DNS-Cl末端氨基测定

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,1,、实验对象,2,、实验目的,3,、实验技术,4,、实验意义,胰岛素,N-,末端氨基酸的测定,实 验 二,背景介绍,胰岛素原（,Proinsulin,）一级结构,胰岛素（,Insulin,）一级结构,N,端分析方法,二硝基氟苯法（,DNP,法或,DNFB,法）,丹磺酰氯法（,DNS,法）：,灵敏度最好,苯异硫氰酸,(,酯,),法（,PITC,法、,PTC,法、,PTH,法、,Edman,降解法）,氨肽酶法,DNP,法,2,4-,二硝基氟苯,DNP-,蛋白质,DNP-,aa,Edman,降解法,异硫氰酸苯酯,苯氨基硫甲酰肽,(PTC-,肽,）,苯乙内酰硫脲衍生物,苯乙内酰硫氨基酸,(PTH-,aa,）,DNS,法,5-(,二甲胺基,),萘,-1-,磺酰氯,(DNS-,Cl,),DNS-,Edman,测序法,实验原理,在,碱性条件下，,DNS-,Cl,（二甲氨基萘磺酰氯,）,可以与氨基酸的,游离氨基（,-,氨基）,作用，得到丹磺酰-氨基酸(,DNS-,aa,),，在紫外灯照射下发强烈的黄色荧光；,蛋白质,N,末端的氨基酸具有,-,自由氨基,，因此可以用,DNS,法进行,N-,端氨基酸的测定。,实验原理,DNS-,Cl,与蛋白质,N-,末端的氨基酸自由氨基在弱碱条件下作用，生成,DNS-,蛋白质,，再经酸水解，得到,DNS-N,端氨基酸,；,在酸性条件下，用乙酸乙酯抽提，然后和标准,DNS-,氨基酸一起,层析,，就可以进行肽链,N,末端氨基酸的鉴定。,层析技术的原理,利用混合物中各组分的,物理化学性质,的差异，使各组分以不同程度分布在,两相,中，其中一个是,固定相,，另一个是,流动相,。当,流动相流经固定相时，由于各组份随流动相前进的速度不同，从而达到分离。,层析技术分类,分配层析,凝胶层析,离子交换层析,亲和层析,高效液相层析,聚酰胺薄膜,聚酰胺是由,己二酸与己二胺,聚合而成或由,己内酰胺,聚合而成的高分子化合物；含有大量酰胺基团，其,羰基,可,与含羟基的物质,形成,氢键,，而产生吸附作用。,聚酰胺薄膜层析的原理,聚酰胺薄膜层析,是指样品溶液随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子形成,氢键,的能力不同，致使,吸附能力,不同；,选用合适的展层剂，使被分离的物质在,溶剂,和,聚酰胺薄膜表面,的,分配系数,有较大的差异，经过,吸附与解吸,的过程，而将各组分分离；,聚酰胺薄膜层析灵敏度高，操作方便，速度较快。,溶剂前沿,层析点,原点,B,A,物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用,R,f,值来表示的。在一定的条件下某种物质的,R,f,值是常数。,R,f,原点到层析斑点中心的距离,A,原点到溶剂前沿的距离,B,结果记录：比移值,Rf,实验方法,DNS-,胰岛素的制备,1,0.1ml,胰岛素,+,0.1ml DNS-,Cl,丙酮（摇匀、封口）,电吹风热风蒸发除去丙酮，加,0.2ml 6M,HCl,，封口后于,110,烘箱中水解,22h,40,保温,1.5-2h,乙酸乙酯抽提，上层液用于层析,倒入,5ml,小烧杯，煤气加热蒸发盐酸，加少量蒸馏水，并用,0.1M,HCl,酸化至,PH2,2.5,0.5ml,标准氨基酸,+,0.5ml DNS-,Cl,丙酮溶液（摇匀、封口）,DNS-,标准氨基酸的制备,2,电吹风热风蒸发除去丙酮，,0.1M,HCl,酸化至,PH2,2.5,40,水浴,0.5h,乙酸乙酯（约,500ul,），摇匀，分层后用毛细管吸取上层液用于层析,在聚酰胺薄膜距边线,1cm,处，用铅笔,标记,3,个点；,毛细管点样标准品,3,次，胰岛素样品,3,次，直径,不超过,2mm,，每次点样都要电吹风,冷风吹干,；,放入层析缸展层剂中展层（时间大约,6-10m,），完毕后电吹风,冷风吹干,。,DNS,氨基酸的层析,3,在紫外灯,360nm,下检测实验结果，,画出图谱，计算,Rf,值,。,比较胰岛素的,DNS-N,末端氨基酸和标准,DNS-,氨基酸的层析图谱，从而,确定蛋白质样品的,N-,末端氨基酸种类,。,胰岛素,N-,末端氨基酸的确定,4,试剂,器材,0.2M NaHCO,3,2.5mg/ml DNS-,Cl,丙酮溶液,0.1M,和,6M,HCl,展层剂苯：冰醋酸,=9:1(V/V),乙酸乙酯,标准的苯丙氨酸和甘氨酸溶液,胰岛素（,0.2M NaHCO,3,配成）,聚酰胺薄膜,层析缸、毛细管、小指管,紫外检测仪、电吹风,PH,试纸,