发酵培养基及制备

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 发酵培养基及其制备,1,主要内容,第一节 发酵培养基的选择,第二节 发酵培养基的设计与优化,第三节 发酵培养基的成分及来源,第四节 淀粉水解糖的制备,第五节 糖蜜原料,第六节 石油代粮发酵的原料,第七节 其他原料发酵,2,第一节 发酵培养基的选择,发酵培养基：,满足菌体的生长、促进产物的形成,要符合增产节约、因地制宜,能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常关键的一环。,3,孢子培养基,孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。,配制要求：, 营养,不要太丰富,，否则不宜产孢子。, 所用,无机盐,的浓度要适量，不然也会孢子量和孢子颜色。, 要注意培养基的pH和湿度。,4,种子培养基,种子培养基是供,是,供微生物菌体的生长繁殖。,为了在较短的时间内获得数量较多的强壮的种子细胞，种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。,配制要求：, 营养,比较丰富和完全,，,总浓度略稀薄,；, 成分,接近于,发酵培养基。,5,发酵培养基,发酵培养基是,除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要,目的,是合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基,碳源,物质的含量往往要高于种子培养基。,发酵培养基还应,考虑便于,发酵操作以及不影响产物的提取分离和产品的质量。,要求：, 发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等；, 考虑培养基用分批补料工艺。,6,对发酵培养基进行科学的设计，包括两个方面的内容：,是对发酵培养基的成分及原辅料材料的特性有较为详细的,了解,；,是在此基础上结合具体微生物和发酵产品的代谢特点及对培养基的成分进行合理的,选择和优化。,7,一、发酵培养基选择的依据,根据微生物的特点选择培养基, 细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四类,根据不同用途选择培养基,液体培养基和固体培养基,根据生产实践和科学试验的不同要求选择,根据经济效益分析选择培养基,价廉、来源丰富、运输方便、就地取材、无毒,8,二、发酵培养基成分选择的原则,不同的微生物所需要的培养基成分是不同的，要确定一个合适的培养基，就需要了解生产根据不同生产菌种的培养条件、生物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。,9,1菌体的同化能力,微生物来源和种类的不同，所能分泌的水解酶系。,酵母菌只能利用简单的糖类 ：中国酒曲中含有丰富的淀粉酶和糖化酶，国外利用麦芽含有丰富的淀粉水解酶类。,许多碳源和氮源都是复杂的有机大分子，如豆饼粉、黄豆饼粉等。,10,1菌体的同化能力,微生物利用氮源的能力因菌种、菌龄的不同而有差异。,同一微生物处于生长不同阶段时，对氮源的利用能力不同，在生长早期容易利用易同化的铵盐和氨基氮，在生长中期则由于细胞的代谢酶系已经形成，则利用蛋白质的能力增强。因此在培养基中有机氮源和无机氮源应当混合使用。,11,2代谢物的阻遏和诱导作用,对于快速利用的碳源如葡萄糖来讲，当菌体利用葡萄糖时产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需酶系的形成或酶的活性，即发生“葡萄糖效应”。,抗生素发酵生产时，考虑分批补料或连续补料的方式来解除。,酶制剂生产，难被利用的碳源(如淀粉、糊精等)有利于产酶，几乎都选用淀粉类原料作为碳源。,12,2代谢物的阻遏和诱导作用,有些产物会受氮源的诱导与阻遏,蛋白酶的生产受培养基中蛋白质或多肽的诱导，而受铵盐、硝酸盐、氨基氮的阻遏。这时在培养基氮源选取时应考虑以有机氮源(蛋白质类)为主。,在选择和配制发酵培养基时，要注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，发挥各自优势，避其所短。,13,3合适的碳氮比,培养基中的碳氮的比例（C/N）在发酵工业中尤为重要。,氮源过多，则菌体繁殖旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。,碳源过多，则容易形成较低的pH；碳源不足，菌体衰老和自溶。,碳氮比不当还会影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物的形成，菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求也不一样。,14,3合适的碳氮比,酵母细胞中碳氮比约为100：20，,霉菌约为100：10。,一般发酵工业中碳氮比约为l00：（0.2-2.0) 。,氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。如谷氨酸发酵的C：N为100：(1521)，若碳氮比为100：(0.22.0)，则会出现只长菌体，几乎不产谷氨酸的现象。,15,理论+经验, 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；, 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；, 采用合理的实验设计方法优化配方。, 正交实验设计，方差分析, 响应面法设计及分析,16,单因子实验,碳源的选择,氮源的选择,诱导剂及前体的选择,无机盐的选择,17,18,19,对于单因素或两因素试验，因其因素少 ，试验的设计 、实施与分析都比较简单 。但在实际工作中 ，常常需要同时考察,3,个或,3,个以上的试验因素 ，若进行全面试验 ，则,试验的规模将很大,，往往因试验条件的限制而难于实施 。,正交试验设计就是安排多因素试验 、寻求最优水平组合 的一种高效率试验设计方法。,正交试验设计的概念及原理,20,例如，要考察增稠剂用量、pH值和杀菌温度对豆奶稳定性的影响。每个因素设置3个水平进行试验 。,A因素是增稠剂用量，设A,1,、A,2,、A,3,3个水平；B因素是pH值，设B,1,、B,2,、B,3,3个水平；C因素为杀菌温度，设C,1,、C,2,、C,3,3个水平。这是一个3因素3水平的试验，各因素的水平之间全部可能组合有,?,种 。,21,22,3因素3水平的全面试验水平组合数为3,3,=27，4因素3水平的全面试验水平组合数为3,4,=81 ，5因素3水平的全面试验水平组合数为3,5,=243，这在科学试验中是有可能做不到的。,23,1.1,正交试验设计的基本概念,正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。,24,(1)A,1,B,1,C,1,(2)A,2,B,1,C,2,(3)A,3,B,1,C,3,(4)A,1,B,2,C,2,(5)A,2,B,2,C,3,(6)A,3,B,2,C,1,(7)A,1,B,3,C,3,(8)A,2,B,3,C,1,(9)A,3,B,3,C,2,A,3,A,2,A1,B,3,C,3,25,这9个试验点在选优区中分布是均衡的，在立方体的每个平面上 ，都恰是3个试验点；在立方体的每条线上也恰有一个试验点。,9个试验点均衡地分布于整个立方体内，有很强的代表性， 能够比较全面地反映选优区内的基本情况。,26,正交表,由于正交设计安排试验和分析试验结果都要用正交表，因此，我们先对正交表作一介绍。,27,其中“,L,”,代表正交表；,L,右下角的数字“,8”,表示有,8,行 ，用这张正交表安排试验包含,8,个处理,(,水平组合,),；括号内的底数“,2”,表示因素的水平数，括号内,2,的指数“,7”,表示有,7,列 ，用这张正交表最多可以安排,7,个,2,水平因素。,28,L,9,(3,4,)正交表,D,29,正交试验设计的基本程序,对于多因素试验，正交试验设计是简单常用的一种试验设计方法，,正交试验设计的基本程序包括,试验方案设计,及,试验结果分析,两部分。,30,试验目的与要求,试验指标,选因素、定水平,因素、水平确定,选择合适正交表,表头设计,列试验方案,试验方案设计：,试验结果分析,31,进行试验，记录试验结果,试验结果极差分析,计算K值,计算k值,计算极差R,绘制因素指标趋势图,优水平,因素主次顺序,优组合,结 论,试验结果分析：,试验结果方差分析,列方差分析表，进行,F,检验,计算各列偏差平方和、自由度,分析检验结果，写出结论,32,实例：为提高山楂原料的利用率，研究酶法液化工艺制造山楂原汁，拟通过正交试验来寻找酶法液化的最佳工艺条件。,33,2.1 试验方案设计,试验设计前必须明确试验目的，即本次试验要解决什么问题。试验目的确定后，对试验结果如何衡量，即需要确定出,试验指标,。试验指标可为,定量指标,，如强度、硬度、产量、出品率、成本等；也可为,定性指标,如颜色、口感、光泽等。一般为了便于试验结果的分析，定性指标可按相关的标准打分或模糊数学处理进行数量化，将定性指标定量化。,（1） 明确试验目的，确定试验指标,34,对本试验而言，试验目的是为了提高山楂原料的利用率。所以可以以液化率液化率=(果肉重量-液化后残渣重量)/果肉重量100%为试验指标，来评价液化工艺条件的好坏。液化率越高，山楂原料利用率就越高。,35,根据专业知识、以往的研究结论和经验，从影响试验指标的诸多因素中，通过因果分析筛选出需要考察的试验因素。,一般确定试验因素时，应以对试验指标影响大的因素、尚未考察过的因素、尚未完全掌握其规律的因素为先。,试验因素选定后，根据所掌握的信息资料和相关知识，,确定每个因素的水平，一般以2-4个水平为宜。,对主要考察的试验因素，可以多取水平，但不宜过多（6），否则试验次数骤增。,因素的水平间距，应根据专业知识和已有的资料，尽可能把水平值取在理想区域。,（2） 选因素、定水平，列因素水平表,36,对本试验分析，影响山楂液化率的因素很多，如山楂品种、山楂果肉的破碎度、果肉加水量、原料,pH,值、果胶酶种类、加酶量、酶解温度、酶解时间等等。经全面考虑，最后确定,果肉加水量、加酶量、酶解温度和酶解时间,为本试验的试验因素，分别记作A、B、C和D，进行,四因素正交试验，各因素均取三个水平,，因素水平表见表所示。,37,水平,试验因素,加水量,（mL/100g）,A,加酶量,（mL/100g）,B,酶解温度,（）,C,酶解时间,（h）,D,1,10,1,20,1.5,2,50,4,35,2.5,3,90,7,50,3.5,因素水平表,38,试验号,因素,液化率,A,B,C,D,1,1,1,1,1,0,2,1,2,2,2,17,3,1,3,3,3,24,4,2,1,2,3,12,5,2,2,3,1,47,6,2,3,1,2,28,7,3,1,3,2,1,8,3,2,1,3,18,9,3,3,2,1,42,39,K,jm,，k,jm,计算简便，直观，简单易懂，是正交试验结果分析最常用方法。,正交试验的结果分析,直观分析法极差分析法,极差分析法R法,1. 计算,2. 判断,R,j,因素主次,优水平,优组合,K,jm,为第j列因素m水平所对应的试验指标和，k,jm,为K,jm,平均值。由k,jm,大小可以判断第j列因素优水平和优组合。,R,j,为第j列因素的极差，反映了第j列因素水平波动时，试验指标的变动幅度。R,j,越大，说明该因素对试验指标的影响越大。根据R,j,大小，可以判断因素的主次顺序。,40,试验号,因素,液化率,A,B,C,D,1,1,1,1,1,0,2,1,2,2,2,17,3,1,3,3,3,24,4,2,1,2,3,12,5,2,2,3,1,47,6,2,3,1,2,28,7,3,1,3,2,1,8,3,2,1,3,18,9,3,3,2,1,42,41,（1） 确定试验因素的优水平和最优水平组合,分析A因素各水平对试验指标的影响。,由表3可以看出，A,1,的影响反映在第1、2、3号试验中，A,2,的影响反映在第4、5、6号试验中，A,3,的影响反映在第7、8、9号试验中。,A因素的1水平所对应的试验指标之和为,K,A1,=y1+y2+y3=0+17+24=41，k,A1,= K,A1,/3=13.7；,A因素的2水平所对应的试验指标之和为,KA2=y4+y5+y6=12+47+28=87，kA2=KA2/3=29；,A因素的3水平所对应的试验指标之和为,KA3=y7+y8+y9=1+18+42=61，kA3=KA3/3=20.3,。,不考察交互作用的试验结果分析,42,根据正交设计的特性，对A,1,、A,2,、A,3,来说，三组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么k,A1,、k,A2,、k,A3,应该相等，但由上面的计算可见，k,A1,、k,A2,、k,A3,实际上不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据k,A1,、k,A2,、k,A3,的大小可以判断A,1,、A,2,、A,3,对试验指标的影响大小。由于试验指标为液化率，而k,A2,k,A3,k,A1,，所以可断定A,2,为A因素的优水平。,43,同理，可以计算并确定B,3,、C,3,、D,1,分别为B、C、D因素的优水平。四个因素的优水平组合A,2,B,3,C,3,D,1,为本试验的最优水平组合，即酶法液化生产山楂清汁的最优工艺条件为加水量50mL/100g，加酶量7mL/100g，酶解温度为50,酶解时间为1.5h。,44,根据极差R,j,的大小，可以判断各因素对试验指标的影响主次。,（2） 确定因素的主次顺序,以各因素水平为横坐标，试验指标的平均值,（k,jm,）,为纵坐标，绘制因素与指标趋势图。由因素与指标趋势图可以更直观地看出试验指标随着因素水平的变化而变化的趋势，可为进一步试验指明方向。,（3） 绘制因素与指标趋势图,45,试验结果分析,加酶,加水,温度,时间,46,47,48,第三节 发酵培养基的成分及来源,1、工业常用的碳源,葡萄糖、糖蜜、淀粉、糊精、油和脂肪、有机酸。,2、工业常用的氮源,有机氮源、无机氮源,生理酸碱性物质：无机氮源经微生物生理作用,（代谢）后能形成酸碱性物质,49,3、 无机盐及微量元素,低浓度对微生物生长和产物合成有促进作用，,在高浓度时常表现出明显的抑制作用。,生产中要通过试验预先了解菌种对无机盐和微量元素的,最适需求量，以稳定或提高产量。,4、生长因子、前体物质、产物抑制剂和促进剂,发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，,而并不促进微生物的生长，,50,一、碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,51,3、工业上常用的糖类, 葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖,但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质,量指标,52,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,53, 糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物,。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达,50%75%,。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜,。,54,不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响,55,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）,生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐,56, 淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、,发酵液比较稠、,一般2.0%,时加入一定的-淀粉酶,成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格底,难利用，可以解除葡萄糖效应,57,例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响,碳源 细胞量 -淀粉酶,葡萄糖 4.2 0,蔗糖 4.02 0,糊精 3.06 38.2,淀粉 3.09 40.2,58,李江华，无锡轻工大学学报，2004,(1.5g麸皮),59,嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响,结果：各种碳源相差不大,推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型,苏勤，林业化学与工业，2004,60,二、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、无机氮源,种类,：氨盐、硝酸盐和氨水,特点,：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起,pH,的变化如：,(NH,4,),2,SO,4,2NH,3,+ 2H,2,SO,4,NaNO,3,+ 4H,2,NH,3,+ 2H,2,O + NaOH,61,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫,生理酸性物质,，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为,生理碱性物质,，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：,满足菌体生长,稳定和调节发酵过程中的,pH,62,毛霉产蛋白酶的研究,陈涛，中国酿造，2004,初始pH的影响:,pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大,63,无机氮源的影响：,硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素,64,2、有机氮源,来源,：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，,花生饼,粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋,白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒,糟,。,成分复杂,：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机,盐及生长因子。,例 玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸,较多的乳酸,硫、磷、微量元素等,65,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响,66,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源,中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例： 蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好,、有,针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣,的课题,67,68,三、无机盐的微量元素,1,、作用：各种不一样,2、,来源：C、N源，以盐的形式补充,3、,用量：根据具体的产品，以实验决定,4、,使用注意点,A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和,微量元素在发酵过程中必须加以考虑,69,例：铁离子,青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml,发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例,：,黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响,pH 酶活,不加 4.25 120分钟,加 K,2,HPO,4,5.45 30分钟,加 KH,2,PO,4,4.62 75分钟,70,四、生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以,生物素,为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用,。,有机氮源,是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,71,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到,产物,物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸,:分子量136,72,用法,：前体使用时普遍采用,流,加的方法,前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利,苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%,前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率,73,发酵过程中所用的一些前体物质,产品,前体,产品,前体,青霉素,G,青霉素,V,金霉素,灰黄霉素,红霉素,苯乙酸,苯氧乙酸,氯化物,氯化物,正丙醇,核黄素,类胡萝卜素,L-,异亮氨酸,L-,色氨酸,L-,丝氨酸,丙酸盐,-紫罗酮,-氨基丁酸,邻氨基苯甲酸,甘氨酸,74,3、产物促进剂,所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,75,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。,有些促进剂本身是酶,的诱导物,；,有些促进剂是表面活性剂，可改,善细胞的透性,，改善,细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，,也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有,保护作用,；,有些促进剂的作用是沉淀或,螯合有害的重,金属离子。,76,五、水,对于发酵工厂来说，,恒定的水源是至关重要的,，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括,pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成,和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，,可靠、持久，能提供大量成分一致清洁,的水。,77,