利用流式细胞术分析细胞周期时相

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验 利用流式细胞术分析细胞周期时相,细胞生物学实验,1,流式细胞术分析细胞周期时相,实验目的,实验原理,仪器、材料与试剂,实验步骤,实验报告及思考题,2,实 验 目 的,掌握流式细胞仪的工作原理,掌握用流式细胞仪测量细胞群体,DNA,含量分布的方法,了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用,细胞周期时相分析,3,实 验 原 理,流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。,通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。,细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。,细胞周期时相分析,4,仪器、材料与试剂,仪器：,流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱,材料：,HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips,试剂：,70乙醇（保存于4），RNase-A （10mg/ml,-20保存），,PI （650g/ml，避光保存于-20），PBS(pH 7.4，保存于4),细胞周期时相分析,5,实 验 步 骤,取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800rpm , 离心 15 min去上清。,PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。,用5mL注射器将细胞吸起，用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4固定过夜（可长至2周）,800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次,用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）,加RNase-A约3L至终浓度约为50g/mL ，37水浴消化30 min；,加PI约50L至终浓度约为65g/mL ，在冰浴中避光染色30 min。,用300目（孔径4050微米）尼龙网过滤，上机检测,样品分析测定及打印,细胞周期时相分析,6,实 验 报 告 及 思 考 题,实验报告,标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？,思考题,流式细胞术在科学研究中的应用,本实验为何要采用对数生长期的细胞？,细胞周期时相分析,7,