透明质酸发酵工艺原理综述

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,透明质酸发酵工艺原理综述,姬跃莹 200900606030,生化系生物工程091,广西科技大学,（,筹,）,摘要,：,生物发酵法是生产透明质酸的主要方法，分离纯化是发酵法制备高分子量、高纯度透明质酸的关键环节本文探讨了透明质酸发酵液的特性和分离纯化过程中工艺条件对透明质酸分子量和结构的影响，对预处理、分离、纯化各阶段的工艺方法进行了系统比较和分析，指出了透明质酸分离纯化工艺中存在的问题。并提出了今后分离纯化研究的重点。,关键词：透明质酸；分离；纯化,Abstract,Fermentation has become a primary method for producing hyaluronic acidSeparation and purification are key steps of fermentation in preparing high relative molecular weight(Mr)and high purity hyaluronic acidThis article discusses the characteristics of fermentation broth and the influences of process conditions on hyaluronic acid Mr and structure，systematically analyzes the techniques in pretreatment，separation and purification stagesIt also points out some existing problems in the separation and purification techniques and presents the focus of future research,Key words：hyaluronic acid；separation；purification,前言,透明质酸, Hyalu ron ic acid, 常常简写为HA , 又称玻璃酸,，是一种广泛存在于结缔组织（如动物的皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞和血管壁中）及某些微生物荚膜中具有特殊功能的胞外大分子酸性粘多糖。,HA 是由(14) 202,D,2葡糖醛酸2B2 (13) 2,D,2N 2乙酰葡糖胺的双糖单位重复连接构成的线性多糖。不同动物组织和细菌来源的HA 无种属差异, 由不同精制方法获得的HA , 相对分子质量不同, 但也无种属差异。,透明质酸(Hyaluronic acid 简称HA)分子式,透明质酸(Hyaluronic acid 简称HA) 或称醣醛酸,化学方程式示意图,该物质在1934年首次从牛眼玻璃体中分离出来。HA水溶液所形成凝胶的独特网状结构和分子内羟基氢键使其具有极好的保水性和流变特性，因而被广泛应用于医学、化妆品等领域。近年来，国际市场对药用级HA的需求增长很快，而药用级HA要求较高的纯度和分子量。,但目前国内生产HA的20余家企业中，产品能达到药用级要求的并不多。制备HA的方法主要包括从动物组织中分离提取法和微生物发酵法两种，发酵法生产HA由于原料来源丰富、成本低、易形成规模化生产、易获得高分子量HA等特点，正逐步取代从动物组织中分离提取HA的传统方法。,1. 发酵机制,1.1 生产菌种,1.2 生物合成途径,1.3 代谢调节机制,1.4 产物积累机制,1.1 生产菌种,兽疫链球菌（,Streptococcus zooepidemicus,）,该菌在用于生产时有多种变异版本，如兽疫链球菌NW-162，兽疫链球菌ATCC39920等。,1.2 生物合成途径,链球菌属的多种细菌具有荚膜（如兽疫链球菌），这种荚膜的主要成分就是透明质酸。发酵法生产透明质酸就是利用兽疫链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜，再处理发酵液（分离纯化）而得到高纯度的优质的透明质酸 。,HA 在细胞内的合成是一个复杂的过程,有多种酶的参与,包括己糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸(UDP) 2葡萄糖焦磷酸化酶、UDP2葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP2,N,2乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶等。其中HAS 是HA 合成途径中的关键酶。,HAS包含7 个结构区域,即2 个UDP2底物结合部位、2 个HA2单糖2UDP 供给部位、2 个糖基转移酶催化位点和1 个协助HA 糖链跨膜的结构域。其中,2 个糖基转移酶催化位点分别具有将UDP2GlcUA 和UDP2GlcNAc 连入HA 糖链还原端的活性。,合成HA 的过程中,糖链还原端的最后一个单糖残基携带UDP 基团,并结合在这种底物单糖的HA2单糖2UDP 结合部位上;在相应的糖基转移酶催化位点上,底物结合位点上的,UDP2单糖以共价键形式与糖链末端单糖连接,并将原糖链还原端的UDP 基团释放。,还原端UDP2单糖残基已经改变的糖链进行移位, 运动到另外一个HA2单糖2UDP 供给部位;然后另一个UDP2底物结合部位和相应的UDP2单糖转移酶催化位点发挥活性,连入新UDP2单糖,糖链再变换HA2单糖2UDP 供给部位;依次循环,不断地将UDP2GlcNAc 和UDP2GlcUA 连入糖链的还原端,延长糖链。,每合成二糖单位1 moL ,消耗腺苷三磷酸(ATP) 5 moL、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 2 moL和乙酰辅酶A 1 moL。在游离糖链还原端不断延长的同时,糖链被挤压到细胞膜外侧,HA 糖链合成到一定长度,还原端与HAS 分离,分泌到胞外或细菌荚膜中。,1.3 代谢调节机制,HA 在细胞内的合成是一个复杂的过程,有多种酶的参与,包括己糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸(UDP) 2葡萄糖焦磷酸化酶、UDP2葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP2,N,2乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶等。其中,透明质酸合酶(hyaluronic acid synthase ,HAS)是HA 合成途径中的关键酶。,1.4 产物积累机制,发酵过程中溶解氧控制在30% 饱和度左右时, 代谢副产物积累量较少, 有 利细胞生长和代谢产物HA 的积累, 而且也最为经济; 􀀁,有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前体物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于透明质酸的合成。,在HA 高密度发酵过程中0 30 h调pH 7. 2, 发酵后期调pH 6. 8。通过采用不同发酵阶段调节pH 值, 前中期有利于菌种的生长繁殖, 后期有利于目的产物的积累（在游离糖链还原端不断延长的同时,糖链被挤压到细胞膜外侧,HA 糖链合成到一 定长度,还原端与HAS 分离,分泌到胞外或细菌荚中），并且减少代谢副产物产生;,2. 发酵过程控制,2.1 发酵工艺流程,2.2 发酵控制要点,2.1 发酵工艺流程,斜面种子摇瓶种子接种发酵培养补料放罐发酵液（加乙醇粗提）粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）过滤（去除杂质）滤液（乙醇沉淀）沉淀物（脱水干燥）成品透明质酸,2.2 发酵控制要点,2.2.1 发酵过程中溶解氧(DO)的控制,发酵液中溶氧低于临界溶氧30%时, 无氧呼吸造成发酵液中乙酸、乙醇含量增高, pH值降低, 抑制细胞生长和产物表达; 当溶氧高于临界溶氧30% 时, 细胞的耗氧速度基本保持不变, 但增加生产成本。所以DO 控制在30% 饱和度时, 有利于细胞生长和HA 的积累。,2.2.2发酵过程中pH的控制,由于菌体在生长过程中产酸使pH 迅速下降,改变菌体的生存环境, 使细胞生物量增长迅速下降。如果在适当的时间调整pH, 使其利于菌体的繁殖,那么就可能延长对数生长期, 提高HA产量。当培养基起始值为7. 2时, 菌体生长最好, 故最适pH 值为7. 2, 而积累最适pH 值为6. 8。所以在发酵条件基本不变情况下, 在发酵前期410 h pH 7. 2, 有利于菌体繁殖。,当菌体培养到1030 h 的发酵中期, 菌体增加速率下降, 生物量转入正常代谢, 耗糖速率加快, HA 生成迅速增加, 耗氧速率加快, 如果pH 过低, 抑制菌体生长, 糖代谢缓慢, 发酵时间延长, 所以调pH 7. 2。在发酵产酸期,菌体完成由增殖型向生产型转化, 随着时间的延长,糖已耗尽, 产酸增加, pH 维持6. 8, 恒温培养36 h,有利于大量积累HA, 降低乙酸等有害物质的积累。,3.产物分离纯化,3.1 工艺流程,3.2工艺要点说明,3.1 工艺流程,总体上分离纯化工艺过程可以概括为如下流程：,发酵液一预处理一分离(初步纯化)一纯化一干燥一成品。,3.2工艺要点说明,3.2.1预处理,预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭,菌、除菌的工艺。对于一些非透明质酸酶缺陷型菌,株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质,酸酶，减少HA分子量的降低。,杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的,杀菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。三氯乙酸可以溶解,细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和,抑制酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用类似，,能够使HA逐渐从细胞膜上脱落，使蛋白质变性,沉淀，并能渗入细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物,质，使HA产品安全性提高。而采用加热进行灭菌，灭菌温度一般为7580。,采用过滤法除去菌体，使用硅藻土作,吸附剂时的滤液浊度和终滤液HA收率优于活性,炭。在HA发酵结束后，发酵液经灭菌，再将发,酵液加入工业乙醇得到HA粗品沉淀，以20 gL,的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以,吸附菌体杂质，在pH值4648的条件下过滤，,滤液在pH值为48时浊度最小，在pH值为46时,蛋白含量最低，蛋白含量和浊度变化趋势随pH值,改变基本一致。过滤法除菌体是物理过程，操作简,便，效果明显，并且容易在工业化生产中应用。,3.2.2分离工艺,3.2.2.1 乙醇分离,除去发酵液中的菌体后，需要将HA分离出来，,这是一个初步纯化的过程。乙醇沉淀是分离各种多,糖常用的一种方法，可以使HA有效脱水、脱色，,从而提高HA产品品质。为了使HA完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常加入浓度为l左,右的NaCl或NaAc以达到适宜的离子强度。乙醇添,加量一般为发酵液体积的2倍。,如果乙醇添加量足够大，HA浓度低至01也可沉淀完全。HA溶液具有较高的黏度，乙醇沉淀时如果HA浓度过高，沉淀趋向于糖浆状而难以分离；如果浓度过低，所需乙醇量偏大，不利于降低成本。,预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前,往往要对发酵液进行稀释，HA常因稀释而浓度较,低，直接采用乙醇沉淀会消耗大量乙醇，而浓缩可,以减少乙醇用量。,3.2.2.2 膜技术分离,膜技术不仅可以用于发酵液的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发酵液中的HA也有一定可行性。采用PVDF材质的膜，对HA发酵液进行错流微滤和超滤，HA浓度在一定的范围内(微滤12 gL，超滤15 gL)，膜工艺可稳定地运行。,3.2.3 纯化工艺,3.2.3.1 季铵盐纯化,氯化十六烷基吡啶(CPC)是一种季铵盐类阳,离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA与CPC复合物解离所需的盐浓度远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化HA的目的。,向HA粗品溶液中加入等体积的质量分数为4的CPC溶液，形成絮状物后静置lh，再离心分离，沉淀溶于15 molL的NaCI溶液中，离心除去不溶物。将乙醇沉淀得到的HA粗品溶于005 molL的NaCl溶液中，加入lCPC，搅拌30 min后静置l h，离心收集沉淀后溶于不同浓度NaCl溶液中，发现NaCl溶液浓度为035 molL时HA纯度和产量较高。,将HA粗品溶于015 motL NaCI中得到025的HA溶液，1倍体积10CPC(溶在015molL NaCI中)加入8倍体积的025的HA溶液中，通过离心分离CPC沉淀，用015 molL NaC!洗涤，得到较纯的HA溶液。采用CPC进行纯化的优点是操作简单，但CPC回收困难，单位价格较高，所以应用成本较高。,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)纯化HA的作,用机制与CPC相似，但成本相对较低。将,初步除去菌体和不溶性杂质的提取液中加入CTAB，通过离心分离沉淀，并用015 molLNaCl洗涤沉淀，浸泡在15 molL NaCI溶液中过夜，CTABHA复合物可解离溶解，最终可得清亮、较纯的HA液体。,用CTAB沉淀法从发酵液中分离HA的方法：,将发酵液稀释至4.5倍，调节pH值至6.5，加入发酵液体积12的CTAB溶液(体积分数为10)，HA的收率可高达97.0，与乙醇法相比，CTAB法HA的收率提高了2.1% 。HA沉淀中杂蛋白的质量分数降低了2.4% 。与CPC法相比成本降低了45.2。可见，采用CTAB法对HA进行分离纯化具有明显优势和很好的应用前景。,3.2.3.2 酶解纯化,加入蛋白酶能够使HA与蛋白质的络合状态解,除，HA更多地游离于溶液中，使其易于纯化。常,用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，链酶蛋白酶,等，链酶蛋白酶对接近糖蛋白质链肽键上的作用效,果优于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶的水解作用不够彻,底，往往需要配以其它酶才能见效。,将除菌体后的上清液加入链酶蛋白酶作用2 h，乙醇,沉淀后再经氯仿除蛋白，HA产量得到了较大幅度的,提高，杂蛋白的含量为28，与采用氯仿三次除,蛋白后的纯度相当。,3.2.3.3 过滤法纯化,过滤法纯化易于实现工业化，能有效滤除菌体和蛋白质，对分子量影响相对要小。,采用过滤法纯化HA的工艺：,方法一：,将HA粗品以20gL的浓度溶于水中，加入硅藻土作为吸附剂，调节溶液pH值至4648，在HA粗品溶液中加入10 gL粗硅藻土和33 gL细硅藻土为助滤剂，用粗硅藻土和细硅藻土预涂层过滤，然后用H乙1型滤板过滤，经过超滤后，将滤液用乙醇沉淀并干燥，得到葡糖醛酸含量达442的HA。,方法二：,将发酵液经过前处理后，以发酵液质量12的混合硅藻土(粗细硅藻土比为15：1)作为过滤助剂，过滤温度为60，pH值为7.0，再配以酒精沉淀、气浮、酒精造粒的后处理工艺，得到的成品透明质酸中葡,萄糖醛酸含量达4639，蛋白质含量仅为0047，相对分子质量为19106 Da。,3.2.3.4 离子交换层析纯化,在进入HA纯化阶段后，离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术往往被采用。与化学方法相比，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构的变化，己经成为分离提取生物大分子的有效方法。离子交换法用于纯化HA的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。,将粗滤后的滤液先后流经阳离子交换树脂和Amberlite IRA900强碱型阴离子交换树脂，杂质吸附在树脂上，HA不被吸附而流出，流出液直接冷冻干燥或减压干燥可得纯度在98以上的HA，其蛋白质含量为03。,选择经组氨酸修饰的强碱型阴离子树脂作为离子交换剂，以增大HA及其所含蛋白质、核酸等各组分与交换剂相互作用的差异，选择氯化钠为洗脱剂，对HA粗品进行离子交换层析，纯化质量收率为58-61，相对分子质量近,10100Da，蛋白质含量为0075。,3.2.3.5凝胶过滤柱层析纯化,凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采用，需,要根据不同分离纯化目的和HA分子量大小选择合,适的分子筛。,采用Sephadex G.25凝胶过滤柱层析分离HA溶液中残留的CPC及其它杂质。将发酵液经过氯仿与正丁醇混合液除蛋白、季铵盐(CPC)复合物沉淀、DEAE纤维素柱层析后制得的样品，配成质量分数为05的溶液，采用Sephadex G-75凝胶过滤柱进行层析纯化，进样量为20 mL，用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度为6mLh，收集洗脱峰并冷冻干燥，HA总收率为5965，蛋白质含量为0075。,关于分离纯化存在的问题,从发酵液中分离纯化HA往往是由多种分离纯,化方法联合完成的，单一的分离纯化方法并不能达,到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存,在一定的局限性。利用氯仿除菌体的方法，菌体沉,淀中夹带较多的HA。HA的回收率低，并且氯仿具,有中等毒性，对环境不好。在乙醇分离法中，乙,醇用量是HA溶液体积的2倍，当用于大规模生产,时处理量非常大，进行乙醇分离的车间及设备要采,取防爆措施，这势必增加了操作的危险性和生产成,本，因此尚需找到一个替代或减少乙醇用量的更好,的方法。,采用壳聚糖、膜技术等分离方法尚在研究阶段，还不够成熟。CPC、CTAB等季铵盐用于直接沉淀发酵液，用量大，成本高也容易引起其它多糖和蛋白质的沉淀，影响产品纯度。酶解纯化法有利于提高HA度，但同时也会将新的蛋白质引入。DEAE,纤维素层析、凝胶过滤柱层析等纯化方法能得到纯度较高的HA，但往往由于成本过高，只适合实验室规模的少量制备。因此，只有根据制备目标选择适宜的分离纯化方法，并对工艺过程进行优化，才能获得高纯度、高分子量的HA。,4.小结,纯度和分子量的高低决定了HA产品国际市场,中的竞争力，下游分离纯化工艺是获得高纯度、高分子量HA的关键环节。从发酵液中分离纯化制得高纯度、高分子量的HA，必须充分考虑工艺条件对HA分子量的影响，根据发酵液的特性和分离纯化方法的特点找到合适的分离纯化工艺路线。,发酵液中HA分离纯化工艺研究的重点将是：对分离纯化方法进行遴选、优化组合，精细化操作，降低生产成本，探索适合于工业化生产的下游分工艺路线，在提高HA纯度的同时尽量保持高的分子量；,提高分离纯化工艺的安全性，操作上的简捷性，缩短生产周期。,参考文献, 1 􀀁 栾向海, 崔龙, 李九菊, 等. 磷钨酸催化合成尼龙酸二 正辛醋 J . 石油化工, 2008, 37( 12): 1302-1305., 2 􀀁 李贵贤, 王晓宁, 司海娟, 等. 凹凸棒石负载磷钨酸催化合成乙酸正 丁酯 J. 分子催化, 2008, 22( 2) : 137-141., 3 􀀁 施介华, 胡玉华, 王桂林, 等. 活性炭负载磷钨酸催化合成己二酸二正丁酯的研究 J. 高校化学工程学报,2007, 21( 2): 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