酵过程中，有的初级代谢产物似乎对次级代谢产物的合成酶也起诱导作用。,40,47,反馈调节,在次级代谢产物合成中，反馈调节起着重要作用。,一方面是次级代谢产物本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。,例如，氯霉素作为次级代谢产物阻遏该代谢途径中的第一个酶芳基胺合成酶，培养液中氯霉素的积累，降低氯霉素的产量；卡那霉素阻遏卡那霉素乙酰基转移酶，影响卡那霉素的合成。此外，泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。,41,另一方面，初级代谢和次级代谢途径是紧密相连的，初级代谢受到的反馈调节，也必然影响次级代谢产物的合成。,例如，缬氨酸自身反馈抑制乙酰羟酸合成酶的活性，从而影响了青霉素的合成。分叉中间体对初级代谢终产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的合成。如赖氨酸反馈抑制同型柠檬酸合成酶的活性，抑制了青霉素合成的起始单位a-氨基己二酸的合成，必然影响青霉素的生物合成。,42,4.8 酶活力调节,酶活力调节,是指一定数量的酶通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率，一般是通过激活或抑制已有酶的活力来实现，其特点是反应快速。,43,(1),酶激活作用,酶的激活剂,主要是金属离子，但由于激活只能通过外源提供，不属于代谢激活。,代谢激活作用,是指代谢物对酶的激活，包括前体激活和代谢中间产物的反反馈激活两种情况。,前体激活,是指代谢途径中后面的酶促反应可被此途径前面的一个中间产物所促进，例如粪链球菌。乳酸脱氢酶的活力，可以被前体物质1，6-二磷酸果糖促进。,代谢中间产物激活,是指代谢中间产物对该代谢途径的前面酶起激活作用，激活的方式并不多见，较著名的例子是l，6-二磷酸果糖是果糖激酶的激活剂。,44,(2)酶抑制作用,抑制和激活相反，可降低酶的活力。,在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的，而且大多数属于反馈抑制。,反馈抑制,是指代谢的末端产物对酶活力的抑制,45,无分支代谢途径的调节,：,通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活力有抑制作用。,有分支代谢途径的调节,：,即有两种或两种以上的末端产物，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用,46,酶的顺序反馈抑制,协同反馈抑制,累积反馈抑制,增效反馈抑制,47,48,酶的顺序反馈抑制,：分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶，而是当末端产物先分别抑制分支点后的反应步骤后，造成中间产物的积累，再由高浓度的中间产物反馈抑制第一个酶。因此只有当两个末端产物都过量时，才能对第一个酶有抑制作用。如枯草芽孢杆菌合成芳香族氨基酸的抑制作用。,协同反馈抑制,：在分支代谢系统中，几种末端产物同时都过量时，才对途径中的第一个酶有抑制作用。它同顺序反馈抑制不同之处在于它不通过中间产物积累，而直接作用于第一个酶。如荚膜红假单胞菌合成天冬氨酸中天冬氨酸激酶受末端产物的反馈抑制作用。,49,累积反馈抑制,：在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制，即一种末端产物单独过量并不影响其他末端产物的形成，也只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制作用。如大肠杆菌谷氨酸合成酶受末端产物的调节作用。,增效反馈抑制,：在一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。而当每种末端产物都过量时，其抑制作用超过各种末端产物单独抑制的总和。在嘌呤核苷酸生物合成途径中，5磷酸核糖l焦磷酸的酰胺转移酶受末端产物的增效反馈抑制。,50,4.9酶合成调节,酶合成调节,是通过酶量的变化来控制代谢速率水平上起作用，包括酶合成诱导和阻遏两种类型。,51,酶合成的诱导,通过诱导合成的酶称为诱导酶，这种酶只有在补加相应诱导剂(底物)时才能大量合成。,酶合成的诱导作用可表现出协同诱导和顺序诱导两种情况。,52,协同诱导,是指一种诱导剂可以同时诱导产生若干种酶的现象，例如半乳糖可以同时诱导产生半乳糖激酶、转移酶和异构酶。,顺序诱导,是指一种诱导剂可以连续诱导产生一系列酶的现象，例如荧光假单胞菌降解芳香族化合物的酶系就是通过顺序诱导而产生的。,53,酶合成的阻遏,阻止酶合成的现象即为,酶合成的阻遏，,其中阻遏酶合成的物质称为阻遏物。,酶合成的阻遏分为,终点产物反馈阻遏和分解代谢物的阻遏,两种类型，前者是指被阻遏物阻遏合成的酶所催化生成的物质为代谢的终点产物；而后者是指一些被菌体迅速利用的底物或其分解的产物对许多酶合成的抑制作用。,54,分解代谢物阻遏根据底物不同，可分为碳分解产物阻遏和氮分解产物阻遏，即指一些被菌体能够迅速利用的碳源或氮源能阻遏其他某些参与含碳或含氮化合物代谢的酶的合成。,55,4.10 细胞膜通透性调节,次级代谢中也存在着膜通透性调节。菌体吸收外界营养物质或分泌细胞内的代谢物都必须经过细胞质膜的运输。如果细胞对某种物质不能运输，或是运输功能发生了障碍，将导致细胞内合成代谢的产物不能分泌出去，影响发酵产物的生成和收获；或者是细胞外的营养物质不能进入菌体或进入很少，从而影响产生菌的生长和产物的合成，造成产量下降。,56,在青霉素的发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物的能力是影响青霉素发酵单位的一个重要因素。诱变选育出来的青霉素高产菌株中，有些变株就是因为改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更容易透过细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，最终提高了青霉素的产量。,57,又如，产生新生霉素的弗氏链霉菌和不产生新生霉素的变株相比，两者细胞膜上的脂肪酸组成不同。,58,当在培养基中加入油酸钠和氯化钠后，经培养后不产新生霉素的变株的细胞膜又恢复成与亲株相同的脂肪酸组成，并开始合成新生霉素。进一步分析发现，变异株细胞膜摄取合成新生霉素所需氨基酸的能力大大降低。,59,因此，细胞膜通透性是代谢调节的一个重要方面，可以通过改变某些次级代谢产物产生菌的膜通透性来提高其产量。,60,11金属离子和溶解氧的调节,在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。,例如，Mg2+可以增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。,61,另外有些金属离子(如Mg2+和Ca2+等)可以解除产生菌(卡那霉素、新生霉素和链霉素等产生菌)对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。,还有一些金属离子(Mg2+)可增加产生菌对所产抗生素的抗性。,62,次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，溶解氧的降低影响次级代谢产物的生物合成。例如，在利用无细胞体系由青霉素N进行头孢菌素合成时，随着氧分压的增大头孢菌素的合成被促进，同时加入KCN或降低搅拌速度合成量则减少。,63,45 研究微生物药物生物合成,机理的主要方法,64,微生物药物生物合成机理的研究包括细胞内将一种或几种初级代谢产物转化为次级代谢终产物的反应顺序，以及该反应系统的调节机制。通过了解微生物药物生物合成的机理，可以人为地改变和控制微生物的代谢，大幅度地提高目的产物的产量。,65,论证生物合成途径的一般步骤为：,确定构成目的产物的构建单位即生源；,确定生物合成途径中的关键的中间产物，合理地推断反应顺序；,分离鉴别生物合成反应中的关键酶。 ,66,研究方法,喂养实验法或称刺激试验,洗涤菌丝悬浮法 或称静息细胞法,阻断变株法,互补共合成法,同位素标记法,无细胞抽提液法),酶抑制剂法,67,遗传特性诱变法,原生质体试验法,去阻遏方法,68,(1)喂养实验法（或称刺激试验）,在发酵的培养基中，加入某些可能是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的利用情况与促进目的产物生成的效果。这种方法所得出的实验结果是很初步的，难以判断添，例如，所加物质所产生的效果究竟是前体还是刺激作用，需要进一步研究。,69,(2)洗涤菌丝悬浮法 或称静息细胞法,目的:为了排除原培养基自身的代谢物对不同生长阶段的影响，,简化代谢物生物合成的研究系统和区别试验化合物的作用，常借用洗净的静息菌丝体，此时菌体不在分裂过程中，但仍有代谢活力。,70,试验时,取不同生长阶段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分和代谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对产物生物合成的影响。为避免菌体内含物的干扰，常把洗净后的菌体悬浮于生理盐水中，保温一定时间，尽可能使其内源营养耗尽，然后再在人工培养系统中进行试验,即饥饿后实验,。采用此法，被试验的菌体虽然能以基础原料合成某种代谢物，产量大大减少，但仍可以判断生物合成过程中的一些反应步骤。,71,(3)阻断变株法(block strains),将次级代谢产物产生菌进行诱变处理，筛选出失去产生某种目的代谢产物能力的突变株，即生物合成的阻断变株。这种阻断变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物，通过分离、提纯、鉴别中间代谢产物，并与目的代谢产物的化学结构相比较，推断出目的代谢产物的生物合成的反应步骤，然后再分离其反应中的特殊酶类，进一步判断其生化反应的特性。,72,(4)互补共合成(cosynthesis)法,应用两株生物合成阻断变株，当它们单独培养时均不能产生目的代谢产物，而将它们进行混合培养时获得目的产物或者以后某一步中间体，来证明生物合成所经过的途径，或证明生物合成途径中确实存在某个中间体，通过分别提取、分离和鉴别阻断变株积累的中间体和共合成的产物，了解它们的阻断部位和顺序以及反应过程，推断目的产物的生物合成途径。,73,74,以上方法都受到一定的限制，主要是由于菌体细胞膜和细胞壁的通透性对试验化合物的影响。有的试验化合物，虽然确实是产物合成途径中的前体，但因受细胞壁、细胞膜的通透性的障碍或通过时受细胞壁与细胞膜上酶的作用而引起分子降解或发生立体构型的改变等，使这类讨论中得到了负的结果。所以上述方法所得到的负结果并不能否定它不是生物合成中的前体。,75,(5)同位素标记法,同位素标记法是确定构成目的产物分子“构建元件”的好方法,即应用同位素合成起始物和中间体进行喂养实验,。,将具有放射性同位素3H或者14C标记的可疑前体物质加入到次级代谢产物产生菌的培养基中：最佳加入时间是微生物生长阶段的后期，培养结束后，提取分离目的代谢产物，测定结合到次级代谢产物的同位素含量和分布情况，可以判断试验化合物是否参与代谢产物的生物合成。,76,重要缺点,为了确定同位素的结合位置,还需将产物进行一系列的降解,分离和测定等大量工作.,77,应用此方法时应注意两点,一是,示踪物质虽然是目的产物生物合成的前体物质，但由于不能通过细胞壁进入细胞而不能被结合到产物的分子中，将其错误地认为不是前体物质；,二是,虽然在目的产物中检测到了示踪物质，但实际是示踪物质在细胞内被降解，真正结合到目的产物分子的是示踪物质的降解产物。,78,(6)无细胞抽提液法(cell-free extraction),要进一步证实反应过程还必须依靠有关酶促反应。通常采用无细胞抽提液来进行下一步实验。,制备方法,是先用适当的方法（超声波等处理）破碎细胞，释放胞内酶，再经过离心、冷冻干燥，即得到粗酶制品。这种酶制品往往含有多个酶体系，为了排除其他酶对某一种酶反应的干扰，进一步分离纯化制得纯酶。将制得的纯酶和有关物质加入到反应体系，进行酶促反应。检测反应体系中的底物和产物浓度，判断该酶是否催化目的产物的生物合成。,79,(7)酶抑制剂法(enzyme inhibition),在微生物的发酵过程中，添加某种酶的抑制剂，以抑制目的产物的合成；或者阻断目的产物生物合成途径中的某一步骤，使目的产物不能合成；再通过分离、鉴别所累积的中间代谢产物和相应产物，推测生物合成过程。,80,近年来从头孢菌,Cephalosporium caeruleus,中分离到一种能抑制脂肪酸生物合成中缩合酶,(3-oxoacyl-ACP-synthase)的浅蓝天菌素Cerulenin，它使乙酰载体蛋白(Acyl carrier protein，ACP)与丙二酰-ACP不能缩合成乙酰乙酰基-ACP，故也阻止了聚乙酰体生物合成途径，因此可作为研究聚乙酰体(Polyketide)途径所产生天然产品生物合成工具。,81,82,(8)遗传特性诱变法,是研究生物合成过程中产物形成的遗传机制一种有效方法。,将产生菌进行诱变，使其失去生成产物或某步中间体的能力，就可分离到生物合成中的各种不同障碍突变株，,即所谓负突变株。,这些负突变株能积累某种中间代谢产物或支路代谢产物。从分析产生菌和突变株代谢产物化学结构上的差异，找出这些代谢产物在合成中的相互关系，就可推断其生物合成反应步骤，再分离反应中的特殊酶类，又可判断其生化反应特性。,83,（9）,原生质体试验法,将原生质体悬浮于原生质体高渗稳定液中，添加前体进行喂养试验，观察其渗入结果。,此法不仅排除了壁通透性障碍，并且保全整体细胞内酶体系来进行研究，不像无细胞抽提法用破碎细胞而损坏了酶体系，使某些需偶联的酶反应(如氧化还原反应)来进行生物合成就不能得到结果。,84,（10）去阻遏方法,阻遏,是指一种代谢途径受到本代谢途径或相关的代谢途径产物的抑制，结果导致催化此代谢途径的酶的合成下降。抑制可由终产物、中间产物或偶尔由底物所造成。,85,去阻遏的方法有两个方面：,(1)用环境操作去阻遏可通过下面过程之一或两种一起来达到去阻遏。,代谢途径产物的阻遏可通过限制产物的积累而降低。,分解代谢阻遏是当供给可快速利用的养料，例如葡萄糖或氨时，通过所形成的产物而减少有关酶，如淀粉酶或蛋白合成酶；这可以通过加入较难利用的养料(例如，淀粉或大豆粉)加以限制。,(2)用遗传选择去阻遏：包括选择不会受到产物阻遏的突变株。,86,假 期 愉 快!,87,