10第十章 高效液相色谱法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第,10,章,液相色谱法,内容提要,基本原理,经典液相色谱法,高效液相色谱法,高效液相色谱仪,2,基本原理,van Deemter,方程,3,液体的,D,m,比气体小得多,基本原理,van Deemter,方程,4,基本原理,van Deemter,方程,5,静态流动相传质阻抗,基本原理,van Deemter,方程,6,基本原理,van Deemter,方程,7,基本原理,液相色谱法,经典液相色谱法,高效液相色谱法（,HPLC,）,超高效液相色谱法（,UPLC,）,8,基本原理,9,内容提要,基本原理,经典液相色谱法,高效液相色谱法,高效液相色谱仪,10,液,-,固吸附柱色谱法,吸附剂,硅胶,分离,酸性和中性物质,氧化铝,碱性,氧化铝,分离,碱性和中性物质,酸性,氧化铝,分离,酸性物质和对酸稳定的中性物质,中性,氧化铝,分离,在酸、碱中不稳定的物质,聚酰胺,分离,易形成氢键的物质,大孔吸附树脂,应用广泛,11,薄层色谱法,12,薄层色谱法,操作步骤,制板,点样,展开,检视,定性定量,13,比移值,比移值,R,f,：吸附剂对组分的吸附力极强,：吸附剂对组分不吸附,的可用范围,0.2,0.8,，最佳范围,0.3,0.5,相对比移值,R,r,14,边缘效应,定义,同一组分在同一薄层板上，处于边缘的斑点的,R,f,大于处于中心的斑点的,R,f,的现象,产生原因,展开缸空间未被溶剂蒸气饱和，在展开过程中极性较弱或沸点较低的溶剂在薄层板的边缘较易挥发，造成边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，,R,f,相应增大,解决办法,预饱和,：用展开剂将展开缸及薄层板预先饱和后再进行展开,15,分离条件的选择,综合考虑,被分离组分,吸附剂,流动相,一般原则,分离极性,大,的物质，选择吸附能力,弱,的吸附剂、极性,大,的流动相,分离极性,小,的物质，选择吸附能力,强,的吸附剂、极性,小,的流动相,16,分离条件的选择,17,硅胶的活性与含水量,硅胶的吸附中心,SiOH,硅胶失活,SiOH,H,2,O,18,硅胶含水量,/%,活性级数,氧化铝含水量,/%,0,0,5,3,15,6,25,10,38,15,被分离组分和展开剂的极性,被分离组分的极性,基本母核相同，基团的极性越强，分子的极性越大,双键越多，极性越大,基团的空间排列对极性也有影响,烷烃,烯烃,醚,酯,酮,醛,巯基,胺基,酰胺,醇,酚,羧酸,流动相的极性,石油醚,环己烷,四氯化碳,苯,甲苯,乙醚,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇,流动相极性,液,-,固吸附色谱法,正相液,-,液分配色谱法,反相色谱法,固定相极性,流动相极性,反相液,-,液分配色谱法,20,检视方法,有色物质,直接在可见光下观察,硅胶,H,（不含黏合剂的硅胶），铺板时另加黏合剂,CMC-Na,硅胶,G,（含煅石膏黏合剂）,无色但有紫外吸收的物质,使用荧光薄层板，在紫外灯下观察,硅胶,HF,254,、硅胶,HF,360,、硅胶,GF,254,、硅胶,GF,360,无色且无紫外吸收的物质,显色反应,21,内容提要,基本原理,经典液相色谱法,高效液相色谱法,高效液相色谱仪,22,高效液相色谱法特点,23,高压,高效,高灵敏度,分析速度快,流动相选择范围广,应用范围广：,70%-80%,有机化合物,三高一少两广,高效液相色谱法类型,24,分类,按分离机制,键合相色谱,正相键合相,反相键合相,反相离子抑制,反相离子对,手性色谱,亲和色谱,按实验目的,分析色谱,制备色谱,化学键合相色谱法,化学键合相,用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上形成的固定相,25,化学键合相色谱法,反相化学键合相色谱法,固定相：十八烷基（,C18,、,ODS,）键合相,流动相：水,+,有机溶剂（甲醇、乙腈、四氢呋喃）,分离机制：疏溶剂理论（溶质与极性分子的排斥力）,极性大的组分先流出,流动相极性增大，,K,增大，,洗脱能力降低，,t,R,增大,应用最广：分离非极性至于中等极性的分子型化合物,正相化学键合相色谱法,固定相：氰基（,CN,）或氨基（,NH,2,）键合相,流动相：正己烷,+,其他有机溶剂（氯仿、乙腈、醇）,分离机制：范德华力的定向作用、诱导力、氢键作用,极性大的组分后流出,流动相极性增大，,K,减小，,洗脱能力增加，,t,R,减小,氨基键合相：主要用于糖类物质的分离分析,26,化学键合相色谱法,反相,离子对色谱法,方法：流动相中加入离子对试剂,机理：待测组分离子与离子对试剂（反离子）生成中性离子对,适用对象：,p,K,a,8,的碱,离子对试剂：十二烷基磺酸钠（碱性试样）、四丁基氯化铵（酸性试样）,反相,离子抑制色谱法,方法：流动相中加入少量弱酸、弱碱或缓冲盐,机理：抑制组分解离，增加其在固定相中的溶解度,适用对象：,p,K,a,3,7,的弱酸 或,p,K,a,7,8,的弱碱,pH,调节范围：,28,27,颗粒细而均匀,耐高压（基体常用刚性,SiO,2,）,常用固定相和流动相,28,固定相总体要求,常用固定相和流动相,29,液,-,固吸附色谱固定相,具有吸附活性的吸附剂：硅胶、氧化铝、多孔微球、分子筛、聚酰胺等,硅胶：,无定形全孔,-YWG,，,5-10,m,，载样量大，柱效高,球形全孔,-YQG,，,3-10,m,，载样量大，柱效高，涡流扩散小，渗透性好,堆积硅珠,-YQG,，,3-5,m,，载样量大，传质阻抗小,高分子多孔微球,常用固定相和流动相,30,键合相色谱固定相,类型：,Si-O-Si-C,型,性能指标：,覆盖率,-,决定分离机制（分配、吸附）,封尾（封端）：减少残存硅羟基,-,三甲基氯硅烷（,TMCS,）、六甲基二硅胺（,HMDS),含碳量（,C%,）,-,高、中、低,优点：不流失、稳定性好、载样量大、适于梯度洗脱,类型：按固定液与载体（全多孔硅胶）结合类型分,Si-O-C,Si-N,Si-C,Si-O-Si-C,化学性质稳定,粘度小（传质快、柱压低）,纯度高,沸点低,适应性好,常用甲醇,-,水或乙腈,-,水体系,常用固定相和流动相,31,流动相要求,等度洗脱与梯度洗脱,等度洗脱,用恒定配比的流动相进行洗脱,适合于组分数目较少、性质差别不大的样品,梯度洗脱,在一个分析周期内，按一定程序，不断改变流动相的浓度配比进行洗脱,可以使复杂样品中性质差异很大的组分，在各自适宜的容量因子下分离，改善分离效果和峰形,32,内容提要,基本原理,经典液相色谱法,高效液相色谱法,高效液相色谱仪,33,仪器组成,34,高压输液系统,进样系统,色谱柱分离系统,检测器,数据处理系统,35,主要部件及功能,36,输液系统,高压输液泵,核心,贮液罐,在线过滤器,梯度混合装置,在线脱气装置,输液系统,37,高压输液泵,类型,恒流泵：螺旋注射泵、,往复柱塞泵,恒压泵：气动放大泵,性能,流量稳定,流量范围宽,输出压力大,液缸容积小、适于梯度洗脱,密封性好、耐腐蚀,输液系统,38,贮液罐,玻璃或塑料,溶剂,0.5-2.0L,无色或棕色,在线微孔滤头,等度洗脱与梯度洗脱,等度洗脱,用恒定配比的流动相进行洗脱,适合于组分数目较少、性质差别不大的样品,梯度洗脱,在一个分析周期内，按一定程序，不断改变流动相的浓度配比进行洗脱,可以使复杂样品中性质差异很大的组分，在各自适宜的容量因子下分离，改善分离效果和峰形,39,输液系统,输液系统,40,梯度洗脱装置,方式：低压梯度（外）、高压梯度（内）,低压梯度,-,比例阀常压混合、高压泵输出流动相,四元泵,只需一个高压输液泵,计算机控制比例阀,溶剂混合易产生气泡，需在线脱气,高压梯度,-,高压泵按设定比例分别输送流动相,输液系统,41,脱气装置,气泡影响：,损坏泵,影响检测器灵敏度,影响基线（稳定性、飘移）,形成鬼峰,方式：,在线脱气,离线脱气,进样器（六通阀）,42,43,进样器（六通阀）,Load,Inject,检测器,通用型检测器,蒸发光散射检测器（,ELSD,）,可用于挥发性低于流动相的任何样品组分,示差折光检测器（,RID,）,主要用于糖类的检测,44,检测器,专属型检测器,紫外检测器（,UVD,）,可变波长检测器（选择,作为检测波长）,光电二极管阵列检测器（,DAD,）,荧光检测器（,FD,）,45,DAD,46,检测器,通用型检测器,蒸发光散射检测器（,ELSD,）,用于挥发性,小,于流动相的样品组分,特别适于梯度洗脱,荧光检测器（,FLD),适用于能发出荧光或可衍生化产生荧光物质的检测,示差折光检测器（,RID,）,主要用于糖类检测,不适于梯度洗脱,47,ELSD,48,减少柱外死体积,填料细而均匀,低粘度溶剂,低流速,高效液相色谱条件选择,49,提高柱效,减小柱内展宽,减小柱外展宽,高效液相色谱条件选择,50,改善分离度,加入调节剂,加入改性剂,梯度洗脱,