抗体制备技术

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗体制备技术,1,是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。,克隆,(clone),2,1,、多克隆抗体（,p,olyclonal,a,ntibody, pAb,）：用,一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激,机体,多个,B,细胞克隆,产生针对,多种抗原表位,的不同,抗体。所获得的免疫血清实际上是含有,多种抗体的,混合物,。,2,、单克隆抗体（,monoclonal antibodies, mAb,）：由一个,识别一种抗原表位,的,B,细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。,3,抗体的制备技术经历了三代,：,第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（,polyclonal antibody,）；,第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体,(monoclonal antibody, McAb),；,第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体,(genetic engineering antibody),。,4,Ab1,Ab3,Ab4,单克隆抗体,抗原,Ab1,抗血清,Ab1,Ab2,Ab3,Ab4,Ab2,Ab3,Ab4,普通抗血清（多克隆抗体）,脾,B,细胞,骨髓瘤小鼠取腹水,骨髓瘤细胞,HAT,培养，稀释,单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图,杂交瘤细胞,+ PEG,融合,Ab2,5,抗体制备技术,一、多克隆抗体制备,（一）免疫原的制备,（二）免疫动物,（三）免疫血清的纯化,（四）免疫血清的鉴定,（五）免疫血清的保存,二、单克隆抗体制备,（一）单克隆抗体制备原理,6,抗体制备技术,（二）单克隆抗体制备的技术要点,（三）影响杂交瘤技术的因素,（四）单克隆抗体的应用,三、基因工程抗体技术,（一）人源化抗体,（二）小分子抗体,（三）双特异性抗体,（四）抗体库技术,7,多克隆抗体制备,一、免疫原的制备,免疫原,（,immunogen,）指能刺激机体免疫系,统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最,重要的性质是,免疫原性,（,immunogenicity,）,免疫原,天然抗原、人工 合成抗原；,蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；,8,（一）、细胞性抗原制备：,绵羊红细胞（,SRBC,）,-,溶血素；,细菌,-,抗菌抗体（动物免疫血清）,（二）、可溶性抗原制备：,指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化,1,）细胞的破碎（物理法、化学法）,9,反复冻融法,超声破碎法,自溶法,酶处里法,表面活性剂处理法,10,2,）提取与纯化：,超速离心分离,是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。,11,选择性沉淀,选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。,核酸去除,盐析沉淀法,有机溶剂沉淀法,高分子聚合物沉淀法,例：,50%,饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；,8%,12%PEG6000,可沉淀,IgG,。,12,盐析法沉淀抗原的机理,13,超滤法,利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。,层析法,凝胶过滤,离子交换,亲和层析,电泳,（略）,14,凝胶过滤层析,(,分子筛,),的作用机理,15,亲和层析的作用机理,16,3,）鉴定：,鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、,纯度以及免疫学活性。,蛋白的含量,定氮（紫外光,280nm,等）,分子的质量,电泳、质谱,蛋白的纯度,电泳等,免疫学活性,免疫双扩散、免疫印迹,17,抗原性质分析结果,18,（三）半抗原性免疫原的制备,1.,载体选择,常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。,（,1,）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。,（,2,）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。,（,3,）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（,PVP,）、羧甲基纤维素,(CMC),等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。,19,2.,连接方法,半抗原与载体的连接有物理法和化学法。,物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有,PVP,和,CMC,等；,化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。,20,根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类：,带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。,带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、,O-,（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。,带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。,21,（五）免疫佐剂,某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可,增强机体对该抗原的特异性免疫应答,或,改变免疫应答类型,，此类物质称为免疫佐剂,(immunoadjuvant),，简称佐剂。,22,佐剂的种类,佐剂一般包括以下几类：,无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等,生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的,B,亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；,人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（,poly I,：,C,）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（,poly A,：,U,）；,油剂： 如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；,纳米佐剂,23,弗氏佐剂（,Freund,s adjuvant,）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：,前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温,-80,）按,1,：,1,1,：,5,比例混合而成；,后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成,“,油包水,”,乳化液。,24,佐剂与抗原混合乳化的方法：,研磨法,和搅拌混合法两种,25,2.,佐剂的免疫生物学作用,增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；,增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；,改变抗体类型，使产生抗体由,IgMG,型转变为,IgG,型；,引起或增强迟发性超敏反应。,26,3.,佐剂的作用机制,佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：,可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。,佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。,增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。,27,二、免疫动物,为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、注射间隔和接种动物的年龄均与免疫效果密切的关系。,28,1.,免疫动物的选择,选择动物时应考虑以下因素：,抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。,动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。,抗原性质与动物种类。,29,2.,免疫方法,选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。,(1),免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。,30,(2),免疫途径与免疫间隔时间,免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。,免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以,10,20,天为佳，二次后间隔时间一般为,7,10,天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。,31,3.,动物采血,采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。,(1),颈动脉采血法,(2),心脏采血法,(3),静脉采血法,32,图,1,颈动脉分离图,33,三、免疫血清的纯化,1.,特异性抗体的纯化,免疫原不纯，导致产生杂抗体混杂于抗血清中。杂抗体的除去可采用：,(1),亲和层析法,（,2,）吸附法,34,2. IgG,类抗体的纯化,IgG,类抗体的纯化常用方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。,(1),盐析法：硫酸铵盐析常用于,-,球蛋白提取，经三次沉淀后提取的,-,球蛋白大多属于,IgG,。,35,(2),凝胶过滤法,：各种蛋白质成分的分子量大小不同，,在通过凝胶介质时，洗脱速度也不同，从而达到分离目的。,血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法进行，按分子大小可分为三组：第一组包括,IgM,和一些脂蛋白；第二组主要是,IgG,和较少量的,IgA,、,IgD,、,IgE,等球蛋白；第三组主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白等。,36,在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图,(M=IgM, G=IgG, A=IgA),37,(3),离子交换层析法纯化,IgG,IgG,作为一种,-,球蛋白，,在血清蛋白中带电荷较最少，用,离子交换层析法易于分离。,DEAE-Sephadex A-50,是一弱碱性离子交换剂，常用于免疫球蛋白的纯化。,血清中的,-,球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。在,pH7.2,7.4,的环境中,酸性蛋白被,DEAE-Sephadex A-50,吸附，,-,球蛋白不被吸附而得以纯化。该技术纯化,IgG,简便，不损坏抗体结构和特异性。,38,图,3,在,DEAE-,纤维素上人血清蛋白的层析示意图,(M=IgM, G=IgG, A=IgA),39,(4),亲和层析法纯化,葡萄球菌,A,蛋白（,SPA,）或连球菌,G,蛋白具有与,IgG Fc,段结合的能力，可用亲和层析来分离,IgG,。,分离时可采用两种类型的亲和层析柱即,SPA,或,G,蛋白交联至,Sepharose 4B,制成的亲和层析柱。抗血清通过层析柱时，,IgG,被吸附，而非特异性蛋白则未能结合被洗脱除去，然后改变洗脱条件，使,IgG,从层析上解离从而达到纯化目的 。,40,图,4,亲和层析纯化,IgG,基本过程示意图,41,四、免疫血清的鉴定,1.,效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、,ELISA,等方法。,2.,特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法,42,3.,纯度的鉴定：,抗体纯度的鉴定可采用,SDS-,聚丙酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。,IgG,含有重链和轻链，纯,IgG,的,SDS-PAGE,结果应有两条蛋白电泳带（分子量约,53kD,和,22kD,），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。,4.,亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、,ELISA,或,RIA,竞争结合试验等。,43,单抗亲合常数的测定,：,单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：,1,）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；,2,）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的,OD,值作为,OD-100,，找出,OD-50,时的抗体浓度和相应的,pp65,抗原浓度；,3),根据公式,Ka=,n-1,计算,McAb,的,Ka,值。,2(nAbt-Ab t),t,代表测定时的温度；,n=Abt/Abt,；,Abt,表示抗原浓度较高的,Amax,的一半；,Abt,表示抗原浓度较低的,Amax,的一半。,对于单克隆抗体，一般亲合力要求,107L/mol,，好的单抗多大于,109 L/mol,。,44,五、免疫血清的保存,1,、,4,保存（,6,个月）,2,、低温保存（,-70 ,-20 ,，,5,年）,3,、真空干燥保存（,5,10,年）,注意点：保存前需经除菌,保存液含防腐剂,避免反复冻融（分装）,45,第二节 单克隆抗体的制备,Preparation of monoclone antibody,46,单克隆抗体（,McAb,）,是由只识别单一抗原决定簇的,B,细胞克隆产生的同源抗体。,理化性状高度均一,效价高,只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一,具有高度特异性又易于大量制备,47,克隆选择学说的模式图,48,单克隆抗体制备方法：,杂交瘤技术,EBV,技术,49,杂交瘤单克隆抗体,?,通过抗原致敏,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养所形成单克隆杂交瘤细胞克隆，所分泌的针对抗原上某一抗原表位的纯的抗体，具有生物活性单一，理化性质高度均一，产量高等特点。,50,一、杂交瘤技术的基本原理,51,一、,杂交瘤技术的原理及流程,52,53,54,二、单克隆抗体制备技术,主要材料,细胞融合前准备,细胞融合,抗体的初筛和克隆化,杂交瘤细胞冻存与复苏,单克隆抗体的批量生产,单克隆抗体的纯化与鉴定,55,（一）主要材料：,培养液,1.,RPM1640,培养液,FCS 10%,谷氨酰胺,2mmol/L,青霉素,100IU/ml,链霉素,100Ug/ml,2.,DMEM,培养液,56,H,（,Hypoxanthine, H,）次黄嘌呤；,A,（,Aminopterin,）氨基喋呤；,叶酸拮抗物，阻断,DNA,合成主要途径,T (Thymidine, T),胸腺嘧啶核苷；,“,核苷酸前体,”,，供细胞通过替代途径合成,DNA,。,。,HAT,培养基,57,淋巴细胞：在培养液中不能生长，,5-7,天死亡；,骨髓瘤细胞：在培养液中不能生长，,5-7,天死亡；,DNA,合成的主要途径：被,A,阻断；,DNA,合成的替代途径：由于,HGPRT,缺乏，不能利用,H,、,T,而被阻断。,HAT,选择作用,58,PEG,是最常用的细胞融合剂。,PEG,可能的作用机理：,PEG,导致细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合。,PEG,的细胞融合作用完全是随机发生的。一般选用分子量,4000,的,PEG,作为细胞融合剂。不同厂商、批号、分子量的,PEG,，其纯度与毒性有所不同,。,细胞融合剂,59,（二）细胞融合前准备,1.,免疫方案,颗粒性抗原 可溶性抗原,2.,饲养细胞,3.,骨髓瘤细胞,4.,免疫脾细胞,60,常用骨髓瘤细胞系有：,NS1SP2,0X63 Ag8.653,61,62,骨髓瘤细胞系选择要点：,动物品系相同,不产生免疫球蛋白重链和轻链,对,HAT,敏感,融合后产生稳定性高的杂交瘤细胞,63,1,选择对数生长期的细胞进行传代培养，细胞形态应是浑圆、透亮、均一、排列整齐。,2,避免细胞返祖：定期用,8-AG,处理细胞。,切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于,-80,或液氮及干冰中。,培养骨髓瘤细胞,64,1.,细胞融合,2. HAT,选择杂交瘤,(,二,),细胞融合，选择杂交瘤,65,（,三）抗体初筛与克隆化,以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。,常用的方法有,:,1.,ELISA,用于可溶性抗原,(,蛋白质,),、细胞和病毒等,McAb,的检测。,2.,RIA,用于可溶性抗原、细胞,McAb,的检测。,3.,FACS(,流式细胞术,),用于检查细胞表面抗原的,McAb,检测。,66,（四）杂交瘤的冻存和克隆化,1.,克隆化方案,用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。,(1),有限稀释法,(2),软琼脂法,67,2.,杂交瘤细胞的冻存,细胞冻存液,:,50,小牛血清,40,不完全培养液,10,DMSO(,二甲亚砜,),68,（五）单克隆抗体的大量生产,大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：,1.,体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为,10,60,g,ml,，如果大量生产，费用较高。,2.,体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。,69,（,六）单克隆抗体的鉴定,1,.,抗体特异性的鉴定：,2.,McAb,的,Ig,类与亚类的鉴定：,3. McAb,中和活性的鉴定：,4.,McAb,亲和力的鉴定：,70,抗体的纯化：,硫酸铵沉淀,离子交换层析,SPA-sepharose,亲和层析柱分离,71,影响杂交瘤技术的因素,1,、试剂与器材,用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂,2,、培养技术,防止污染，细胞培养的娴熟技能,3,、早期克隆化,避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免,克隆细胞的丢失。,72,第四节 基因工程抗体技术,Genetic Engineering Technique,是指应用,NDA,重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。,基因工程抗体,(,重组抗体,),73,基因工程抗体技术,用,DNA,重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造。,包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备。,用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。,74,一、人源化抗体,1.,将小鼠的,CDR,序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为,CDR,移植抗体。,2.,将小鼠,Ig,基因敲除，转染人,Ig,基因，在小鼠体内产生人,Ab,，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。,75,从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人,Ig,恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人,-,鼠嵌合抗体。,特点：,1.,减少了鼠源性抗体的免疫原性,2.,保留了亲本抗体特异性结合抗,原的能力。,。,1.,嵌合抗体,(chimeric antibody),76,嵌合抗体,(chimeric antibody),77,指利用基因工程技术，将人抗体可变区（,V,）中互补决定簇（,CDR,）序列改换成鼠源单抗,CDR,序列。,重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。,RAb,亦叫,“,重构型抗体,”,，因其主要涉及,CDR,的,“,移植,”,，又可称为,“,CDR,”,移植抗体,，,RAb,的产生和发展，使得多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗，包括通过人体免疫难以诱生的特异性的抗人抗原抗体，因而有诱人的前景。,2.,改形抗体（,RAb,）,78,79,二、小分子抗体,指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。,抗原结合片段（,Fab,）,可变区片段（,Fv,）,单链抗体（,single chain Fv,，,ScFv,）,优点： 分子小，通透性强,原核细胞表达，成本低,不含,Fc,段，不与带,Fc,段受体反应,半衰期短，利于及时清除,80,小分子抗体,81,三、双特异性抗体,（,bispecific antibody,，,BsAb,）,双特异性抗体，双功能抗体,其两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。,82,双特异性抗体（,BsAb,）种类：,（一）化学绞链,BsAb,（二）细胞工程,BsAb,（三）基因工程,BsAb,83,四、抗体融合蛋白,（一）含,Fv,的抗体融合蛋白,（二）含,Fc,的抗体融合蛋白,抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物,。,84,第五节 抗体库技术,噬菌体抗体,噬菌体抗体库,噬菌体抗体技术,85,86,87,从外周血或脾、淋巴结等组织中分离,B,淋巴细胞，提取,mRNA,并逆转录为,cDNA,；,应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过,PCR,技术扩增不同的,Ig,基因片段；,构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有,噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库,(surface display antibody library),常用载体；,表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附,-,洗脱,-,扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。,构建噬菌体抗体库,88,