戴安HPLC基础知识

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Thrid Level,液相色谱基础知识,液相色谱理论发展简况,色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。,色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。,液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。,色谱起源,石油醚,碳酸钙颗粒,色素,玻璃柱,经典液相色谱,色谱分离的机理,分离是一个物理的过程,流动相（Mobile Phase）,固定相（Stationary Phase）,样品（溶解于流动相中的溶质）,色谱法分类,按两相的物理状态分：,气相色谱法(GC)、 液相色谱法(LC)和超临界流体色谱法(SFC) 。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。超临界流体色谱法以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。,按原理分：,吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛) 、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。,按操作形式分：,纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法,HPLC的特点和优点,HPLC有以下特点：,高压：压力可达150,300Kg/cm,2,。,高速：流速为0.1,10.0 mL/min。,高效：可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。,高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。,HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：,速度快：通常分析一个样品在15,30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。,分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。,灵敏度高：紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg,柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物。,样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,什么是高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱法，简称：HPLC,是利用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，按照固液相之间的分配机理对混合物进行分离测定的色谱方法。,广泛应用于各个领域：,医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业,在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,HPLC在药学中的应用,含量测定,（最普遍应用）,还包括有关物质检测，杂质/有害物质限量检测。,指纹图谱检测,主要用于中药注射剂。,鉴别,与薄层鉴别类似，被测物质与对照品具有相同保留时间相当于具有相同Rf值，即初步认为同一物质。,纯度检测,通常用面积归一化法检测对照品纯度。,分离纯化样品或制备对照品,（仅限制备型色谱）,高效液相色谱仪器介绍,HPLC的仪器配置,色谱泵,自动进样器,柱温箱及色谱柱,检测器,数据处理系统,溶剂,液相,色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,输,液系统,分离系统,检测系统,记录系统,A,E,G,B,C,D,F,进样阀,进样系统,P680A色谱泵前面板,屏,幕,光,标,键,高,低,压,极,限,显,示,直,接,操,作,键,泵,开,关,键,功,能,键,遥,控,状,态,显,示,流速显示,压力显示,P680A,色谱泵内部结构,混合腔,真空脱气泵,(,在线脱气,),压力传感器,蠕动泵,清洗瓶,一般为,50,甲醇，每周更换一次,清洗阀,比例阀,进口单向阀,出口单向阀,泵,工作泵头,平衡泵头,压力传感器,混合腔,清洗阀,真空脱气泵,比例阀,废液,P680A LPG流路图,低压四元剃度泵（只有一个泵，四个通道，溶液泵前混合）,需配在线脱气机，因为容易形成气泡,P680 HPG流路图,工作泵头,平衡泵头,压力传感器,混合腔,清,洗,阀,高压二/四元剃度泵（有二个泵，二/四个通道，溶液泵后混合）,无需配在线脱气机，因为不容易形成气泡,溶剂选择阀,六通阀,结构,六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。,工作原理,手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,六通阀进样演示,单击NEXT播放,如无法播放动画，请安装shockwave flash object控件,高效液相色谱基本概念,色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）,色谱图,即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,色谱峰,保留时间（min）,峰高,峰面积,响应值（mAU）,基线,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak,色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线,峰底 Peak Base,峰的起点与终点之间连接的直线,峰高 Peak Height,峰最大值到峰底的距离,峰宽 Peak Width,在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离,半（高）峰宽 Peak Width at Half Height,通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰面积 Peak Area,峰与峰底之间的面积,又称响应值,标准偏差； Standard Error,0.607倍峰高处所对应峰宽的一半,拖尾峰 Tailing Peak,后沿较前沿平缓的不对称峰,前伸峰 Leading Peak,前沿较后沿平缓的不对称峰,鬼峰 Ghost Peak,并非由试样所产生的峰；亦称假峰,液相色谱图相关术语,基线 Baseline,在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线,基线飘移 Baseline Drift,基线随时间定向的缓慢变化,基线噪声；N Baseline Noise,由各种因素所引起的基线波动,谱带扩展 Band Broadening,由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,液相色谱图相关术语,死时间，t,0, Dead time,不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间,保留时间，t,R, Retention time,组分从进样到出现峰最大值所需的时间,死体积，V,0, Dead volume,不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,保留体积，V,R, Retention volume,组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,液相色谱的基本参数（色谱条件）,流动相：种类及配比，等度或梯度,有机相：甲醇、乙腈。,水相：水（+改性剂）。,改性剂（防止拖尾，获得更好的分离度和峰型）,酸（0.4磷酸/醋酸溶液）：分离有机酸；,碱（0.1二乙胺/三乙胺）：分离生物碱；,缓冲盐（HAc-NaAc，H,3,PO,4,-NaH,2,PO,4,）：当加酸加碱无法获得更好,的分离效果时，考虑加适当缓冲盐，让其以盐类形式存在。,色谱柱/固定相：,填料类型C18（Kromasil，Diamonsil，Hypersil）；,粒径：5m；内径：4.6mm；,长短：250mm、200mm、150mm。,流速：,通常为1mL/min。,测定波长：,检测波长通常选择其最大吸收波长，200380nm（紫外区）。,柱温：,常设值：25、 30、 40。,进样量：,通常为10或20L,HPLC基本操作过程,准备,过滤流动相，并超声脱气1020min。,打开泵，柱温箱，检测器（平衡30min后）和计算机电源，并设定流动相及比例，柱温。,启动工作站、平衡系统、采集基线,分析,建立样品表：依次设置对照品样品信息（样品名称、样品数、进样针数、进样量）；采集程序；积分方法；报告模板，序列名称。,修改色谱条件：打开程序文件，修改柱温、流动相比例、测定波长、运行时间等,运行样品表：进样测定。,设置相关参数：在样品表中输入取样量、稀释因子等进样信息，并设置积分参数（最小峰面积、积分时间等），设置峰表（主峰保留时间和名称），定量方式（峰面积或峰高），对照品浓度等信息，自动计算含量。,报告输出。,关机,使用完毕，先关紫外/可见灯，再关检测器。,以适当溶剂冲洗色谱柱、进样器、进样针。确保冲洗干净后关闭电源。,登记使用记录。,此为基本操作过程，详见标准操作规程。,系统适应性实验,系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统进行试验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作适当的调整。,理论板数n,主要考察柱效，药典通常要求不低于3000或4000。,分离度R,主要考察相邻色谱峰的分离效果， R应大于1.5 。,拖尾因子T,主要考察峰对称性，峰高定量时T应在0.951.05间，峰面积定量可适当放宽至0.81.2。,重复性,主要考察测量的精密度。取对照品溶液，连续进样5次，峰面积RSD应不大于2。,分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数,理论板数、分离度、拖尾因子一般工作站均可自动计算。,系统适应性实验,理论板数（n）考察柱效,在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的对照物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间,t,R,（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(,W,h/2,),按下式计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。,式中:,t,R,为保留时间；,W,h/2,为半峰高处的峰宽；,系统适应性实验,分离度（R） 考察分离效果,在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定，分离度应大于1.5。,式中:,t,R2,为相邻两峰中后一峰的保留时间；,t,R1,为相邻两峰中后一峰的保留时间；,W,1,及W,2,为此相邻两峰的峰宽。,系统适应性实验,拖尾因子（T）考察色谱峰对称性,考察色谱峰的对称性，保证测量的准确度。特别是采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.951.05之间。,式中:,W,0.05,h,为5峰高处的峰宽；,d,1,为峰顶点到峰前沿之间的距离。,系统适应性实验,重复性 考察测量的精密度,取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0。,含量测定方法学考察,1. 提取纯化方法考察,提取方法：,超声、索氏、回流、渗漉、浸渍等,纯化方法：,液-液萃取、固相萃取、大孔树脂、中性氧化铝、聚酰胺等,2. 色谱/测定条件选择,检测波长的选择：,检测波长通常选择其最大吸收波长。,色谱柱选择：,填料选择：,Kromasil、Diamonsil、Hypersil,柱长选择：250mm、200mm、150mm,流动相种类选择：,有机相选择：甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（有机相增加，峰前移）,水相选择：分离皂苷类等中性化合物可直接用水,分离有机酸等酸性化合物加酸,(,磷酸、醋酸,),并可调节pH值,(,0.1、0.5%,),分离生物碱等碱性化合物加碱,(,二乙胺、三乙胺,),，一般采用0.1%浓度,流动相配比选择：,等度洗脱：如甲醇-水（1288）,剃度洗脱：如乙腈-0.1磷酸，0min，6545；20min，8020；40min，955,柱温选择：,25、 30、 40等（柱温增加，峰前移）,3. 标准品纯度考察,采用面积归一化法，应大于98。,检测波长选择实例,没食子酸紫外吸收图谱,检测波长通常选择其最大吸收波长,测定波长,参比波长2：Off,参比波长1：300nm,响应值1,响应值2,由于很多成分在低波长均具有紫外吸收，故为避免干扰，通常不宜选低波长做测定波长,含量测定方法学考察,4. 线性实验,绘制标准曲线，确定线性范围,(,回收率中高浓度组不能超过这个范围,),5. 精密度实验,取同一样品或对照品，连续测定五次，峰面积RSD不得大于3。,6. 重复性实验,取同一批号样品，按样品测定方法操作，测定五份，样品含量RSD不得大于3 （由于每份样品取样量不同，故应计算含量的RSD） 。,7. 稳定性实验,取同一样品， 分别于制备后0、2、4、8、12、24、36h测定，峰面积RSD不得大于3。（通常考察36h内的稳定性）,8. 回收率实验,取同一样品， 分别添加高、中、低三组浓度对照品（每组三份），测定峰面积，并计算回收率，回收率应在95105间，RSD不大于5。操作复杂的特殊样品要求在90110 。,高、中、低三组浓度与样品含量之比约为：1.2、1、0.8,含量测定,外标法,按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：,由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量或或自动进样器进样为好。,外标一点发为最常用的定量计算方法。,式中:,C,为,浓度，,A,为峰面积；,X,为供试品，,R,为对照品。,内标法,按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：,式中:,C,为,浓度，,A,为峰面积；,S,为内标物，,R,为对照品。,再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：,式中:,C,为,浓度，,A,为峰面积；,S,为内标物，,X,为供试品。,加校正因子的主成分自身对照法,测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作较正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。,测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的1025或其峰面积能准确积分通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。,不加校正因子的主成分自身对照法,当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。,若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图，再记录等体积纯溶剂的色谱图。色谱图上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。,面积归一化法,由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。,常用于考察对照品含量是否达到98。,HPLC含量测定应用实例,黄金咽喉片中绿原酸的含量测定,黄金咽喉片是由黄花蒿、金银花、青果、乌梅、甘草和薄荷等多味中药提取的有效部位及有效成分组成的复方制剂。实验采用HPLC测定金银花所含的主要有效成分绿原酸 。,色谱条件,色谱柱：Dikma Kromasil C,18,（250 mm4.6 mm，5,m）；,流动相：甲醇0.4磷酸溶液（2674）；,检测波长：326 nm；,柱温：30；,流速：0.8 mL,min,-1,；,进样量：10,L。,HPLC含量测定应用实例,试液的制备,对照品溶液,绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50甲醇制成每1 mL含绿原酸80,g的溶液，即得。,供试品溶液,取重量差异项下的本品20片，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50甲醇50 mL，称定重量，超声处理45 min，取出，放冷，再称定重量，用50甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。,阴性对照溶液,取按处方比例及制备工艺制得不含金银花提取物的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。,系统适应性试验,分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺金银花提取物的阴性对照溶液各10,L，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见下图。从图中可见，绿原酸的保留时间约为10.5 min，绿原酸峰与其前后色谱峰的分离度分别为3.78、4.27，拖尾因子为1.02，理论塔板数以绿原酸峰计为9313，绿原酸峰纯度因子为1000，阴性对照在绿原酸峰处无干扰，即本试验条件下绿原酸与其它组份分离完全。,HPLC含量测定应用实例,A B C,A. 绿原酸对照品；B. 供试品；C. 阴性对照；1. 绿原酸,测定法,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10uL，按上述色谱条件测定，记录绿原酸的峰面积，并按外标法计算绿原酸的含量。,结果：绿原酸峰面积供试品为：30.1562，对照品为：28.6288,HPLC含量测定应用实例,正反相色谱,液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。,正相色谱法,采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。,反相色谱法,一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。,正相色谱法与反相色谱法比较,从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。,高效液相色谱仪的保养,HPLC的环境设置,HPLC的日常操作条件：温度：10,30；相对湿度80； 最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。,HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：,1 专门的纯水机或超纯水机；,2 去离子水重蒸；,3 二次或三次重蒸水；,4 采用类似家用的纯水机；,5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水，如：娃哈哈纯净水；,6 其它途径；,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。,理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22m的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。,HPLC六通阀进样器的保养,虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。,手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。,六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，如20L的定量环最多进样15L的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20L的定量环最少进样60至100L的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。,HPLC六通阀进样器的保养,可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10L的定量环，实际是9L还是11L并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。,进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45m的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。,泵的保养,使用流动相尽量要清洁；,进液处的砂芯过滤头要经常清洗；,流动相交换时要防止沉淀；,避免泵内堵塞或有气泡；,每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。,色谱柱的保养,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；,当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；,要注意流动相的脱气；,避免使用高粘度的溶剂作为流动相；尽量避免用缓冲盐特别是磷酸盐。,进样样品要提纯；,严格控制进样量；,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；,每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；流动相中含酸、缓冲盐类均应先用甲醇-水（595）冲洗至中性再用甲醇以1mL/min的流速冲洗约20min，若含二乙胺之类可直接用甲醇冲（用水很难冲洗至中性）。,若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。,紫外灯的保养,在分析前、柱平衡得差不多时，再打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。,避免频繁关闭检测器（开关一次氘灯，相当于损失30h的寿命）。,样品池要若受污染可用异丙醇冲洗。,联系方式,毕业设计时有液相相关和药学图像处理相关问题可联系：,