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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule,第四章 酶的分子修饰,Contents of chapter 4,1、什么是酶分子修饰,2、酶分子修饰的基本要求和条件,3、酶分子的修饰方法（7种方法）,Go,Go,Go,Go,4、酶分子修饰,的,应用,4.1 什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。,即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。,酶分子修饰的意义,酶的结构决定了酶的性质和功能。只要使酶的结构发生某些精细的改变，就有可能使酶的某些特性和功能随着改变。为以下目的对,酶分子进行修饰,提高酶的,活力 activity,增强酶的,稳定性 stability,降低或消除酶的,抗原性 immunological property,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,回本章目录,4.2,酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。,（1）酶的稳定性,热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。,（2）酶活性中心的状况,活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,4.3 酶分子的修饰方法,金属离子置换修饰,大分子结合修饰(共价/非共价),肽链有限水解修饰,蛋白质侧链基团修饰,氨基酸置换修饰,基因突变酶修饰方法,酶分子的物理修饰,第一节,酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方 法称为金属离子置换修饰。,用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。,金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶。,酶金属离子对酶的影响,从酶分子中除去其所含的金属离子，往往会丧失催化活性。,重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。,用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性-使酶的活性降低甚至丧失；使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。,离子置换修饰过程,加入一定量的EDTA等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成鳖合物，酶成为无活性状态。,通过透析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。,将不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。,根据离子种类的不同，经离子置换后的酶将会出现不同的特性。,金属离子活性举例,用Ca,2+,置换Zn,2+,成为钙型蛋白酶，则酶活力可提高2030%。将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋由酶结晶的酶活力提高23倍。,-,淀粉酶分子中大多数含有钙离子、镁离子或锌离子等其他离子。若把其他离子换成钙离子，则可提高酶活力并增加稳定性。,在,-,淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程中，添加一定量的钙离子，有利于提高和稳定,-,淀粉酶的活力。,谷氨酸脱氢酶中 Zn,2+,，过氧化氢酶分子中Fe,2+,，酰基氨基酸酶分子中的Zn,2+,超氧化物歧化酶分子中Cu,2+,Zn,2+,第二节,酶的大分子修饰,使用一些能与酶非共价相互作用又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而,保护酶的活力,。,添加多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来,保护酶的活力,。,添加蛋白质。蛋白质分子之间相互作用其表面区域排除了水分子，增加相互作用力，,提高稳定性,。,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖酐、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，可以,降低或消除酶的抗原性，,并提高,抗蛋白酶的能力,，延长酶在,体内的半衰期，提高酶药效,。,每分子核糖核酸酶与分子的右旋糖酐结合，可以使,酶活力提高到原有酶活力的倍。,每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有,酶活力的倍,共价修饰,大分子共价修饰的过程,修饰剂的选择,：采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG ）（,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，被广泛用于酶的修饰）,、右旋糖酐和葡聚糖等。,根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。,修饰剂的活化,作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。,修饰,将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在合适条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子侧链基团以共价键结合。,分离,需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,修饰效果,酶,半衰期,相对稳定性,天然SOD,6 min,1,右旋糖酐-SOD,7 h,70,Ficoll(低分子量)SOD,14 h,140,Ficoll(高分子量)SOD,24 h,240,聚乙二醇-SOD,35 h,350,第三节 肽链有限水解修饰,肽链部分水解后：,A引起酶活性中心的破坏，失去催化功能；,B维持活性中心的完整构象，酶的活力保持或损失不多；,C有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位，提高催化功能或酶活力；或者,降低酶的抗原性。例如：将木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，使其全部肽链的三分之二被水解除去，该酶的酶活力保持不变，而其抗原性大大降低。,肽链有限水解修饰实例,a、胃蛋白酶原的激活,b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,第四节 酶分子的侧链基团修饰,采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。,氨基修饰,能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物称为氨基修饰剂。修饰剂作用于酶蛋白侧链上的氨基产生脱氨基作用或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原有的副键改变，从而改变酶蛋白的构象。,羧基修饰,可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物称为竣基修饰剂。羧基修饰剂可使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质。,巯基修饰,巯基在许多酶中是活性中心催化基团，巯基可与另一巯基形成二硫键，对维持酶的结构稳定性起重要作用。若经修饰，对酶的特性或功能有显著影响。,常见基团的化学修饰反应：咪唑基,酚羟基,胍基修饰,精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合物，如环己二等是羰基修饰剂。,色氨酸吲哚基,酚基修饰,修饰酚基的主要方法有碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，因而增加了对带正电荷的底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。,六、分子内交联剂,用含有双功能团的化合物与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。,经过修饰的酶，其酶活力应保持或损失不多，同时应具有新的特性和功能。,化学修饰剂应是无毒并廉价易得的。,第五节 氨基酸置换修饰,将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。,通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力或增加酶的稳定性，有利于酶的应用。,成功,例证,酪氨酰-tRNA合成酶的第51位苏氨酸 (Thr-51)由脯氨酸置换，经修饰后的酶对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍。,氨基酸置换修饰的状况,早先，氨基酸置换修饰用化学方法进行。化学方法进行氨基酸置换，难度较大。,现在，蛋白质工程为氨基酸置换修饰提供了行之有效的手段。,第六节 基因突变酶修饰方法,20世纪80年代产生了蛋白质工程。,将需要改变的氨基酸通过基因定位突变，改变其结构基因的序列。,把酶分子修饰后的信息即突变后的结构基因贮存在DNA之中，经过基因克隆和表达获得具有新的特性和功能的酶。,给酶分子修饰展现了广阔的前景。,第七节 物 理 修 饰,定义：用物理方法，使酶分子的空间构象发生改变，改变酶的某些特性和功能的方法称。,特点：不改变酶的组分、基团和共价键，只是副键发生某些变化和重排。,成功例证,羧肽酶,经高压处理后，有利于催化肽的合成而水解反应的能力降低。,先用盐酸胍等变性剂破坏胰蛋白酶原有构象，透析除去变性剂后，在不同温度下，使酶重新折叠形成新的构象。结果表明，50,条件下重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性比在20,下（与天然胰蛋白酶的稳定性相同）重建构象的酶提高5倍。,酶分子修饰的应用,一、在酶学研究方面（1、酶的活性中心；2、酶的空间结构；3、酶的作用机制）,二、在医药研究方面（1、降低或消除抗原性；2、增强医药用酶的稳定性）,三、在工业方面（1、提高酶活力；增强稳定性；3、改变酶的动力学特性,）,
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