副溶血性弧菌检验标准操作程序课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选ppt,*,副溶血性弧菌检验标准操作程序,1,精选ppt,副溶血性弧菌检验标准操作程序1精选ppt,概况,副溶血性弧菌于1950年从日,本一次暴发性食物中毒中分离,发现。该菌存在于近海的海水、,海底沉积物和鱼类、贝壳等海,产品中。在37、pH7.7、含,氯化钠34%的环境中生长最,好。主要引起食物中毒，尤以,日本、东南亚、美国及我国台,北地区多见，也是我国大陆沿,海地区食物中毒中最常见的一,种病原菌。,2,精选ppt,概况副溶血性弧菌于1950年从日2精选ppt,3,精选ppt,3精选ppt,4,精选ppt,4精选ppt,范围,本标准规定了食品中副溶血性弧菌（,Vibrio parahaemolyticus,）的检验方法。,本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。,5,精选ppt,范围本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio para,食品种类,动物性水产品：,鲜冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷冻水产品；,生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以直接食用的。,6,精选ppt,食品种类动物性水产品：6精选ppt,设备和材料,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他,设备和材料如下：,恒温培养箱：36 1。,冰箱：2 5 。,均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。,天平： 感量0.1 g。,无菌试管：18 mm180mm、15 mm100 mm。,无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。,无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。,无菌培养皿：直径90mm。,VITEK全自动微生物鉴定系统1。,灭菌手术剪、镊子。,7,精选ppt,设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他7精选pp,样品制备,非冷冻样品采集后应立即置710冰箱保存，尽可能及早检验；,冷冻样品应在45 以下不超过15 min或在25不超过18 h解冻；,如果样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），推荐贮存温度为-70 以下。,8,精选ppt,样品制备 非冷冻样品采集后应立即置710冰箱保存，尽,样品制备,鱼类和头足,类动物取表,面组织、肠,或鳃。贝类,取全部内容,物，包括贝,肉和体液；,9,精选ppt,样品制备鱼类和头足9精选ppt,10,精选ppt,10精选ppt,11,精选ppt,11精选ppt,12,精选ppt,12精选ppt,样品制备,甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。,13,精选ppt,样品制备甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。1,14,精选ppt,14精选ppt,样品制备,如为带壳贝类或,甲壳类，则应先在,符合生活饮用水卫,生标准的流水中洗,刷外壳并甩干表面,水分，然后以无菌,操作打开外壳，按,上述要求取相应部,分。,15,精选ppt,样品制备如为带壳贝类或15精选ppt,样品制备,以无菌操作取检样25 g（mL），加入3氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min，或拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌容器内，加225 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。,16,精选ppt,样品制备以无菌操作取检样25 g（mL），加入3氯化,增菌,定性检测,将上述1:10稀释液于36 1 培养8 h18 h。,17,精选ppt,增菌定性检测17精选ppt,增菌,定量检测,用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。,另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。,根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1 mL。置36 1 恒温箱内，培养8 h18 h。,18,精选ppt,增菌定量检测18精选ppt,分离,在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36 1 培养18 h24 h。,19,精选ppt,分离在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCB,使用TCBS琼脂划线不可密集,20,精选ppt,使用TCBS琼脂划线不可密集20精选ppt,分离,典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm3 mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直径2 mm3 mm。,21,精选ppt,分离典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈现为圆的、半透明的、表面,TCBS,琼脂上面的副溶血性弧菌,22,精选ppt,TCBS琼脂上面的副溶血性弧菌22精选ppt,四种显色培养基,23,精选ppt,四种显色培养基23精选ppt,纯培养,挑取3个或,以上的可疑,菌落，划线,3氯化钠,胰蛋白胨大,豆琼脂平板，,36 1 ,培养18 h,24 h。,24,精选ppt,纯培养挑取3个或24精选ppt,初步鉴定,氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。,25,精选ppt,初步鉴定氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶,初步鉴定,涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。,26,精选ppt,初步鉴定涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形,初步鉴定,挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，361培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。,27,精选ppt,初步鉴定挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3氯化钠三糖铁琼脂斜,TSATTC可以方便观察副溶血性弧菌动力,28,精选ppt,TSATTC可以方便观察副溶血性弧菌动力28精选ppt,初步鉴定,嗜盐性试验：挑取纯培,养的单个可疑菌落，分别,接种于不同氯化钠浓度的,胰胨水中，361培,养24h，观察液体混浊情,况。副溶血性弧菌在无氯,化钠和10氯化钠的胰胨,水中不生长或微弱生长，,在7氯化钠的胰胨水中,生长旺盛。,29,精选ppt,初步鉴定嗜盐性试验：挑取纯培29精选ppt,确定鉴定,生化试验：分别接种含3氯化钠,的甘露醇、赖氨酸、MR-VP培养基，,361培养24h48h后观察结,果。隔夜培养物进行ONPG试验。,30,精选ppt,确定鉴定生化试验：分别接种含3氯化钠30精选ppt,MR-VP试验,31,精选ppt,MR-VP试验31精选ppt,ONPG试验,32,精选ppt,ONPG试验32精选ppt,确定鉴定,API20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK鉴定。,33,精选ppt,确定鉴定API20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3氯化,生化特性,分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。,H2S,、V-P、动力（）。,甘露醇（）、赖氨酸（）、ONPG（）。,34,精选ppt,生化特性分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。34精选pp,35,精选ppt,35精选ppt,36,精选ppt,36精选ppt,报告,当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求时，可以报告检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。,37,精选ppt,报告当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求时，可以报告检出,可选项,血清型分型：O抗原，K抗原,神奈川试验：是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。该试验阳性结果与副溶血性弧菌分离株的致病性显著相关,。,38,精选ppt,可选项血清型分型：O抗原，K抗原38精选ppt,39,精选ppt,39精选ppt,