连接产物的转化

连接产物的转化 1、puc19质 粒 用 HindIII和 EcoRI酶 切 ， 线 性 化 ； 2、目 的 片 段 用 HindIII和 EcoRI酶 切 ， 线 性 化 ；3、 回 收 酶 切 后 的 质 粒 和 目 的 片 段 ， 定 量 ,连 接 ； 一 实 验 目 的 掌 握 细 菌 转 化 的 一 般 技 术 和 原 理 。 二 实 验 原 理 在 基 因 克 隆 技 术 中 ， 转 化 特 指 将 质 粒 DNA或 以 其 为 载 体 构 建 的 重组 DNA导 入 细 菌 体 内 ， 使 之 获 得 新 的 遗 传 特 性 的 一 种 方 法 。 它 是 微 生物 遗 传 、 分 子 遗 传 、 基 因 工 程 等 研 究 领 域 的 基 本 实 验 技 术 之 一 。 使 受体 细 菌 从 周 围 介 质 中 吸 收 外 来 DNA分 子 ， 从 而 获 得 新 的 遗 传 物 质 的 过程 就 是 转 化 。 通 常 所 用 的 受 体 是 大 肠 杆 菌 。 用 于 转 化 的 细 菌 被 称 为 感 受 态 细 胞 。 所 谓 的 感 受 态 ， 即 指 受 体 （ 或 者 宿 主 ） 最 易 接 受 外 源 DNA片段 并 实 现 其 转 化 的 一 种 生 理 状 态 ， 它 是 由 受 体 菌 的 遗 传 性 状 所 决 定的 ， 同 时 也 受 菌 龄 、 外 界 环 境 因 子 的 影 响 。 细 胞 的 感 受 态 一 般 出 现在 对 数 生 长 期 ， 新 鲜 幼 嫩 的 细 胞 是 制 备 感 受 态 细 胞 和 进 行 成 功 转 化的 关 键 。 Ca2+处 理 的 感 受 态 细 胞 ， 其 转 化 率 一 般 能 达 到 5x1062x107 转化 子 /ug质 粒 DNA， 可 以 满 足 一 般 的 基 因 克 隆 实 验 。 如 在 Ca2+ 的 基础 上 ， 联 合 其 它 的 二 价 金 属 离 子 （ 如 Mn 2+ 、 Co2+ ） 、 DMSO或 还原 剂 等 物 质 处 理 细 菌 ， 则 可 使 转 化 率 提 高 1001000倍 。 大 肠 杆 菌 的 转 化 常 用 热 激 法 ， 该 法 最 先 是 由 Cohen于1972年 发 现 的 。 其 原 理 是 细 菌 处 于 0 ， CaCl2的 低 渗 溶液 中 ， 菌 细 胞 膨 胀 成 球 形 ， 转 化 混 合 物 中 的 DNA形 成 抗DNase的 羟 基 -钙 磷 酸 复 合 物 粘 附 于 细 胞 表 面 ， 经 42 短时 间 热 冲 击 处 理 ， 促 使 细 胞 吸 收 DNA复 合 物 ， 在 丰 富 培养 基 上 生 长 数 小 时 后 ， 球 状 细 胞 复 原 并 分 裂 增 值 ， 被 转化 的 细 菌 中 ， 重 组 子 中 基 因 得 到 表 达 ， 在 选 择 性 培 养 基平 板 上 ， 可 选 出 所 需 的 转 化 子 。 除 热 击 法 转 化 细 菌 外 ， 还 有 电 击 转 化 法 ， 电 击 法 不需 要 预 先 诱 导 细 菌 的 感 受 态 ， 依 靠 短 暂 的 电 击 ， 促 使DNA进 入 细 菌 ， 转 化 率 最 高 能 达 到 10 91010转 化 子 /ug闭环 DNA。 因 操 作 简 便 ， 愈 来 愈 为 人 们 所 接 受 。 DNA分 子 转 化 分 以 下 几 步 : 1. 吸 附 双 链 DNA分 子 吸 附 于 受 体 菌 表 面 ； 2. 转 入 双 链 DNA分 子 解 链 。 一 条 链 进 入 受 体 菌 ， 另一 条 降 解 ； 3. 自 稳 外 源 质 粒 DNA分 子 在 细 胞 内 复 制 成 双 链 ； 4. 表 达 一 供 体 基 因 随 同 复 制 子 同 时 复 制 ， 分 裂 ， 转 录 翻译 重 组 子 的 筛 选 抗 生 素 标 记 法 ： 菌 株 为 某 种 抗 生 缺 陷 型 ， 而 质 粒 上 带 有 该 抗 性 基 因（ 如 氨 苄 青 霉 素 ， 卡 那 霉 素 等 ） 这 样 只 有 转 化 子 才 能 在 含 该 抗 生 素的 培 养 基 上 长 出 。 互 补 法 ： 现 在 使 用 的 许 多 载 体 （ 如 PUC系 列 ） 有 含 有 一 个 大 肠 杆 菌 的 短 区 段 ， 其 中 含 有 半 乳 糖 苷 酸 基 因 （ lacZ） 的 调 控 序 列和 头 146个 氨 基 酸 偏 码 区 。 这 个 偏 码 区 中 插 入 一 个 多 克 隆 位 点 。 受 体 菌 则 含 编 码 半 乳 糖 苷 酶 端 aa的 序 列 。 半 乳 糖 苷 酶 表 达 ， 在 底 物 5 溴 4 氯 3 吲 哚 D 半 乳 糖 苷 （ x-gal） 培 养 基中 形 成 兰 色 菌 落 。 而 当 有 外 源 基 因 插 入 到 多 克 隆 原 点 ， 从 而 造 成 插 入 失 活 ， 而 使 lacZ基 因 不 表 达 而 形 成 白 色 菌 斑 。 通 过 颜 色 不 同 而 区 分 重 组 子 和 非 重 组子 。 实验步骤： 1） 将 2l连 接 产 物 与 100l感 受 态 细 胞 在 冰 上 混 匀 ， 并 静 置30min， 42 下 处 理 60sec， 然 后 加 入 600l的 LB（ A-） 液 体培 养 基 ， 在 摇 床 上 37 摇 动 培 养 1hr。 （ 2） (在 LB（ A+） 平 板 上 涂 布 40l的 X-gal和 4lIPTG 溶 液 )待 完 全 吸 收 后 ， 将 转 化 产 物 离 心 后 悬 浮 ， 涂 平 板 。 37 过 夜培 养 。