实验四农杆菌转化烟草和拟南芥

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/7/19,#,单击此处编辑母版标题样式,实验,四、,农,杆菌转化烟草和拟南芥,Arabidopsis thaliana,Nicotiana tabacum,1,选择标记基因与报告基因,必备条件：,编码一种不存在于正常植物细胞中的酶,基因较小,能在转化体中得到充分表达,检测容易，并且能定量分析,选择标记基因与筛选标记基因：,npt-II,新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，,G418,），,aat,（链霉素，壮观霉素），,spe,（壮观霉素），,strl,（链霉素），,cat,（氯霉素），,bar,（草苷膦）,报告基因：,report gene,（筛选标记之一）,在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的,DNA,顺序（基因）是否能在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。,gus,基因（,-,葡萄糖苷酸酶基因），,gfp,（绿色荧光蛋白基因）,转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。,2,植物基因转化受体,高效稳定的再生能力,较高的遗传稳定性,具有稳定的外植体来源,对选择性抗生素敏感,对农杆菌侵染有敏感性,植物基因转化受体系统类型：,愈伤组织再生系统,直接分化再生系统,原生质体再生系统,胚状体再生系统,生殖细胞受体系统,3,植物遗传转化方法,植物遗传转化,农杆菌介导法,基因枪法,PEG,诱导原生质体,电穿孔法,操作简单，易造成原生质体损伤,双子叶植物,无宿主限制，技术限制,原生质体培养,4,转基因方法,农杆菌侵染法,基因枪法,5,农杆菌侵染法,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,对单子叶植物不敏感,根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有,Ti,质粒和,Ri,质粒，其上有一段,T-DNA,，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将,T-DNA,插入到植物基因组,中,。,6,T-DNA,整合植物基因组的分子机理,T-DNA,在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。,插入位点特点：,T-DNA,优先整合到转录活跃的植物基因位点,T-DNA,与植物,DNA,连接处富含,A-T,碱基对,植物,DNA,上的插入靶位点与,T-DNA,边界序列有一定程度的同源性。,但在,T-DNA,的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，,T-DNA,的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。,总之，,T-DNA,的整合是通过植物靶,DNA,和,T-DNA,间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有,DNA,顺序的转换和重复。,7,真空浸透法转化拟南芥,受体材料,拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前一天去除已开花蕾和果荚,接种,接种含有表达载体的农杆菌,GV3101,克隆于,5 mL YEP,液体培养基,(Rif 100 g/mL,，,Kan 50 g/mL),中，,28 C,，,200 rpm,振荡培养过夜,活化,将过夜培养的菌液按照,1:100,的比例转接到,50 mL,新鲜配制的,YEP,液体培养基,(Rif 100 g/mL,，,Kan 50 g/mL),中，,28 C,，,200rpm,振荡过夜培养至菌液,OD600,为,1-2,诱导,收集菌体，重悬于浸染缓冲液,(1/2MS,，,5%,蔗糖，,0.015% Silwet L-77),，将菌液稀释至,OD600,为,0.6-0.8,转化,将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，,0.5Mbar,抽真空,10 min,培养,将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。,12 d,后去除塑料膜，培养至种子成熟,8,农杆菌侵染瞬时转化烟草,接种,接种含有表达载体的农杆菌,GV3101,克隆于,5 mL YEP,液体培养基,(Rif 100 g/mL,，,Kan 50 g/mL),中，,28 C,，,200 rpm,振荡培养过夜,活化,将过夜培养的菌液按照,1:100,的比例转接到,50 mL,新鲜配制的,YEP,液体培养基,(Rif 100 g/mL,，,Kan 50 g/mL),中，,28 C,，,200 rpm,振荡培养至菌液,OD600,为,1-2,诱导,5000 rpm,离心,5 min,收集菌体，重悬于浸染缓冲液,(1/2MS,，,5%,蔗糖，乙酰丁香酮,120mol/L),，将菌液稀释至,OD600,为,0.6-0.8,侵染,烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染,10,min,后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（,MS+5%,蔗糖,+,乙酰丁香酮,120mol/L,）上（,252,）暗培养条件下培养,2d,。,9,注射法瞬时转化烟草,受体材料,种植本生烟,(,Nicotianabenthamiana,),：,25 C,，,16 h,光照，约一个月后可用；在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；,接种与活化,小量培养农杆菌,16-24 h,；按,1:100,转接到培养液,(5 mL YEP,，,100 M,乙酰丁香酮,(Aldrich),，,10 mM MES(pH 5.6),，,Rif 100 g/mL,，,Kan 50 g/mL,）中，,28 C16-24 h,诱导,当菌摇到,OD6001.0,时，,5 000 rpm 10 min,收集菌体，用溶液,(5 ml 10 mM MgCl2,，,7.5 L 100 mM,乙酰丁香酮,),重悬农杆菌至,OD6001.0,，室温静置至少,3 h,侵染,用,1 ml,注射器注射烟草叶片，避光培养约,48 h,后，,Gus,染色观察,10,乙酰丁香酮,Vir,区基因的活化直接调控着,T-DNA,的转移，酚类化合物对,Vir,区基因的活化具有重要作用。,乙酰丁香酮,（,Acetosyringone,，分子式,:HOC6H2(OCH3)2COCH3,）,AS,：,遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌,Vir,基因活化，从而促进外源基因的整合。,使用方法：,在侵染前,4-6h,加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于,vir,基因高度活化状态，从而提高侵染能力,悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入,加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着,16h,后才能进行转化,在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入,AS,11,Silwet L-77,拟南芥,、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国,GE,公司，,Silwet-L77,高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力,(,水的表面张力为,72.4mN/m,，,0.1%,的,Silwet-L77,系列有机硅溶液的表面张力约为,21mN/m),这使,Silwet-L77,有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面,.,同时，,Silwet-L77,有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。,Silwet-L77,是拟南芥及其它作物常用的,转基因用表面活性剂,。,12,植物瞬时表达系统,当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达（,transientexpression,）和稳定表达（,stable expression,）两种。,在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源,DNA,和宿主细胞染色体,DNA,并不发生整合。这些,DNA,一般随载体进入细胞后,12,小时内就可以表达，并持续约,80,小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的,DNA,整合到细胞染色体,DNA,上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转化细胞。,植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。,13,Gus,基因,gus,基因来源于,E.coli,染色体上的,uid,A,位点。编码,-,葡萄糖苷酸酶。,-,葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以,-,葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。,根据,gus,基因检测所用的底物不同，检测方法有：组织化学法、分光光度法和荧光法。,14,操作要点,侵染烟草叶片无菌操作注意事项,抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验,新鲜的叶片转化效率高,侵染前去除拟,南,芥已开花和果荚,侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长,侵染后共培养一般为暗培养，,12d,，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。,15,实验报告,实验目的,实验原理（简略写）,实验方法,实验结果及分析（最重要）,思考题（最后一次课给）,切勿相互抄袭，支持原创，如有雷同后果自负！,16,