第11章免疫分析课件

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/10/28,*,单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/10/28,*,第十一章,免疫分析技术和相关仪器,2020/10/28,1,第十一章 2020/10/281,第一节 酶免疫分析仪,一、酶免疫分析技术的分类：,酶免疫分析,(enzyme immunoassay,，,EIA),根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为,:,酶扩大免疫测定,均相酶免疫测定,克隆酶供体免疫测定,液相酶免疫法,非均相酶免疫测定,固相酶免疫法,(,酶联免疫吸附测定,enzyme linked immunosorbent assay,，,ELISA,）,2020/10/28,2,第一节 酶免疫分析仪一、酶免疫分析技术的分类：酶免疫分析(,精品资料,2020/10/28,3,精品资料2020/10/283,需要了解的基本概念,酶免疫测定,（,Enzyme Immunoassay, EIA),均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定,异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定,.,分离的方法主要通过固相载体，故此法称为,固相酶免疫测定,ELISA,。,ELISA,的测定模式,:,双抗体夹心法,间接法,竞争法,2020/10/28,4,需要了解的基本概念酶免疫测定（Enzyme Immunoas,双抗体夹心法（三明治法）原理,固相支持物表面,包被抗体,标记抗体,待测物,2020/10/28,5,双抗体夹心法（三明治法）原理固相支持物表面包被抗体标记抗体待,夹心法的剂量,-,反应关系曲线,信号强度（,Y,）,线性范围,待测物浓度（,X,）,Hook,效应,2020/10/28,6,夹心法的剂量-反应关系曲线信号强度（Y）线性范围待测物浓度,竞争法的原理,固相支持物表面,待测物,包被抗体,标记抗原,2020/10/28,7,竞争法的原理固相支持物表面待测物包被抗体标记抗原2020/1,竞争法的剂量,-,反应关系曲线,待测物浓度（,X,）,信号强度（,Y,）,线性范围,2020/10/28,8,竞争法的剂量-反应关系曲线待测物浓度（ X ）信号强度（,间接法原理,包被体,待测抗体,包被抗原,标记抗体,（二抗）,2020/10/28,9,间接法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗体2020/10/28,俘获法原理,俘获抗体,（二抗）,待测抗体,标记抗原,包被体,2020/10/28,10,俘获法原理俘获抗体待测抗体标记抗原包被体2020/10/28,双抗原夹心法原理,包被体,待测抗体,包被抗原,标记抗原,2020/10/28,11,双抗原夹心法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗原2020/10,我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为,酶标仪,。,一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能，还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐。,全自动酶联免疫系统,集加样品、加试剂、孵育、震荡、洗板、读数、数据处理,7,大功能于一体。,2020/10/28,12,我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为酶标仪。202,二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构,微孔板固相酶免疫测定仪器,(,酶标仪,),半自动微孔板,ELISA,分析仪,全自动微孔板,ELISA,分析仪,管式固相酶免疫测定仪器,小珠固相酶免疫测定仪器,磁微粒固相酶免疫测定仪器等,2020/10/28,13,二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构微孔板固相酶免疫测,有单通道和多通道两种类型,工作原理与主要结构和光电比色计相同,不同之处在于：,比色液的容器是塑料微孔板,以垂直光束通过待测液,通常使用光密度,OD,来表示吸光度,1,、微孔板固相酶免疫测定仪器,2020/10/28,14,有单通道和多通道两种类型 1、微孔板固相酶免疫测定仪器202,2020/10/28,15,2020/10/2815,2020/10/28,16,2020/10/2816,2,、半自动微孔板式,ELISA,分析仪,在酶标仪的基础上再配置,:,加液器,温育器,洗板机,测读仪,测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。,2020/10/28,17,2、半自动微孔板式ELISA分析仪 在酶标仪的基础上再配置:,3,、全自动微孔板式,ELISA,分析仪,自动化酶免疫分析系统由,:,加样系统,温育系统,洗板系统,判读系统,机械臂系统,液路动力系统,软件控制系统等组成,2020/10/28,18,3、全自动微孔板式ELISA分析仪自动化酶免疫分析系统由:2,2020/10/28,19,2020/10/2819,温育箱,反应板,迭式存储器,2020/10/28,20,温育箱反应板迭式存储器2020/10/2820,X-Y,头架,2020/10/28,21,X-Y头架2020/10/2821,样品架,50,根装,503,2020/10/28,22,4,根独立上下吸移管,2020/10/28,23,检,测,光,纤,2020/10/28,24,反应板,反应板,夹具,2020/10/28,25,清,洗,装,置,2020/10/28,26,供水箱,废水箱,2020/10/28,27,2020/10/28,检测时间,:,以乙肝两对半（立可读）为例,仪器操作各单元如下（满板）,加样品时间：,6-7,分钟；,9-10,分钟（使用液面传感器）,加酶时间：,4,分,46,秒,(,洗,5,遍，不浸泡,),加两种显色剂,A,、,B,共：,5,分,30,秒,加终止液：,2,分,42,秒,读板时间：,2,分,58,秒,2020/10/28,28,检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例 仪器操作各单元如下（,优势,自动化程度高：,前后处理一体化设计，减少人与样品的,接触机会，降低感染。各种自动安全检,测能。,稳 定：,只要避免人为操作错误，,可连续数年良好工作。,准 确：,不存在交叉感染。反应振荡，,确保检测 准确。,2020/10/28,29,优势自动化程度高： 2020/10/2829,高 速：,加注、读板速度快,扩 展 性：,软件可升级，样本量增加，可联机使用,用户做主更多：,开放式试剂,WINDOW,操作系统,中,/,英,/,日自选操作界面,自定义编程,自动,/,自定义时间表,无限存档,2020/10/28,30,高 速：2020/10/2830,4,、管式固相酶免疫测定仪,1990,年德国推出的全自动管式,ELISA,分析系统和配套试剂,用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物,ABTS,测定中标准曲线可使用,2,星期，每次测定只需一点定标,测定的精密度,CV,在,3%,左右,2020/10/28,31,4、管式固相酶免疫测定仪1990年德国推出的全自动管式ELI,5,、微粒固相酶免疫测定仪,美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗粒直径,0.47m,）作为固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。,第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。,以后的反应在膜上进行，标记酶为,ALP,，底物为,4-,甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。,2020/10/28,32,5、微粒固相酶免疫测定仪美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯,6,、磁微粒固相酶免疫测定仪,瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和试剂组成：,试剂包括：,抗异硫氰酸荧光素（,FITC,）抗体,特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径,1m,）,FITC,结合的特异抗体或抗原,碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原,底物酚肽（,phenolphthalein,）磷酸酯,反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色。,什么样的反应,2020/10/28,33,6、磁微粒固相酶免疫测定仪 瑞士出品的分析系统由分光光,磁颗粒,ELISA,是将两株单抗分别标记酶和异硫氰酸荧光素,(FITC),，另将一抗,FITC,抗体经化学反应与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然后加入可磁化抗,FITC,颗粒分离剂，生成夹心免疫复合物，洗涤，加酶底物显色。,2020/10/28,34,磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰酸荧光素(FI,三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养,（一）评价指标和方法,1,滤光片波长精度检查及其峰值测定,2,灵敏度和准确度,3,通道差与孔间差检测,4,零点飘移,5,精密度评价,6,线性测定,7,双波长评价,2020/10/28,35,三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养（一）评价指标和方法20,重点是光学部分,1,滤光片波长精度检查,2,通道差与孔间差检测,2020/10/28,36,重点是光学部分2020/10/2836,四、酶免疫分析仪的临床应用,病原体及其抗体的检测,2,各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等,3,肿瘤标志物,4,多种激素,5,药物和毒品,2020/10/28,37,四、酶免疫分析仪的临床应用病原体及其抗体的检测2020/,辣根过氧化物酶的色原底物,HRP,最常用的色原底物有,:,邻苯二胺,(OPD),、,2,，,2-,吖嗪,-(3-,乙酰苯基噻唑磺酸,-6)ABTS(,杂环吖嗪,),四甲基联苯胺,(TMB),4-,氨基安替比林：苯酚耦联底物对,2020/10/28,38,辣根过氧化物酶的色原底物HRP最常用的色原底物有:2020/,OPD,被认为是,HRP,最为敏感的色原底物之一，其在,HRP,的作用下，由过氧化氢,(H,2,0,2,),氧化而聚合成,2,，,2-,二氨基偶氮苯,(DAB),。在,pH5,.,0,左右时，,DAB,在波长,450nm,处有广范围的最大吸收，当,pH,值降为,1,.,0,时，最大吸收波长移动至,492nm,，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。,OPD,的缺点是其对机体具有致突变作用。,2020/10/28,39,OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用,TMB,的显色反应虽与,OPD,一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂,(,维生素,C,及亚硫酸钠、,SDS,等,),，则可反应显色迅速消退。,TMB,虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了,OPD,而成为,HRP,最为常的色原底物。,测定波长：,450nm,2020/10/28,40,TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应,