guan-6-外源基因在真核细胞中的表达

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,外源基因在真核细胞中的表达,Expression In Eukaryotic Host Cells,DNA,RNA,protein,Biological activity,Gene copy number,Promoter activity,mRNA stability,Ribosome binding site,Codon,usage,Protein stability,Many host-dependent factors,人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。,在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质胰岛素。,随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。,而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有,操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。,原核表达系统：,大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统,优势：高产量，操作简便,缺陷：较多哺乳动物蛋白基因很难在此系统表达产生有功能的蛋白,原因蛋白表达后的正确折叠和修饰,真核表达系统：,酵母表达系统,yeast expression system-,Pichia,pastoris,昆虫表达系统,Insect expression system-,Baculoviruses,哺乳动物细胞表达系统,Mammalian expression system,外源基因在真核表达系统中表达的3环节：,载体的构建；,构建的载体,DNA,在真核细胞中的导入；,表达产物的鉴定,真核表达载体至少要含两类序列：,原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的,复制起始序列,、能用在细菌中筛选克隆的,抗药性基因标志,等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组,DNA,克隆、并,复制繁殖,得到足够使用的数量。,在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加,poly-A,信号序列、,mRNA,剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,第一节外源基因在毕赤酵母中的表达,酵母是目前最常用的表达系统之一。,优点：成长快，易培养，成本低，遗传操作方便，能进行翻译后加工和修饰,巴氏毕赤酵母（,Pichia,pastoris,）,用于基因工程表达外源蛋白的优点：发酵密度高；外源基因表达量高；,可以建立有效的分泌型表达；,（分泌型表达？）,减轻宿主的代谢压力，减少受蛋白酶降解的危险，方便产物的纯化，也利于二硫键的正确折叠。,影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素,1、外源基因特性,外源基因在（巴氏毕赤酵母）,Pp,中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。,不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。,Fahnestock,等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因,拷贝数,的,增加,，其生产效率会相对有所,降低,。另外，许多高,A+T,含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录;不合适的,mRNA 5,非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会使基因的表达不尽人意。,提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在,Pp,中不能表达的,HIV ENV,蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高,A+T,含量区的核苷酸组成来避免提前终止的发生。而,Sreekrishna,等通过调整人血清白蛋白(,human serum,albumin，HSA,),的,mRNA5,非翻译区与醇氧化酶(,alcohol,oxidase,1，AOX1),的5,非翻译区相同后，,HSA,的表达量可以提高50倍以上。,限于目前对,Pp,的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产。,2、表达框的染色体整合位点和方式,虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于,Pp,没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。,3、基因剂量,许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加。,Jeffrey,等发现，重组,CD40L,的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获得的。,Clare,等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因子(,mECF,),在,Pp,中的表达量与其基因量成正相关，而高拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速,DNA,斑点杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。,因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,Jeffrey,等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上清液中获得了255,mg,的重组,cD40L。,4、分泌信号,对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。,有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或,a,配对因子(,MFa1),的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性大。,但酵母表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸。这可能是酵母细胞自身调节机制对外源基因高表达的应答表现。,Singh,等通过定向缺失诱变,MFa1,和干扰素基因连接处寡核甘酸导致了含有天然,N,端的成熟干扰素的正确释放，可以成为解决这一问题的一种好方法。,5.产物稳定性,酵母细胞膜上有一种,KEX-2,样蛋白水解酶，能专一性水解,a,因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸(如,LySArg，LysLys，ArgArg,)，,酵母基因工程表达产物发生降解现象的原因就在于此。,改变培养基的,PH,值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如,EDTA，,虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。,另外，使用蛋白酶缺陷株如,SMD1163、SMD1165,或,SMD1168,亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。 在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况。如重组人基质金属蛋白酶3(,MMP-3),被认为有促使哺乳动物上皮细胞凋亡的作用。它在,Pp,中高度降解，仅当与其组织抑制物,TIMP-1,共表达时才能保持稳定。这也提醒我们外源基因本身对产物稳定性的影响同样重要。,6.翻译后修饰,一般情况下,Pp,能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度在814个之间，使产物更加稳定，而这正是,Pp,表达外源蛋白的一个优势。,虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人红细胞生成素受体的胞外配体结合区(,EPObp,),因糖基化程度不同而呈两种状态(30,X103,和60,X103);,人组织因子则在,SDS-PAGE,上以从37,X103,到45,X103,的3个条带存在。,另外，聚合体的存在也会成为产物不均一的原因，这些都给基因工程产物的纯化和工业化生产带来一定困难。,从药物应用的观点来看，不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用，并且会明显影响纯化过程中产率的提高，因此，选用一种能够获得单体均一形式的基因工程产物十分重要。这方面的研究仍有待探索。,作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主体，,Pp,酵母菌兼有原核细胞的分子遗传操作和生长特性及真核生物的翻译后修饰机制的长处。,虽然目前存在的诸多困难使得仍有许多蛋白难以在这个系统中成功表达，但随着对它的利用和探索的不断深入必将不断给我们增添新的见解，使巴氏毕赤酵母系统不断完善。,重组（毕赤酵母）人干扰素,1b,滴眼液、喷雾剂,干扰素具有广泛的生理作用，主要包括：抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、免疫佐剂、诱导细胞凋亡等，其中干扰素所具有的广谱抗病毒作用已经得到国际医药界高度重视。,上海某公司称其研制的重组（,毕赤酵母,）人干扰素,1b,滴眼液，在较低浓度（10%）时，体外药效学试验显示有抗,SARS,病毒，保护被感染细胞的活性作用。,国内外上市的干扰素,大多是通过大肠杆菌表达生产的，尚无使用毕赤酵母表达体系进行重组干扰素,1b,上市，采用毕赤酵母分泌表达， 具有工艺简单，纯化方便、产量高、产品稳定等优点,第二节杆状病毒和昆虫细胞表达系统,昆虫杆状病毒（基因工程载体）,Baculoviruses,是对昆虫具有专一性的杆状病毒，对于其他种类的細胞不具感染性。 它是一种长杆状的病毒，长約200-400,nm，,宽約40-50,nm，DS-DNA,長度在80-200,kbp,。,当病毒成熟時，在病毒鞘外会包裹一层,polyhedrin,多角型蛋白,，,包裹完整的,baculovirus,形成,Occlusion Body (OB,封闭体)， 可以保护病毒抗,UV,与抗旱。 已有些地区利用,baculoviruses,作为生物杀虫剂。,当細胞被病毒感染后，30,min,后出現,RNA，16-20 h,后大量放出未包裹的病毒， 约在24,h,后病毒进行包裹，在60-72,h,后細胞開始瓦解。下图的细胞已是受感染80,h,后的状态，在显微镜下可以观察到盐粒状的多角体病毒。,左图是一只正常的菜虫幼虫，经过喂食,OB,后，于四至五天后造成虫体的死亡，,右图則为,baculovirus,造成虫体的细胞瓦解。,昆虫细胞和杆状病毒提供了已经被证明的高水平表达哺乳动物全长蛋白的方法。在昆虫细胞中很多翻译后修饰类似于哺乳动物细胞，而那些在大肠杆菌中不能成功表达的蛋白也可以在昆虫细胞利用杆状病毒系统进行表达。,BES（,杆状病毒表达系统）具备以下优点：,具有真核细胞的翻译后修饰功能；正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因（200,kD,）；,具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；对脊椎动物是安全的。,昆虫表达系统的优点：,外源基因表达产量高，并多有和哺乳动物细胞相似的翻译后修饰功能；,昆虫细胞培养条件简单；,生物安全性高。,第三节 哺乳动物细胞表达系统,一、影响外源基因在哺乳动物细胞中转录和翻译的序列因素,Promoter,，,enhancer, RNA splicing site,intron, 5UTR,start,codon, 3UTR,二、哺乳动物细胞的表达载体,病毒性载体：,去掉部分病毒复制和包装所需的结构蛋白基因，但保留包装识别序列和复制序列。为保证安全性：病毒载体为自身复制缺陷型。,腺病毒载体、牛痘痘苗病毒载体、单纯性疱疹病毒载体,优点：效率高 缺点：操作复杂,非病毒哺乳动物表达载体,:,质粒（,pCDNA3,等）,三、筛选标志基因,很少通过细胞的形态来鉴定和筛选被转染的细胞，利用,筛选标志,基因的表达产物赋予细胞的特性而区分细胞。,四、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式,瞬时转染：外源基因导入到哺乳动物细胞后14天，就可以检测到基因的表达情况。表达完全由导入的质粒来执行，绝大多数质粒没有整合到染色体上而被降解或随细胞分裂而丢失。,永久转染：导入的基因整合到细胞的染色体,DNA,中。,五、外源,DNA,导入哺乳动物细胞的方法,病毒感染,：借用病毒的感染方式，将外源基因事先插入到病毒的基因组中，并用适当的方式包装成有感染活性的重组病毒颗粒，用于感染细胞，从而将外源病毒导入到相应的细胞中。,常用：逆转录病毒，腺病毒；疱疹病毒等。,优点：效率高,缺点：重组病毒建立有一定难度；安全性；抗体影响；,转染：,外源核酸导入到细胞中的非病毒方法，通常称为转染。分化学方法和物理方法。,理想的转染方法：操作简单、高效、低毒、对细胞正常生理状况影响小、重复性好、成本低。,磷酸钙共沉淀法,DEAE-,葡聚糖法,阳离子脂质体转染,显微注射法,电转移,基因枪,Transfection,of DNA,by calcium phosphate,coprecipitation,A typical mammalian expression vector for high-level protein expression,Liposome-mediated,gene transfer,(,lipofection,),Gene transfer by,electroporation,SV40 viral vectors,綠螢光眼睛的基因轉殖魚,魚類受光蛋白基因控制視網膜專一性表現的上游序列與綠色螢光基因相接，然後利用顯微注射將這段,DNA,打到魚卵內，幾天後即可以觀察到只有眼睛才會有綠螢光出現 (箭頭所指) 的基因轉殖魚。,有綠螢光肌肉條紋的基因轉殖魚,魚類控制肌肉專一性表現的上游序列與綠螢光基因相接，然後利用顯微注射將這段,DNA,打到魚卵內，在胚胎發育過程中即可觀察到只有肌肉纖維才會有的綠螢光出現的基因轉殖魚。,全身性綠螢光的基因轉殖魚,將沒有專一性表現之基因的上游序列與綠螢光基因相接，然後利用顯微注射將這段,DNA,打到魚卵，結果出現全身都會發綠光的基因轉殖魚。,第四节基因表达产物的检测,基因转录水平检测,Northern Blot、RNA,杂交保护和,RT-PCR,蛋白翻译水平检测,免疫方法,ELISA、Western Blot,生物活性检测,根据表达产物特性进行设计,