第二章生物反应器设计基础课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章,生物反应器设计基础,第二章生物反应器设计基础,1,第一节,酶催化反应动力学,第一节 酶催化反应动力学,2,酶催化反应的基本特征,酶是生物提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质是蛋白质。,在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密联系。,生物酶分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。,酶催化反应的基本特征 酶是生物提高其生化反应效率而产生的,3,酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较,催化剂,反应,转换数,mol/（中心点,S）,温度,酶催化剂,菠萝蛋白酶,木瓜蛋白酶,胰蛋白酶,碳酸肝酶,肽的水解,肽的水解,肽的水解,羰基化合物的可逆反应,410,-3,510,-1,810,-2,110,310,-3,110,2,810,-1,610,5,037,037,037,037,化学催化剂,硅胶氧化铝,硅胶氧化铝,二氧化钒,二氧化钒,异丙基苯裂解,异丙基苯裂解,环己烷脱氢,环己烷脱氢,310,-8,210,4,710,-11,110,2,25,420,25,350,酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较酶催化剂化,4,酶活力表示方法,酶的分子活力：,在最适宜条件下，每 1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）,酶的催化中心活力：,在单位时间内，每一个酶的催化中心所催化底物的量（mol）,酶活力：,在特定条件下，每1min能催化1mol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称为国际单位，用U表示。酶活力还可用比活力表示。比活力系指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。,酶活力表示方法,5,酶的专一性,绝对专一性,：,一种酶只能催化一种化合物进行一种反应,。,相对专一性,：一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应,。,反应专一性,：一种酶只能催化某化合物在热力学上可能进行的许多反应中的一种反应,。,底物专一性,：,一种酶只能催化一种底物,。,立体专一性,：一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种,。,酶的专一性,6,第二节,均相的酶促反应动力学,第二节均相的酶促反应动力学,7,1.1. 酶促反应的Michaelis-Menten方程,1.1.1. 酶促反应的Michaelis-Menten方程,Michaelis、Menten（1913）提出了单一底物的酶反应模型，基本内容是：酶,E,的底物,S,首先形成酶底物复合物,ES,，在酶底物复合物,ES,的基础上反应生成产物,P,和酶,E,。反应式如下：,E,+,S ES,E,+,P,k,+1,k,+2,k,1,1.1. 酶促反应的Michaelis-Menten方程E+,8,其中：,k,+1,，,k,1,，,k,+2,反应速度常数,E,，,S,，,ES,，,P,酶，底物，酶-底物复合物，产物,根据Michaelis、Menten的单一底物的酶反应模型，其假设条件为：,（1）在反应过程中，限制反应速度的反应是,ES,到,E,+,P,这一步反应；,（2）,E,+,S,到,ES,的反应在整个过程中始终处于动态平衡；,（3）酶以酶游离状态,E,和酶-底物复合物,ES,的形式存在，酶在反应过程中总浓度不变；,（4）底物浓度比酶-底物络合物浓度要大得多。,其中：k+1，k1，k+2反应速度常数,9,根据反应的假设条件，可以看出Michaelis、Menten所建立的酶促反应模型式建立在平衡的基础之上的，因而称之为“,平衡态理论,”。,根据反应的假设条件，可以看出Michaeli,10,根据假设（1），有单一底物的酶催化反应的反应速度：,（1-1）,式中：,C,P,，,C,S,产物，底物的浓度,t,时间,根据假设（2）有,（1-2）,根据假设（1），有单一底物的酶催化反应的反应,11,即 ：,（1-3）,式中： 酶底物复合物的解离常数,即 ：,12,根据假设（3），有：总酶量：,（1-4）,联立（1-1）、（1-2）、（1-3）、有,（1-5）,式中：,V,max,最大的酶促反应速度。,（1-6）,根据假设（3），有：总酶量：,13,1.1.2 Briggs-Haldane对M-M方程的修正,1925年 Briggs和Haldane认为在酶促反应过程中，反应的中间体,ES,（酶-底物复合物）的浓度不随反应时间而变化，即在酶促反应过程中，反应的中间体,ES,的浓度处于稳定的状态，基于这一假设所得到的酶促反应的模型称之为“,稳定态理论,”。即,（1-7）,1.1.2 Briggs-Haldane对M-M方程的修正,14,则,（,1-8）,其中,（,1-9）,称作M-M常数,则,15,代入总酶量,（,1-4）,得,（1-10）,将（1-10）式代入（1-1）式，有,（1-11）,代入总酶量,16,1.1.3 Michaelis-Menten方程的参数估计,对特定的酶促反应，其动力学的M-M方程中的,V,max,和,K,m,是该酶促反应的特征参数。对,V,max,和,K,m,的确定的方法有Lineweaver-Burk法 ；Hanes-Woolf法 ；Eadie-Hofstee法 ；积分法 等,（1） Lineweaver-Burk法（简称L-B法）,对M-M方程（1-11）式取倒数，得到,（1-12）,1.1.3 Michaelis-Menten方程的参数估,17,（2） Hanes-Woolf法（简称H-W法）,对L-B法的（1-12）式的等式两端同乘,C,S,，此种方法减少了,C,S,值过大或过小所带来的测量误差。,（1-13）,（3）Eadie-Hofstee法（简称E-H法）,将M-M方程重排得到 ：,（,1-14）,（2） Hanes-Woolf法（简称H-W法）,18,（4）积分法,用不同的酶促反应的时间,t,与其反应过程相对应的底物浓度之间的函数关系通过作图或回归的方法确定酶促反应动力学参数。,（1-15）,（4）积分法,19,例：在pH5.1、15下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度,V,0,如表所示。求这一酶促反应的动力学参数,V,max,和,K,m,。,表1-1 葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度与底物浓度,C,S,（mmol/L）,V,0,（mmol/ L,min）,5.55,0.163,8.33,0.211,11.11,0.241,13.89,0.276,16.66,0.301,22.22,0.339,27.77,0.347,例：在pH5.1、15下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的,20,解：采用Lineweaver-Burk法，对实验数据回归，有,则,解：采用Lineweaver-Burk法，对实验数据,21,第二章生物反应器设计基础课件,22,采用Hanes-Woolf法，对实验数据回归，有,则,采用Hanes-Woolf法，对实验数据回归，有,23,第二章生物反应器设计基础课件,24,采用Eadie-Hofstee法，对实验数据回归，有,则,采用Eadie-Hofstee法，对实验数据回归，有,25,第二章生物反应器设计基础课件,26,1.1.4 酶促反应的反应级数,（1） 当,C,S,远小于,K,m,时 ，为一级反应,（2） 当,C,S,远大于,K,m,时，为零级反应。,1.1.4 酶促反应的反应级数,27,（3） 当,C,S,介于上述两者之间时 ，为0至1级反应,（3） 当CS介于上述两者之间时 ，为0至1级反应,28,1.2 有抑制作用的酶促反应动力学,1.2.1 竞争性抑制的酶促反应动力学,当反应物系中存在与底物的结构相似的物质，这一物质也可能与酶的活性部位结合，形成非活性的复合物，阻碍了酶与底物的结合，从而影响酶促反应，这种抑制作用称为竞争性抑制。,1.2 有抑制作用的酶促反应动力学,29,竞争性抑制的机理为：,其中：,k,+3,，,k,+3,反应速度常数,I,，,EI,抑制剂，酶-抑制剂复合物,E,+,S ES,E,+,P,k,+1,k,+2,k,1,E,+,I EI,k,+3,k,3,竞争性抑制的机理为：E+S ES,30,基于稳定态理论，有,（1-16）,（1-17）,总酶量为,（1-18）,基于稳定态理论，有,31,联立（1-4）、（1-16）、（1-17）、（1-18）式，有,（1-19）,式中：,K,mI,竞争性抑制的表观M-M常数,K,I,抑制剂的解离常数,（1-20）,联立（1-4）、（1-16）、（1-17）、（1-18）式，,32,第二章生物反应器设计基础课件,33,对有竞争性抑制的酶促反应动力学方程（1-19）式取倒数得到,（1-21）,对有竞争性抑制的酶促反应动力学方程（1-19,34,第二章生物反应器设计基础课件,35,1.2.2 非竞争性抑制的酶促反应动力学,当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑制。,与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，无论如何提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。,1.2.2 非竞争性抑制的酶促反应动力学,36,非竞争性抑制的作用机理为：,E,+,S ES,E,+,P,k,+1,k,+2,k,1,E,+,I EI,k,+3,k,3,EI,+,S SEI,k,+4,k,4,ES,+,I SEI,k,+5,k,5,非竞争性抑制的作用机理为： E+S E,37,其中：,k,+4,，,k,-4,，,k,+5,，,k,-5,，反应速度常数,I,，,EI,抑制剂，酶-抑制剂复合物,IES,底物、酶-抑制剂三元复合物,基于稳定态理论，有,（1-22）,总酶量为,（1-23）,其中：k+4，k-4，k+5，k-5，反应速度常数,38,有非竞争性抑制的酶促反应动力学方程,（1-24）,有非竞争性抑制的酶促反应动力学方程,39,第二章生物反应器设计基础课件,40,第二章生物反应器设计基础课件,41,1.2.3,反竞争性抑制动力学,反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物E,S,相结合生成SEI复合物。,1.2.3反竞争性抑制动力学 反竞争性抑制的特点是抑制剂,42,根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其速率方程为,或,式中,根据上述各定义式，可以退出,根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其速率方程为或式中根,43,第二章生物反应器设计基础课件,44,1.2.4 高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学,应用稳态理论，可得到底物抑制的酶促反应动力学方程为,（1-25）,E,+,S ES,E,+,P,k,+1,k,+2,k,1,ES,+,S SES,k,+3,k,3,1.2.4 高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学E+S,45,根据,即,根据,46,解得：最佳底物浓度：,解得：最佳底物浓度：,47,第二章生物反应器设计基础课件,48,例：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.210,-1,mmolL的抑制剂，并测其初始的反应速率，其数据见下表。,根据下述数据决定其抑制类型及动力学参数。,例：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物,49,1.2.5 复杂的酶催化反应动力学,一、可逆酶反应动力学,K,mp,和,Km,分别为正、逆反应米氏常数；,r,P,max,rs,ma,x,分别为正逆反应的最大速率,若将生成P的反应视为正反应，其速率为,若将生成S的反应视为逆反应，其速率为,反应净速率则为：,根据稳态假设和物料平衡关系，并令,1.2.5 复杂的酶催化反应动力学Kmp和Km分别为正、逆,50,反应的净速率式,若令：,式中,Ke,一一反应平衡常数,则,：,反应的净速率式 若令： 式中 Ke一一反应平衡常数 则：,51,二、产物抑制的酶反应动力学,产物抑制系指当产物与酶形成复合物EP后，就停止继续进行反应的情况，特别是当产物浓度较高时有可能出现这种抑制。,其反应机理,所生成EP为无活性的端点复合物,应用稳态法推导得出如下反应速率方程式,二、产物抑制的酶反应动力学其反应机理所生成EP为无活性的端,52,三、,多底物酶反应动力学,（1）随机机制,两个底物,S1,和,S2,随机地与酶结合，产物,P,1,和,P,2,也随机地释放出来。,其机理可表示为,三、 多底物酶反应动力学其机理可表示为,53,式中,:C,s1,和,C,s2,分别为底物,sl,与,s2,的浓度，,K,1,、,K3,、,K,4,分别为相应各步的解离常数,式中:Cs1和Cs2分别为底物sl与s2的浓度，K1、K3、,54,（2）,顺序机制,两个底物S,l,和s,2,与酶结合成复合物是有顺序的，酶先与底物s,1,结合形成Es,1,复合物，然后该复合物Esl再与s,2,结合形成具有催化活性的ES,1,S,2,。,按同样推导方法求出下述方程式：,式中,:C,s1,和,C,s2,分别为底物,sl,与,s2,的浓度，,K,1,、,K3,、,K,4,分别为相应各步的解离常数。,（2） 顺序机制,55,（3）,乒乓机制,与 始终不同时与,酶结合，其机理可表示为（ 为修,改过的酶）：,导得：,(2.38),（3）乒乓机制酶结合，其机理可表示为（ 为修 改过的,56,四、,变构酶催化反应动力学,如磷酸果糖激酶，天冬氨酸转氨甲酰酶，苏氨酸脱氢酶和己糖激酶等的催化反应，底物分子与这类酶结合时能诱导 酶的结构改变增加E与S的结合能力，表现出底物对酶的激活 效应。其机理复杂提出的模型较多，一般用Hill,经验公式：,(2.39),式中：nHill,指数表示每个酶分子与底物结合部位的数目，,n=13.2,参数求取：,(2.40),四、 变构酶催化反应动力学(2.39) 式中：nH,57,与式(2.39),(2.40)相应的曲线见图2.15,图2.16。,（还有常用的表达式：,等）,图2.15Hill,经验方程,图2.16变构酶动力学参数,与式(2.39),(2.40)相应的曲线见图2.15,图2.,58,1.,3,影响酶催化反应的因素,内部因素酶的结构特征，底物的结构特征。,外部因素pH,t,p,离子强度， ,（1）,pH,值的影响,酶分子上AA侧链基团一定的解离状态及其解离度（催化活性）,一般酶活性与pH呈钟型曲线为图2.9,1.3 影响酶催化反应的因素内部因素酶的结构特征，底物的,59,4,8,12,图2.9 某酶的稳定性与,活性,PH,-r,s,相对值,4812图2.9 某酶的稳定性与活性PH-rs相对值,60,（2）温度的影响,TTopt则其对酶促反应的速度常数K,+2,的影响符合Arr.eq:,K,+2,=A.exp(-Ea/RT) (2.41),（2）温度的影响,61,第三节,细胞反应动力学,第三节细胞反应动力学,62,化学计量基础,生物反应的质量衡算,生物反应过程的得率系数,生物学基础,细胞数动力学,无抑制的细胞生长动力学,有抑制的细胞生长动力学,产物形成动力学,环境因素对生长及代谢的影响,传质,气-液传质,液体-微生物传质,传热,剪切力问题,化学计量基础 传质,63,细胞反应过程特征,细胞反应过程系：以细胞为反应主体的一类生化反应过程。包括微生物反应和动植物细胞培养过程。,细胞反应过程主要特性：,（1）细胞是反应过程的主体；,（2）细胞反应过程的本质是复杂的酶催化反应体系；,（3）细胞反应与酶催化反应也有着明显的不同：,(一) 酶催化反应为分子水平上的反应，酶本身不进行再生产；,(二) 在细胞反应过程中细胞的形态、组成、活性都处于动态变化过程。,细胞反应过程特征 细胞反应过程系：以细胞为反应主体的一,64,营养物（C源、N源、O,2、,无机盐类等）细胞+代谢产物（产物、C O,2,、 H,2,O等）,CH,m,O,l,+aNH,3,+bO,2,Y,b,CH,p,O,n,N,q,(生物量)+ Y,p,CH,r,O,s,N,t,(产物)+ c H,2,O + dC O,2,对化学方程式进行元素衡算，得下列方程组：,生物反应的质量衡算,细胞反应的元素衡算：,营养物（C源、N源、O2、无机盐类等）细胞+代谢产物（产物,65,CH,m,O,l,+aNH,3,+bO,2,Y,b,CH,p,O,n,N,q,(生物量)+ Y,p,CH,r,O,s,N,t,(产物)+ c H,2,O + dC O,2,根据细胞、基质和产物的还原度可以列出有效电子平衡方程：,还原度,：某化合物中每一克碳原子的有效电子当量数。,化合物中任何元素的还原度等于该化合物的化合价。例如：NH,3,中氮、氢的还原度为: N = 3, H = 1,CHmOl+aNH3+bO2 YbCH pO nNq (生,66,细胞反应过程的得率系数,对基质的细胞得率,Y,x/s,对氧的细胞得率,Y,x/o,对基质的产物得率,Y,p/s,对碳的细胞得率,Y,C,细胞反应过程的得率系数 对基质的细胞得率Yx/s 对氧的,67,基质的细胞得率,Y,x/s,与比生长速率的关系,比生长速率,：生长速度大小的参数。,维持的定义：,式中,Y,XS,细胞对基质的得率；,最大得率；,m,s,维持系数；,比生长速率。,无产物时，基质的线性方程：,式中,合成单位细胞的基质消耗速率；单位细胞的产物生产率。,有产物时，基质的线性方程：,基质的细胞得率Yx/s与比生长速率的关系比生长速率：生长速,68,细胞数动力学,细胞生长分为几个阶段：停滞期、对数生长期、减速期、平衡期和死亡期。,图2.1 典型的细菌生长曲线,细胞数动力学细胞生长分为几个阶段：停滞期、对数生长期、减速期,69,在指数生长期，细胞量生长速度为：,细胞数增长速度为：,对式2.7在t,0,t，,X,0,X,积分，得：,由式2.9，得倍增时间,t,d,：,微生物细胞,max,值较大，倍增时间约0.55h，而动物细胞,max,值小得多，动物细胞的倍增时间约15100h，植物细胞倍增时间约2474h。,在指数生长期，细胞量生长速度为：细胞数增长速度为：对式2.7,70,Monod方程(无抑制的细胞生长动力学)：,无抑制的细胞生长动力学,Monod方程是典型的均衡生长模型，其基本假设为：,(1) 细胞的生长为均衡式生长；,(2) 培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其他组分为过量，不影响细胞的生长；,(3) 细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。,Monod方程仅适用于细胞生长较慢和细胞密度较低的环境下。,式中,为比生长速率;,max,为最大比生长速率;C,S,为限制性基质浓度;,K,S,为饱和常数, 当, ,max,/2时的限制性基质浓度。,Monod方程(无抑制的细胞生长动力学)：无抑制的细胞生,71,有抑制的细胞生长动力学,基质抑制动力学,对反竞争性抑制，其抑制机理可假设为：,式中,细胞比生长速率,为：,而,有抑制的细胞生长动力学 基质抑制动力学对反竞争性抑制，其抑制,72,对竞争性抑制，细胞比生长速率为：,对非竞争性抑制，细胞比生长速率为：,对竞争性抑制，细胞比生长速率为：对非竞争性抑制，细胞比生长速,73,表2.1 有无抑制的,酶促反应动力学,和,细胞生长动力学,比较,表2.1 有无抑制的酶促反应动力学和细胞生长动力学比较,74,产物的抑制动力学,几个经验公式：,产物的抑制动力学几个经验公式：,75,产物形成动力学,Gaden,根据产物生成速度与细胞生长速度之间的关系，将代谢产物生成动力学分为三种类型：,类型(相关模型)：是指产物的生成与细胞的生长相关的过程，产物是细胞能量代谢的结果。属于此类型的有乙醇、葡萄糖酸、乳酸的生产等。,产物形成动力学：,图2.2 Gaden类型,产物形成动力学 Gaden根据产物生成速度与细胞生长速,76,图2.2 Gaden模型分类,类型(部分相关模型)：该类反应产物的生成与基质消耗仅有间接结果，产物是能量代谢的间接结果。属于此类型的有柠檬酸和氨基酸的生成。,类型 (非相关模型)：产物的生成与细胞的生长无直接联系，产物是二次代谢物。属于此类型的有抗生素、微生物毒素等代谢产物的生成。,图2.2 Gaden模型分类类型(部分相关模型)：该,77,环境因素对生长及代谢的影响,温度,pH值,在适宜的温度范围内，细胞净增长率方程为：,根据Arrhenius方程，有：,所以：,图2.3,E.coli,生长速率的Arrhenius图,环境因素对生长及代谢的影响 温度 pH值 在适宜的,78,生物反应器的质量传递,膜厚：,G,L1,传质系数：,k,G,k,L1,k,L2,L2,C,O,Z,图2.4 氧从气泡传递到细胞的示意图,图2.5 氧从气泡传递到细胞的示意图,生物反应体系中的氧传质模型,双膜理论：,（1）气泡中的氧通过气相边界层传递气-液界面上,（2）氧分子由气相侧通过扩散穿过界面。,（3）在界面液相侧通过液相滞流层传递到液相主体。,（4）在液相主体中进行传递。,（5）扩散通过生物细胞表面到液相滞流层传递进入生物细胞内。,生物反应器的质量传递膜厚：GL1传质系数：kGkL1kL,79,氧传递方程式,体积质量传递系数,k,L,a：,质量传递比速率，在单位浓度差下，单位时间、单位界面面积所吸收的气体。该系数由两项产生：(1)质量传递系数,k,L，,它取决于流体的物理特性和靠近流体表面的流体动力学； (2)通气反应器单位有效体积的气泡面积a。,质量传递系数,k,L,：,质量传递系数是基质（或其他被传递的化合物）的质量通量,N,s,与推动这一现象的梯度（浓度差）之间的比例因子：,氧的传递速率：,用,k,L,a的大小衡量发酵设备的通气效率，实验室用摇瓶，其,k,L,a值约为10100h,-1,；带搅拌的发酵罐，其,k,L,a值为200 1000h,-1,。,氧传递方程式 体积质量传递系数kLa： 质量传递系数kL,80,生物反应器的热量传递,生物反应器的传热过程,热量平衡方程：,碳源+O,2,CO,2,+H,2,O,CO,2,+H,2,O+细胞,H,S,完全氧化途径,呼吸途径,细胞氧化途径,H,C,基质消耗过程的热平衡：,式中,Q,E,单位体积培养基中除去热量速率，J/(m,3。,s）；,Q,B,单位体积培养基因生化反应的放热速率，J/(m,3。,s）；,Q,A,单位体积培养基因搅拌造成的放热速率，J/(m,3。,s）；,Q,S,， Q,V,分别为单位体积培养基因通气带走的显热和蒸发热 速率，J/(m,3。,s）；,Q,R,单位体积培养基向周围环境的散失热速率，J/(m,3。,s）；,Q,A,单位体积培养基因搅拌造成的放热速率，J/(m,3。,s）；,生物反应器的热量传递生物反应器的传热过程热量平衡方程：碳源+,81,