动物繁殖学第10讲卵子发生及其形态结构与体外保存课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,华中农业大学动物科技学院,*,考评项目赋标准分，对照考评内容和考评办法对考评项目进行考评，评出各考评项目的考评实际得分，考评类目下各考评项目考评实际得分之和为该考评类目的考评实际得分,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,考评项目赋标准分，对照考评内容和考评办法对考评项目进行考评，评出各考评项目的考评实际得分，考评类目下各考评项目考评实际得分之和为该考评类目的考评实际得分,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,考评项目赋标准分，对照考评内容和考评办法对考评项目进行考评，评出各考评项目的考评实际得分，考评类目下各考评项目考评实际得分之和为该考评类目的考评实际得分,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,考评项目赋标准分，对照考评内容和考评办法对考评项目进行考评，评出各考评项目的考评实际得分，考评类目下各考评项目考评实际得分之和为该考评类目的考评实际得分,第四章 雌性动物性机能发育与发情排卵及其调控,2024/9/1,1,第一节 性机能发育 第二节 发情与排卵 第三节 发情控制技术,第四节 卵子发生及其形态结构与体外保存,华中农业大学,动物科技学院,.,第四章 雌性动物性机能发育与发情排卵及其调控 2023/,1,本讲内容,卵子发生,卵子形态结构,卵母细胞成熟机理,卵母细胞体外成熟,卵母细胞体外保存,华中农业大学,动物科技学院,.,本讲内容卵子发生华中农业大学动物科技学院.,2,2024/9/1,精子发生的过程,精原细胞的增殖,精母细胞的发育,3,精子的形成,.,2023/9/7精子发生的过程 精原细胞的增殖 精母细胞,3,2024/9/1,华中农业大学动科动医学院,.,2023/9/7华中农业大学动科动医学院.,4,雌性生殖细胞的分化、增殖、成熟全过程称为,卵子发生,（,oogenesis,）,卵子发生起始于胚胎早期,由原始卵原细胞经过有丝分裂、减数分裂最后成为单倍体的卵细胞过程，持续时间很长，一般在初情期以后开始，至受精过程中才能完成,一、卵子发生,华中农业大学,动物科技学院,.,一、卵子发生华中农业大学动物科技学院.,5,卵子发生模式图,马,.,卵子发生模式图马.,6,http:/click4biology.info/c4b/11/hum11.4.htm#2,.,http:/click4biology.info/c4b/,7,（一）,卵子发生特点,卵原细胞,经有丝分裂增殖为初级卵母细胞,初级卵母细胞,经过,2,次减数分裂，每次分裂均生成大小不等的,2,个细胞，小的称为极体，多余的染色体被排出，最后形成一个成熟的卵子,卵母细胞的原生质部分几乎全部留给卵子,华中农业大学,动物科技学院,（一）卵子发生特点,.,（一）卵子发生特点 卵原细胞经有丝分裂增殖为初级卵母细胞华中,8,卵原细胞分裂形成初级卵母细胞在胎儿出生前后不久完成,动物性成熟以前，卵母细胞不再增长,性成熟后，每个性周期有部分卵母细胞发育，多数卵母细胞在发育过程中退化，只有少数卵母细胞发育成熟排卵,华中农业大学,动物科技学院,（一）卵子发生特点,.,卵原细胞分裂形成初级卵母细胞在胎儿出生前后不久完成华中农业大,9,卵母细胞在生长发育过程中要积累大量的营养物质和遗传信息，主要为胚胎发育提供营养和信息,哺乳动物的胚胎是在母体子宫内发育，直接吸收母体的营养物质，但一些母源性,mRNA,、,tRNA,、,rRNA,的合成还是必需的,鸟类、两栖类、爬行类动物的卵需要存贮大量的卵黄物质,（一）,卵子发生特点,华中农业大学,动物科技学院,.,卵母细胞在生长发育过程中要积累大量的营养物质和遗传信息，主要,10,（二）,卵子发生过程,卵原细胞由来：,由胚胎期性别分化后,雌性胎儿的,原始生殖细胞,分化而来。,细胞特点：,通过,有丝分裂,进行增殖,增殖期的长短：,因动物而异,通常在,出生前或出生后不久停止,牛、绵羊分别在胎期,45-110,天和,35-90,天,猪在胚胎期,30,天至出生后,7,天,兔在胚胎期,21d,至出生后,10d,1,卵原细胞的增,殖,华中农业大学,动物科技学院,.,（二）卵子发生过程 1卵原细胞的增殖华中农业大学动物科技学,11,卵母细胞经过最后一次有丝分裂后，即发育成为,初级卵母细胞，,形成,原始卵泡,原始卵泡出现后有的卵母细胞便开始,退化,初级卵母细胞特点,：,卵黄颗粒增多，卵母细胞的体积增大,出现透明带,卵泡细胞通过有丝分裂而增殖,初级卵母细胞形成后,到初情期前,处于,静止,状态,2,卵母细胞的生长,华中农业大学,动物科技学院,.,卵母细胞经过最后一次有丝分裂后，即发育成为初级卵母细胞，形成,12,2,卵母细胞的生长,卵泡细胞通过有丝分裂增殖，由单层变多层，所分泌的液体形成卵泡液,由卵母细胞及颗粒细胞共同分泌某些物质形成透明带,颗粒细胞附着在卵母细胞外并通过卵母细胞外围微绒毛为卵母细胞提供营养物质，为以后的发育提供能量来源,华中农业大学动物科技学院,.,2卵母细胞的生长 卵泡细胞通过有丝分裂增殖，由单层变多层，,13,在初级卵母细胞发育至第一次减数分裂前期的双线期便进入停滞状态，在许多动物该期细胞核明显、特别大，异染色质很少，看起来很像泡状，因此这一时期的卵母细胞称为生发泡,（,germinal vesicl,，,GV,），,此期核中含有大量的供早期胚胎发育所需的贮备物质,2,卵母细胞的生长,华中农业大学,动物科技学院,.,在初级卵母细胞发育至第一次减数分裂前期的双线期便进入停滞状态,14,3,卵母细胞的成熟,卵母细胞的成熟经过,两次成熟分裂,第一次成熟分裂：,在排卵前不久完成的，分裂末期，纺垂体旋转，排出,有一半染色体及少量细胞质的极体,，染色体数目减半。,第二次成熟分裂：,染色体是单倍体，排出的卵大多数处于分裂中期，直到精子进入透明带，被激活才能完成分裂。,.,3卵母细胞的成熟卵母细胞的成熟经过两次成熟分裂.,15,初级卵母细胞发育至成熟分裂前期的双线期便进入停滞状态，当母畜发育到一定年龄，伴随着卵泡的增长，在生殖激素的支配和调节下，恢复成熟分裂过程。这时卵母细胞的核向卵质膜下移动，核仁和核膜消失，染色体聚集成致密状态，即生发泡破裂,（,germinal vesicl breakdown,，,GVBD,）,3,卵母细胞的成熟,华中农业大学,动物科技学院,.,初级卵母细胞发育至成熟分裂前期的双线期便进入停滞状态，当母畜,16,初级卵母细胞发育至成熟分裂前期的双线期便进入停滞状态，当母畜发育到一定年龄，伴随着卵泡的增长，在生殖激素的支配和调节下，恢复成熟分裂过程。这时卵母细胞的核向卵质膜下移动，核仁和核膜消失，染色体聚集成致密状态，即,生发泡破裂,GVBD,是在显微镜下最早可以观察到的卵母细胞开始成熟信号,在光镜下先后表现为,GVBD,和第一极体（,first polar body,）排出,GVBD,代表减数分裂的开始，而第一极体的排出标志着卵母细胞已达到核成熟,3,卵母细胞的成熟,华中农业大学,动物科技学院,.,初级卵母细胞发育至成熟分裂前期的双线期便进入停滞状态，当母畜,17,第一次成熟分裂，有一半染色质及少量细胞质排放到卵质膜与透明带之间的空隙（卵周隙）中，称为第一极体；另一个几乎得到全部细胞质，称为,次级卵母细胞,（,secondary oocyte,）,在第二次成熟分裂时，次级卵母细胞分裂为卵细胞和一个第二极体。第二次成熟分裂持续的时间相对短促，在许多动物都是在排卵之后的,受精,过程中完成的,3,卵母细胞的成熟,华中农业大学,动物科技学院,.,第一次成熟分裂，有一半染色质及少量细胞质排放到卵质膜与透明带,18,营养来源不同,发生的连续性,形成的数量不同,排出时两者成熟度不同,最终两者形态不同,相对而言,卵母细胞在卵巢中的储备是有限的,而精子的产生是无限的,4.,精子与卵子发生过程比较,.,营养来源不同4.精子与卵子发生过程比较.,19,二、卵子形态结构,（一）卵子的形态和大小,圆球形，直径大小因所含的卵黄量不同，变异范围较大,透明带内卵黄的直径一般为,80200m,，为精子体积的,1,万倍以上,华中农业大学,动物科技学院,.,二、卵子形态结构 （一）卵子的形态和大小 华中农业大学动物,20,动物繁殖学,，杨利国主编，中国农业出版社，,2003,年,.,动物繁殖学，杨利国主编，中国农业出版社，2003年 .,21,（二）卵子的结构,放射冠（,corona radiata,）,透明带（,zona pe11ucida,）,卵质膜（,plasma membrane,）,卵细胞质,卵细胞核,华中农业大学,动物科技学院,.,（二）卵子的结构 放射冠（corona radiata）华中,22,1,放射冠,概念,:,卵子周围致密的颗粒细胞呈放射状排列。,脱落时间,:,牛、绵羊运行至输卵管膨大部；马排卵时已没有；猪、兔、鼠卵子在精子进入后才脱落。,作用,卵子发生过程中：,营养和保护作用。,受精过程中：,引导和定位作用。,（二）卵子的结构,华中农业大学,动物科技学院,.,1放射冠概念:卵子周围致密的颗粒细胞呈放射状排列。（二）卵,23,2,透明带,透明带,是由卵质膜分泌物和卵泡细胞分泌物共同形成的均质半透明膜，其厚度远远超过卵质膜，可以被蛋白分解酶、如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所溶解,作用,保护作用,选择作用,交换和代谢作用,（二）卵子的结构,华中农业大学,动物科技学院,.,2透明带（二）卵子的结构 华中农业大学动物科技学院.,24,3,卵质膜,相当于体细胞的细胞膜。其作用是使卵子有选择地吸收无机离子和代谢物质，防止多精子受精,（二）卵子的结构,华中农业大学,动物科技学院,.,3卵质膜 相当于体细胞的细胞膜。其作用是使卵子有选择地吸,25,卵周隙,在卵质膜与透明带之间，由于卵母细胞的发育，特别是第一极体形成后卵黄的收缩会形成一定的空隙，即卵周隙（,perivitelline space,），具有保护卵子的作用，对精子有种属选择性,（二）卵子的结构,华中农业大学,动物科技学院,.,卵周隙 在卵质膜与透明带之间，由于卵母细胞的发育，特别是第一,26,4,卵胞质,其外观和颜色依动物种类不同有明显差异，主要是由于卵黄和脂肪小滴含量不同所致。,（二）卵子的结构,华中农业大学,动物科技学院,.,4卵胞质 其外观和颜色依动物种类不同有明显差异，主要是由于,27,5,卵细胞核,发育成熟的卵母细胞有一个大的球形核，包含着一至数个染色质核仁，其位置并不在细胞质的中心。,（二）卵子的结构,华中农业大学,动物科技学院,.,5卵细胞核发育成熟的卵母细胞有一个大的球形核，包含着一至数,28,未成熟卵母细胞,.,未成熟卵母细胞.,29,三、卵母细胞成熟机理,卵母细胞的成熟是指卵母细胞获得恢复减数分裂以及进一步发育到第二次减数分裂，为受精及胚胎发育做准备的过程，是完成正常受精及早期胚胎发育的必需条件，包括,细胞核成熟,和,细胞质成熟,华中农业大学,动物科技学院,.,三、卵母细胞成熟机理 卵母细胞的成熟是指卵母细胞获得恢复减数,30,四、卵母细胞体外成熟,获取成熟卵母细胞主要通过以下两条途径：,体内成熟,，经超排处理后，采取成熟卵泡内的卵母细胞或从输卵管内回收刚刚排出的卵母细胞,体外成熟,（,in vitro maturation,，,IVM,），采集卵泡中未成熟的卵母细胞，经体外培养使之成熟。可充分利用母畜的卵巢，是解决卵子来源最有效的途径,华中农业大学,动物科技学院,.,四、卵母细胞体外成熟 获取成熟卵母细胞主要通过以下两条途径：,31,（一）卵母细胞的采集方法,1.,卵母细胞的离体采集,母畜屠宰后，在,30min,内取出卵巢，放入盛有灭菌生理盐水或,PBS,的保温瓶内（,25,-35,）中，在,3h,内送回实验室进行回收,卵泡抽吸法,卵巢解剖法,华中农业大学,动物科技学院,.,（一）卵母细胞的采集方法 1. 卵母细胞的离体采集 华中农,32,卵泡抽吸法,操作：用针头穿刺卵泡而将卵母细胞抽吸出来。注射器应保持一定的负压，针头一般从卵泡的侧面刺入，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡，不要只吸取一个卵泡就将针头拔出，否则容易导致污染,优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的污染,缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟,（一）卵母细胞的采集方法,华中农业大学,动物科技学院,., 卵泡抽吸法（一）卵母细胞的采集方法 华中农业大学动物科,33,卵巢解剖法,操作,：,用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，露出卵泡，然后用刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗，采集其中的卵母细胞,优点,：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高,缺点,：回收的速度相对较慢，容易造成污染,（一）卵母细胞的采集方法,华中农业大学,动物科技学院,., 卵巢解剖法（一）卵母细胞的采集方法 华中农业大学动物科技,34,2.,卵母细胞的活体采集,腹腔镜法,优点：比较直观，容易掌握,缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术,华中农业大学,动物科技学院,.,2. 卵母细胞的活体采集 腹腔镜法华中农业大学动物科技学,35,B,型超声波法,保定母畜，从尾荐结合处注入,2ml,左右的盐酸普鲁卡因作硬膜外腔麻醉,将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处,术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据,B,超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出,2.,卵母细胞的活体采集,华中农业大学,动物科技学院,.,2. 卵母细胞的活体采集 华中农业大学动物科技学院.,36,B,型超声波法,该法的优点是不用进行手术，操作的速度较快，对母牛的损伤也小，可频繁对母牛进行反复采卵，且亦可对妊娠母牛进行采卵；缺点是操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备,母牛每周采卵,2,次，每次可获得,5,枚,6,枚卵母细胞，且持续,23,个月对母牛无不良影响,2.,卵母细胞的活体采集,华中农业大学,动物科技学院,., B型超声波法该法的优点是不用进行手术，操作的速度较快，对,37,（二）卵母细胞,IVM,方法,用于卵母细胞,IVM,的基础培养液有,TCM199,，,Hams F-10,，,Menezos B2,，,NUSC23,和,MEM,等，其中应用最为广泛的是,TCM199,牛、羊、猪等卵母细胞的核成熟率都能达到,80%,以上,1,成熟培养液的选择,华中农业大学,动物科技学院,.,（二）卵母细胞IVM方法 用于卵母细胞IVM的基础培养液有T,38,卵母细胞的,IVM,培养尚需在上述基础液中加入一定浓度的血清（,510%,的,FCS,或,ECS,）和,GTH,（,0.11.0,g/ml FSH,和,510g/ml LH,等）等成分,虽然已有许多无血清培养卵母细胞,IVM,报道，但为获得较高的受精率和胚胎发育率，添加血清仍为大多数实验室所采用,1,成熟培养液的选择,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,.,卵母细胞的IVM培养尚需在上述基础液中加入一定浓度的血清（5,39,2,成熟培养时间,一般采用,22 24h,，猪多采用,4044h,，马的卵母细胞多采用,3036h,。兔卵母细胞的成熟培养时间仅需,1215h,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,.,2成熟培养时间 一般采用22 24h，猪多采用4044,40,3,成熟培养的温度和气相环境,人和啮齿类动物的卵母细胞,IVM,采用,37,牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用,3839,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,.,3成熟培养的温度和气相环境 人和啮齿类动物的卵母细胞IVM,41,气相环境中的,CO,2,浓度应根据培养液中的碳酸氢盐浓度来定，一般采用,5%,的,CO,2,3,成熟培养的温度和气相环境,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,.,气相环境中的CO2浓度应根据培养液中的碳酸氢盐浓度来定，一般,42,4,IVM,系统,开放培养系统,微滴培养系统,密闭培养系统,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,.,4IVM系统 开放培养系统（二）卵母细胞IVM方法 华中农,43,开放培养系统,将,1-2ml,成熟培养液直接置于平皿内或五孔培养板内，然后放入,50-200,枚卵母细胞进行培养，上面不盖石蜡油,优点：简单，对培养液中的脂溶性物质没有影响，且能同时培养大量的卵母细胞，培养结果不受石蜡油质量的影响,缺点：渗透压的变化较大，容易污染，故培养液的量和培养箱内的湿度要特别注意,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,., 开放培养系统 将1-2ml成熟培养液直接置于平皿内或五孔,44,微滴培养系统,将成熟培养液先在组织培养皿中做成,50500,l,的微滴，上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养,优点：成熟培养液中的渗透压比较稳定，且不易污染,缺点：对培养液中的脂溶性物质有稀释作用，且成本较高，培养结果易受石蜡油质量的影响,因此，在一般情况下，这种培养系统已少用，只是在卵母细胞数量特别少的情况下采用,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,., 微滴培养系统 将成熟培养液先在组织培养皿中做成5050,45,密闭培养系统,将卵母细胞置于含有,1,2ml,成熟培养液的试管中，加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋内,优点：不需要,CO,2,培养箱，方便运输,缺点：,pH,不如前者稳定,由于这种培养系统不需要昂贵的,CO,2,培养箱，故适合在一些条件简陋的实验室应用，特别是需在卵母细胞的运输途中进行成熟时非常有用,（二）卵母细胞,IVM,方法,华中农业大学,动物科技学院,., 密闭培养系统 将卵母细胞置于含有12ml成熟培养液的试,46,（三）卵母细胞,IVM,质量评定,卵母细胞的,IVM,质量评定,通过,形态观察,进行初步评定,通过,固定染色检查,核成熟的详细情况,IVF,和体外培养评定其受精和胚胎发育潜能,华中农业大学,动物科技学院,.,（三）卵母细胞IVM质量评定 卵母细胞的IVM质量评定华中农,47,形态观察,正常成熟的卵母细胞，其细胞质均匀、没有空泡，其周围的卵丘细胞一般发生扩展，去卵丘细胞后，可见到位于卵周隙的第一极体,（三）卵母细胞,IVM,质量评定,华中农业大学,动物科技学院,., 形态观察正常成熟的卵母细胞，其细胞质均匀、没有空泡，其周,48,卵子的结构,.,卵子的结构.,49,.,.,50,固定染色法,将卵母细胞周围的卵丘细胞用,0.1%,的透明质酸酶去掉，然后在醋酸酒精或醋酸甲醇（,1:3,）的固定液中固定,24,48h,，最后用,1%,间苯二酚兰,（,Lacmoid,）或,1%,地衣红（,Orcein,）的,40%,醋酸溶液染色观察,（三）卵母细胞,IVM,质量评定,华中农业大学,动物科技学院,., 固定染色法将卵母细胞周围的卵丘细胞用0.1%的透明质酸酶,51,生发泡期（,germinal vesicle,，,GV,）：卵母细胞质中可看见到一个大而圆的细胞核（即,GV,），核膜清晰，界限明显,生发泡破裂期（,GVBD,）：核膜变得模糊，核膜的一侧出现缺口，染色质隐约可见,卵母细胞的成熟阶段,：,（三）卵母细胞,IVM,质量评定,华中农业大学,动物科技学院,.,卵母细胞的成熟阶段：（三）卵母细胞IVM质量评定 华中农业大,52,脱去卵丘的未成熟卵母细胞,.,脱去卵丘的未成熟卵母细胞.,53,受精和胚胎发育潜能的评定,为了解卵母细胞质的成熟情况，通过,IVF,后的受精分裂率和随后的体外培养胚胎发育率对其,IVM,的质量进行鉴定，这是评定卵母细胞,IVM,方法最为重要的一项指标,（三）卵母细胞,IVM,质量评定,华中农业大学,动物科技学院,., 受精和胚胎发育潜能的评定 为了解卵母细胞质的成熟情况，通,54,五、卵母细胞体外保存,（一）,37,保存,应该考虑保存时间与卵老化的问题,排出的卵或由卵泡取出的卵在取出后受精能力有一定限度，所以保存时间不长，即或能受精，也会出现胚胎发育异常,除特殊需要外，一般不在,37,保存,华中农业大学,动物科技学院,.,五、卵母细胞体外保存 （一）37保存 华中农业大学动物科,55,（二）低温保存,低于室温、但还达不到冷冻阶段，以这种方法保存卵和胚胎称为低温保存法。一般在,0,10,左右保存。由于温度较低，可抑制物质代谢的速度和细胞分裂的速度，因此可以延长保存时间,五、卵母细胞体外保存,华中农业大学,动物科技学院,.,（二）低温保存 低于室温、但还达不到冷冻阶段，以这种方法保存,56,据报道，在,10,下保存兔卵母细胞，经过,24h,，受精率可达,78,，经过,78h,，仍可以保持受精能力，但保存温度超过,10,，受精能力显著降低。小鼠卵母细胞受精能力保持时间短，可用含有,5%,甘油的卵黄柠檬酸,Locks,液、以,1,min,冷却到,5,保存数小时，仍可以很好地受精,（二）低温保存,五、卵母细胞体外保存,华中农业大学,动物科技学院,.,据报道，在10下保存兔卵母细胞，经过24h，受精率可达78,57,（三）冷冻保存,卵母细胞的冷冻保存与精子和胚胎的冷冻保存一样，具有许多潜在的应用价值,把优良品种动物废弃卵巢中大量卵母细胞冷冻保存，象建立,“,精子库,”,和,“,胚胎库,”,那样，建立起,“,卵子库,”,，不仅可为这些生物技术提供充足的材料，还可为家畜保种和遗传资源的长距离国际间运输提供可能途径,五、卵母细胞体外保存,华中农业大学,动物科技学院,.,（三）冷冻保存 卵母细胞的冷冻保存与精子和胚胎的冷冻保存一样,58,卵母细胞的冷冻保存也为稀有动物、濒危动物和其他有价值的雌性个体（如基因工程个体）遗传资源的长期保存带来了希望,卵母细胞的冷冻保存要比胚胎冷冻保存困难得多，特别是未成熟卵母细胞要比正在成熟或已经成熟的卵对低温更加敏感,（三）冷冻保存,五、卵母细胞体外保存,华中农业大学,动物科技学院,.,卵母细胞的冷冻保存也为稀有动物、濒危动物和其他有价值的雌性个,59,经典或平衡冷冻保存,降温至,0,以下，用冷冻保护剂平衡，一般贮存于,-196,，解冻，稀释除去冷冻保护剂等步骤,在,-80,以上，细胞逐渐失去活力，而在,-130,以下，细胞内的水呈冰晶样或玻璃样，细胞内所有的需能反应停止，细胞不仅不能分裂增殖，细胞活动也大幅度下降，甚至停止。温度回升后，细胞又恢复活性,华中农业大学,动物科技学院,.,经典或平衡冷冻保存降温至0以下，用冷冻保护剂平衡，一般贮存,60,1,慢速冷冻、慢速解冻法,平衡冷冻法。卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理后开始降温，在,-6-7,植冰。然后，以,0.11,min,的速度降至,-80,。停留一段时间后，投入液氮。解冻速度低于,25,min,优点：脱水完全，细胞内不易形成冰,缺点：费时，冷冻保护剂处理细胞的时间过长,华中农业大学,动物科技学院,.,1慢速冷冻、慢速解冻法 平衡冷冻法。卵母细胞用冷冻保护剂平,61,1977,年，,Whittingham,，小鼠的成熟卵母细胞,1990,年，,Schroder,以,DMSO,为冷冻保护剂用该法冷冻了小鼠,GV,期及成熟卵母细胞，二者的形态正常率分别为,69,和,81,，受精后发育为,2-,细胞的比例分别为,9,和,17,，前者无一发育为胚泡，而后者有,8,发育为胚泡,1,慢速冷冻、慢速解冻法,华中农业大学,动物科技学院,.,1977年，Whittingham，小鼠的成熟卵母细胞1慢,62,2,慢速冷冻、快速解冻法,慢速冷冻至,-80,，再以,25,min,以上的速度解冻。解冻一般在室温或,37,水浴中进行,用该法冷冻卵母细胞的报道不多，效果也不理想,华中农业大学,动物科技学院,.,2慢速冷冻、快速解冻法 慢速冷冻至-80，再以25m,63,3,快速冷冻、快速解冻法,卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理及植冰以后，以,0.11,min,的速度冷冻至,-30-40,，停留一段时间后投入液氮,解冻在室温或,37,水浴中进行,Fuller,等人（,1984,）以甘油作冷冻保护剂冷冻的小鼠成熟卵母细胞，,54,完成,IVF,Lee,（,1993,）用,1.5mol/L,丙二醇和,1.5mol/L,乙二醇分别处理小鼠,GV,期卵母细胞，冷冻解冻后存活率分别为,55.3,和,59.9,华中农业大学,动物科技学院,.,3快速冷冻、快速解冻法 卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理及植冰,64,4,一步冷冻法,一步冷冻法省去解冻后脱除冷冻保护剂的步骤。其要点是冷冻细管里装有培养液、冷冻液和稀释液。该法很适合于冷冻胚胎运输到条件较差的地区移植时使用，但,Ko,等（,1988,）以,2.0mol/L,丙二醇作冷冻保护剂、以,0.5mol/L,蔗糖作稀液用该法冷冻了小鼠成熟卵母细胞，形态正常率及存活率分别为,55.2,和,17.6,华中农业大学,动物科技学院,.,4一步冷冻法 一步冷冻法省去解冻后脱除冷冻保护剂的步骤。其,65,5,玻璃化法,基本原理,:,冷冻前用高浓度低温保护剂置换细胞中的水，使冷却时粘滞性增加，当粘滞性达到临界值时而发生固化，溶液变为玻璃样，而细胞内不形成冰晶。用玻璃化溶液对卵母细胞短暂处理后，直接投入液氮保存，解冻时快速进行,简单、快速、有效，不需要冷冻仪,华中农业大学,动物科技学院,.,5玻璃化法 基本原理:冷冻前用高浓度低温保护剂置换细胞中的,66,思考题,图示卵巢的解剖结构与名称。,卵巢产生的激素有哪些,?,试述雌性动物初情期的主要生理变化。,哪些因素影响初情期的年龄,?,为什么大家畜在性成熟时仍不能进行配种,?,什么叫卵子发生,?,试比较与精子发生的差异。,华中农业大学,动物科技学院,.,思考题 图示卵巢的解剖结构与名称。华中农业大学动物科技学院.,67,何谓卵泡,?,试述卵泡发育过程的形态与结构变化。,绘出成熟卵泡结构图并标示各部位的名称。,发情周期的分期有几种分类方法,?,叙述分期各阶段的生理特征。,黄体是如何形成的,?,动物的黄体有几种类型,?,叙述发情周期的激素调节机制。,思考题,华中农业大学,动物科技学院,.,何谓卵泡?试述卵泡发育过程的形态与结构变化。思考题 华中农业,68,