白血病微小残留病灶-课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,白血病微小残留病,1,白血病微小残留病1,Initial Therapy of AML,Diagnosis,Complete remission (CR) must be attained to cure patient,CR defined as:,Clearance of peripheral blood & bone marrow of leukemic blasts,Reconstitution of normal hematopoiesis,Resolution of leukemic infiltrates,Remission,Induction,Post-remission,Therapy,Consolidation,Chemotherapy,SCT,2,Initial Therapy of AML Diagnos,精品资料,精品资料,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”,白血病微小残留病灶-课件,定义,Minimal residual disease(MRD)-微小残留病,指白血病诱导化疗完全缓解后或者骨髓移植后残留在体内少,量白血病细胞的状态,可能是导致白血病复发的根源,白血病细胞负荷,初次诊断 - 10,12,形态学缓解 - 10,10,以下,分子学缓解 - 约10,6,-10,7,5,定义5,Acute leukemia and CML Concept of minimal residual disease (MRD),10,12,10,10,10,6,Cell number,Time,Morphological detection limit,PCR detection limit,I,6,Acute leukemia and CML Concep,7,7,检测MRD的意义,根据细胞负荷调整缓解后化疗方案,更早发现药物耐药性,更早预测白血病复发,评价骨髓移植净化效果,为实验研究提供依据,8,检测MRD的意义根据细胞负荷调整缓解后化疗方案8,MRD主要检测方法,一、染色体核型分析,二、荧光原位杂交- FISH,三、流式细胞仪-FCM,四、聚合酶链反应技术-PCR,五、其他：细胞培养技术，免疫荧光等,9,MRD主要检测方法9,染色体核型分析,常用染色体显带技术检测出染色体畸变,但其成功率依赖于标本中分裂象细胞的数量多少，从而使得检测结果各不相同，且敏感度较低，约1：20,10,染色体核型分析常用染色体显带技术检测出染色体畸变,但其成功率,FISH,fluorescence in situ hybridization,用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针，通过与间期细胞核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色体数目和结构的异常，可以进行定性、定位和相对定量分析 。,优点：FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.,11,FISH fluorescence in situ hybr,Interphase and metaphase FISH demonstrating a variant of the Philadelphia chromosome. The genes that are rearranged are:,BCR,(green on chromosome 22)/,ABL,(orange on chromosome 9)The Ph translocation appears as dual fusion (yellow) signals.,Karyotype showing the Philadelphia chromosome.46,XX,t(9;22)(q34.1;q11.2),12,12,Figure 5: Detection of,PML-RARa,gene fusion by interphase FISH:Left: S-FISH (one wild type PML, one wild type RARa, and one yellow fusion signal);Right: D-FISH (one wild type PML, one wild type RARa, and two yellow fusion signals).,13,Figure 5: Detection of PML-RAR,RT-PCR 逆转录聚合酶链反应技术,利用染色体易位形成的肿瘤特异融合基因或基因重排作为分子靶，在引物作用下，通过聚合酶链反应，短时间内将特异性序列扩增百万倍，然后用凝胶电泳显示出来,优点：特异性、灵敏度大大提高（可达10,-5,10,-6,）,14,RT-PCR 逆转录聚合酶链反应技术利用染色体易位形成的肿瘤,QRT-PCR-荧光实时定量PCR,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具,目前real-time Q-PCR实验成本比较高，且各实验室标准不一，从而也限制了其广泛的应用。,15,QRT-PCR-荧光实时定量PCR在PCR反应体系中加入,流式细胞Flow Cytometry,测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光,经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器,光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，以调出显示和进行分析。,造血细胞在不同分化阶段有不同的分化抗原（CD）表达。恶性肿瘤细胞可表现为抗原表达紊乱的现象如抗原的出现或消失与细胞分化水平的不同步，出现与正常细胞不同的抗原组合，即为白血病相关免疫表型,多参数 如四色染色技术，可用于AMLALLCML,快速、准确、重复性好，可行定量及动态观察，敏感度可达10,-4,以上,16,流式细胞Flow Cytometry16,MRD 检测在AML中的应用,评价AML治疗预后因素,诱导治疗后白血病细胞负荷减少程度及达到CR时间被认为是提示预后的独立因素,MRD检测目的：,预示分子学复发，尽早解救治疗,17,MRD 检测在AML中的应用评价AML治疗预后因素17,特殊遗传学改变的AML,最常见的三种染色体改变及融合基因,-,t(8;21)(q22;q22),AMLI-ET0,-,t(15;17)(q22;q11-22),PML-RARA,-,inv(16)(p13q22)/t(16;16),CBFP-MYHII,*约占所有AML染色体改变的20%，具有以上改变者预 后良好 ,但仍有10-30%治疗失败,其他染色体异常,t(9; 11 )(p21-22;q23),MLL-AF9,t(9;22)(q34;q11),BCR-ABL,t(6;9)(p23;q34),DEK-CAN,18,特殊遗传学改变的AML 最常见的三种染色体改变及融合基因18,APL,-,t(15;17)(q22;q11-22),PML-RAR,90-95% PML-RAR,(+)患者在诱导或巩固治疗后阶段可达转为阴性,PML-RAR ,持续阳性或由阴转阳则预示即将发生血液学复发,巩固及维持治疗阶段监测融合基因对调整治疗方案有指导意义,但是融合基因持续阴性并不代表不会复发,19,APL-t(15;17)(q22;q11-22) PM,巩固治疗结束后MRD检测及其意义,方法的标准化：在有经验的实验室，用低敏感（10,-4,）RT-PCR方法,PML/RAR（+）定义：指在完成巩固治疗后，间隔4周的二次骨髓标本，在两个有经验的实验室证实,标准方案巩固治疗：MCR可达90%-99%,MDR检测结果决定后续治疗选择,20,巩固治疗结束后MRD检测及其意义方法的标准化：在有经验的实验,UK MRC Trial,Burnett AK，et al.Blood1999;93:4131,巩固治疗结束后MRD状态与复发的关系,RT-PCR,（+）,RT-PCR,（-）,P,N,7,69,3yr Relapse,57%,27%,0.006,21,UK MRC TrialBurnett AK，et a,Italian GIMEMA-AIEOP TrialAIDA protocol,Breccia M,et al.Haematologica2004;89:29,23例MRD持续阳性患者挽救性治疗的结果,病例数,治疗时相,治疗方法,结果(m),3,MRD,CT+ABMT,3 in CCR(64,96,98),4,MRD,allo-BMT,4 in CCR(64,92,98,118),9,血液学复发,CT,9 died of the disease,5,血液学复发,CT+allo-SCT,3 died; 2 in CCR(62,74),2,血液学复发,CT+ASCT,2 died of the disease,结论:MRD持续阳性者宜尽早移植,22,Italian GIMEMA-AIEOP TrialAI,维持治疗期间和以后的MRD监测,MDR监测适合于高危组患者，低危组患者似乎不需要监测,目前推荐：高危组患者巩固治疗后1年内每1-2个月检测1次，第2、3年每3个月1次,目前常用非定量RT-PCR，Q-RT-PCR的临床应用价值有待确定，但认为动态监测融合基因定量变化可为评估预后提供有益信息，便于调整治疗方案,巩固治疗后RT-PCR持续阴性与长期生存密切相关,一旦转为阳性提示即将血液学复发，需及时治疗,23,维持治疗期间和以后的MRD监测MDR监测适合于高危组患者，低,t(8;21)(q22;q22),AMLI-ET0,最为常见的AML染色体异常,见于12-15%AML患者,主要为M2b,少数见于M4和儿童ALL,并常见于年轻人,可伴有其他染色体异常,最常见为X或Y染色体缺失,携有该染色体的白血病细胞可分化至较成熟粒细胞,对化疗敏感性较好，是克隆性染色体异常中预后相对较好的一类，但仍有大于1/3患者最后复发,监测AML1-ETO是否阳性对提示长期预后意义有限，近年来QRT-PCR定量监测其动态变化已显示出价值,24,t(8;21)(q22;q22) AMLI-ET0,Prognostic relevance of fusion gene expression levels at diagnosis. Overall survival (OS) and event-free survival (EFS) for patients separated accordingto the 75%-percentile of the expression level of the respective fusion transcript,25,Prognostic relevance of fusion,inv(16)(p13q22)/t(16;16),CBFP-MYHII,见于约10%AML患者，主要为M,4EO,带有该染色体融合基因者化疗缓解率高，但中枢神经系统白血病的发生率也较高,定性测定其阳性对预后评估并无价值，甚至有矛盾结果，同AML1-ETO,定量PCR显示出对提示长期预后的作用,26,inv(16)(p13q22)/t(16;16) CBFP-,22号染色体,9号染色体,BCR,ABL,1,13或14,2,11,210 KD,蛋白,BCR-ABL,基因,BCR-ABL,mRNA,Q-PCR,分子生物学异常,27,22号染色体9号染色体BCRABL113或14211210,早期发现耐药病例,反映治疗疗效的标志性指标,定量,PCR （RQ-PCR）,主要的疾病监测手段,用于提示细胞遗传学检查和基因突变筛选,重要时间节点的检测结果为临床治疗方案的决策提供依据,慢粒白血病的分子生物学检测意义,28,早期发现耐药病例慢粒白血病的分子生物学检测意义28,BCR-ABL,转录本上升预示疾病复发,6,9,12,Pre,15,18,21,4.0,3.0,2.0,1.0,基线,BCR-ABL,转录本对数级下降,24,异体造血干细胞移植后时间（月）,MCR,CCR,MMR,BCR-ABL detected,BCR-ABL not detected,3,与丢失完全细胞遗传学治疗反应比较；分子生物学监测可更早提示疾病复发,供体淋巴细胞回输,丢失完全细胞遗传学治疗反应,Ph,染色体转阴,29,BCR-ABL转录本上升预示疾病复发6 9 12Pre151,标本质量和实验室之间的标准化,每个实验室独立检测并计算中位基线水平：同一批慢粒白血病治疗前标本共30例,所有计算结果均与标准化的基线比较，以对数级下降形式表示,30,标本质量和实验室之间的标准化每个实验室独立检测并计算中位基线,标准化的基线值,计算,30,例初诊慢粒白血病药物治疗前取得的标本,BCR-ABL/BCR,%,中位值：3个参考实验室结果,*,获得主要分子生物学治疗反应时,BCR-ABL,转录本绝对数量,实验室,标准化基线,Adelaide 80% 0.08%,London 45%0.045%,Seattle 15%0.015%,MMR,数值*,31,标准化的基线值计算30例初诊慢粒白血病药物治疗前取得的标本*,%,无疾病进展,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,随机分组后时间（月）,0,3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,Imatinib,一线治疗12个月分子生物学治疗反应与无进展生存,p0.001,获得完全细胞遗传学治疗反应,n=138,下降=3对数级,n=136,98%,90%,75%,32,% 无疾病进展0102030405060708090100随,QRT-PCR在AML中的应用,诊断时转录本定量分析,-确定融合基因亚型,-有报道认为初始转录本定量对判断预后无价值,-近期一组大型回顾性研究认为上述三种基因初始转录本数量与OS/EFS显著相关，但对CR率无影响，并对其进行危险程度分组。,33,QRT-PCR在AML中的应用诊断时转录本定量分析33,Combined prognostic impact of expression levels at diagnosis and MRD levels.the median expression ratio after consolidation,therapy and the 75th percentile of the expression ratio at diagnosis,a new score was established that separates a group with 100%,EFS from a significantly worse group (,P, .0001) in each,of the 3 acute myeloid leukemia subgroups,.,Schnittger S, et al. Blood 2003;102:274655,34,Combined prognostic impact of,治疗缓解后MRD定量分析,-转录本下降程度与长期预后紧密相关，并可在某时间点确定一阈值将患者分为高危或低危复发组，但各组研究所得数据不尽相同,-分子学复发总是先于血液学复发,-增加随访次数如每3月一次，监测MRD波动水平来预测复发或许较某一时间点MRD水平更有价值,-在血液学复发前及时治疗干预是否可获得更佳治疗效果,*,由于各组研究所选病例差异，AML亚型的不同，治疗方法不同，QRT-PCR试验材料不同等，其结果无可比性，还需更多的多中心前瞻性研究确定MRD定量监测与预后的关系，而PCR定量的标准化将是众多实验中心的努力目标,35,治疗缓解后MRD定量分析35,Krauter J et al.,J Clin Oncol 2003;21:441322,监测37例携带,t(8;21) or inv(16)AML患者诊断及缓解后MRD，PCR定量融合基因转录本数，认为诱导后MRD至少下降2对数级是持续CR的前提条件，复发患者中有7例诱导治疗后MRD有大幅度下降，但之后出现MRD水平升高。,结论：PCR定量可作为判断预后危险程度分组依据之一,缓解后任何时间点,MRD,转录本数与诊断时比值,病例数,n,复发数,n,P .001,/=1%,11,10,36,Krauter J et al. J Clin Oncol,Schnittger S, et al. Blood 2003;102:274655,Combined prognostic impact of expression levels at diagnosis and MRD levels.the median expression ratio after consolidation,therapy and the 75th percentile of the expression ratio at diagnosis,a new score was established that separates a group with 100%,EFS from a significantly worse group (,P, .0001) in each,of the 3 acute myeloid leukemia subgroups,.,37,Schnittger S, et al. Blood 200,Schnittger S Blood,2003;102:274655,监测142例PML-RAR/AML1-ETO/CBF-MYH11,认为诊断时高表达融合基因或经过巩固化疗后融合基因转录本下降小于3log的属于复发高危组，且MRD监测过程中出现转录本逐渐升高者预示即将复发。,随访期监测MRD,复发,持续缓解,持续升高,8,0,无明显升高趋势,7,127,P0.0001,38,Schnittger S Blood 2003;102:27,无特殊染色体或融合基因改变AML的MRD监测,一、,免疫表型-流式细胞术 FCM,白血病相关异常免疫表型,LAIP,leukemia associated aberrant immunophenotypes,白血病细胞始终存在异常畸变的表面抗原，多参数流式细胞术可将之与正常骨髓细胞区分开。诊断AML时将白血病细胞归为一组LAIP，并在之后各个时间点检测其在MRD表达率， 以确定MRD数量。LAIP大致可分为四类：,1） 非同步表达 例CD15+ CD33+ CD34+; CD65+ CD33+ CD34+,2） 过表达 CD34+ HLA-DR+ CD33+,3） 表达缺失 CD33+ CD34+ HLA-DR-,4） 混合淋系表达 CD33+ CD34+ CD2+,5） 分布异常 Abnormal light scatter pattern,*但是仍有25%患者在诊断时无法归入任何一组LAIP,改进抗体制备技术及流式细胞仪的多信号分辨技术或许可解决这一问题。另外，少数患者复发时免疫表型发生改变也会影响其监测，有报道认为不使用诊断时所得LAIP，而在每一次测定时与正常骨髓细胞表型向比较更为恰当。,39,无特殊染色体或融合基因改变AML的MRD监测 一、免疫表型-,CD34 PE,CD15 FITC,MRD (1),MRD (2),2m after auto-SCT,3m after auto-SCT,0.24%,0.11%,0.07%,0%,15+/34+/33+,40,CD34 PECD15 FITCMRD (1)MRD (2),CD34 PE,CD15 FITC,MRD (1),MRD (3),0.11%,3.2%,0.24%,7m after auto-SCT,15+/34+/33+,41,CD34 PECD15 FITCMRD (1)MRD (3),CD56 PE,CD34 FITC,MRD (1),MRD (3),3m after allo-SCT,4m after allo-SCT,0.3%,0.7%,0.6%,0%,34+/56+/DR-,42,CD56 PECD34 FITCMRD (1)MRD (3),AML免疫表型分析对预后的意义,FCM敏感度：0.1-0.01%,远高于细胞形态学的5%,不断改进FCM技术，更好地区分出白血病细胞群和正常骨髓细胞群，有希望应用于所有AML患者的MRD检测，如四色荧光FCM，CD45设门技术的改进等,某些时间点的MRD数量与EFS及OS相关,诱导巩固治疗后较诊断时MRD下降的数量级与长期预后相关，或许可作为评判预后的独立因素,FCM检测MRD定量分析可进行不同危险组分级,但现有的报道仍不能为AML的预后分析提供完全的依据，尚还需大量临床研究,43,AML免疫表型分析对预后的意义FCM敏感度：0.1-0.01,Relapse rates in the 4 AML risk categories according to number of LAP cells in the first BM in Mcr,High risk (MRD: greater than 10,-2,LAP,I,cells); intermediate risk (MRD: 10,-3,to 10,-2,LAP,I,cells) low risk (MRD: fewer than 10,-3,LAPI,cells); very low risk (fewer than 10,-4,LAP,I,cells; none have had relapses).,.,BLOOD, 15 SEPTEMBER 2001,z,VOLUME 98, NUMBER 6,44,Relapse rates in the 4 AML ris,Prognostic impact of log difference (LD) after consolidation therapy.,Patients with an LD higher than the 75th percentile (2.94) (ie, a stronger reduction in leukemic cell mass) have a significantly better RFS and OS.,Multivariate analysis identified LD as an independent prognostic factor for RFS at both checkpoints.,Wolfgang Kern et al BLOOD, 15 NOVEMBER 2004,VOLUME 104, NUMBER 10,45,Prognostic impact of log dif,二、其他靶分子检测,WT1,1992年,Miwa,等首先报道了70%80%的急性白血病患者中,WT1,在白血病细胞中高表达，,AML和CML-BP高于ALL，,在正常成熟细胞中无表达或表达很低，两者表达水平相差一个以上的对数级。可用于几乎所有的白血病患者，其定量检测可以评价化疗或骨髓移植的疗效和确定白血病细胞的残留量，对早期预测复发及判定预后有重要的临床意义.但其敏感度较特殊融合基因低2个对数级，建议应用于无特异性标志的MRD检测。,FLT3-LM,研究证实其在20-25%的,AML,中可检出，在正常核型或其他核型aml中发生率约40%,而其突变率在AML中可达30%，FLT3出现或突变与高复发率相关，许多报道建议可作为MRD检测靶分子。但仍需更多研究提供有力证据。,MLL-PTD,EVII基因的过表达也可作为检测MRD的靶分子，且均有报道支持其可行性，但仍需进一步研究。,46,二、其他靶分子检测WT1 1992年Miwa等首先报道了70,Perea G et al.Leukemia 2005 Nov 10; Epub ahead of print,结论：可尝试联合使用FCM和QRT-PCR作预后分析,MRD水平,累计复发率,P值,FCM,0.1%,67%,/=0.1%,21%,QRT-PCR,10,-3,75%,/= 10,-3,21%,47,Perea G et al.Leukemia 2005,ALL,儿童ALL前体B型可达98%CR，5年EFS将近80%，而今成人ALL CR率可达80%，但是5年EFS仅30-40%,新的分子学缓解概念逐渐深入人心,强调个体化治疗，根据不同危险因素对不同患者采取不同的治疗策略,对现行危险程度分级标准仍有40%预后良好组会复发，而高危组则有20%不会复发,48,ALL儿童ALL前体B型可达98%CR，5年EFS将近80%,MRD监测在ALL中的应用,MRD的研究或许可成为最有效可靠的预后评估指标,MRD持续存在说明内源性耐药细胞的存在,其测定可作为骨髓移植前净化的标准,可根据MRD的情况进行危险程度分级和指导治疗,现有的相关研究大部分为儿童ALL，成人只有少量报道,49,MRD监测在ALL中的应用MRD的研究或许可成为最有效可靠的,一、免疫表型-流式细胞术,诊断时确定白血病细胞的抗原组合，称之为有效抗体组合或ALL-相关免疫表型，将之与正常骨髓细胞区分，用于定期监测MRD,ALL相关免疫表型,B-lineage,CD19 ,CD34, Tdt ,CD10 ,CD22, CD45, CD38,T-lineage,TdT, CD2/cyt ,CD3, CD5 ,CD7, etc.,根据技术要求可同时选用三种或以上抗体，一般选用一种高度敏感,和一种高度特异性的表型组合，可覆盖约90%ALL患者，如CD19/CD38/CD34,Tdt/CD3/CD7,50,一、免疫表型-流式细胞术诊断时确定白血病细胞的抗原组合，,免疫表型-流式细胞术,对于儿童急淋，多个报道得出结论，20-40%患者在诱导治疗结束后或巩固治疗后MRD为阴性，其长期EFS可达90%,较为一致的意见是10,- 4,或以上MRD 水平与复发危险度成正相关，但对于时间点确定看法不一,St.Jude研究儿童高危组ALL，MRD水平有较大的异质性，认为诱导治疗后MRD大于10,-2,或巩固治疗后仍大于10,-3,者预后较差，复发率高，建议移植,MRD的持续存在依然预示复发可能,51,免疫表型-流式细胞术对于儿童急淋，多个报道得出结论，,Blood, 15 October 2000, Vol. 96, No. 8, pp. 2691-2696,Prognostic significance of sequential measurements of MRD by FCM in children with ALL,-mrd持续阳性者复发率高,52,Blood, 15 October 2000, Vol. 9,Blood, 15 March 2002, Vol. 99, No. 6, pp. 1952-1958,Probability of sustained remission according to combined FC MRD results, relative and absolute estimate, from week 12.,By relative assessment, MRD values of at least 0.1% leukemic cells among total BM NCs at least 0.01% were classified as,high MRD,By absolute estimation, at least 10leukemic cells/L BM 1blast/L high MRD. whose leukemic cells were cleared below the relevant thresholds by week 12(n=7 and 5,respectively) were subsumed in the MRD,low-load groups,. All these patients stayed relapse-free except for one patient of the relative-estimate series, who, in contrast, had been assigned to the MRD high-load group at week 12by absolute counting.,53,Blood, 15 March 2002, Vol. 99,Blood, 15 June 2003, Vol. 101, No. 12, pp. 4695-4700,FCM测定102个成人ALL（大于14岁）MRD于d14d35,d35MRD情况,d14 MRD小于0.03%或阴性者5年RFS可达90%,MRD定量,病例数n,中位RFS(m),低水平组,/=0.05%,44,16,P=0.001,54,Blood, 15 June 2003, Vol. 101,二、特殊分子遗传学改变,染色体异常及融合基因-FISH/PCR,B-lineage: T-lineage,BCR-ABL -t(9;22) RHOM2-TCRgamma- t(11;14),MLL-AF4 -t(4;11), HOX11-TCRalpha - t(10;14),TEL-AML1 -t(12;21), TAL1 deletion,E2A-PBX1 -t(1;19),MYC-IgH -t(8;14);,TCR或IgH基因重排-PCR,其重排均为克隆性，诊断时PCR分析Ig或TCR的基因构型，可追踪恶性克隆，以下为各基因重排发生频率,WT1基因-PCR 有报道认为不适合于ALL 的预后分析,IgH,TCR,TCR,TCR ,B-ALL,95%,54%,55%,33%,T-ALL,14%,68%,91%,89%,55,二、特殊分子遗传学改变染色体异常及融合基因-FISH/P,PCR for Ig H gene rearrangement,Ig H gene (variable, diversity, and joining segments),Unique clonal complementarity-determining region 3 (CDR3), detected by fingerprint, sensitivity 1/10,3,CDR3 further analyzed for DNA sequence and allele specific oligonucleotide with sensitivity 1/10,4,(Mortuza F et al, J Clin Oncol 2002),56,PCR for Ig H gene rearrangemen,MRD detected by Ig H showed significant correlation with disease free survival,Only 77% had suitable fingerprinting marker,Tedious with need for sequencing in significant number of patients,57,MRD detected by Ig H showed si,Toubai T et al.,Am J Hematol. 2005 Nov;80(3):181-7.,测定共14例成人ALL患者骨髓细胞IgH、TCR,、,TCR重排，中位随访417天，其中IgH 7例、TCR,3,例、,TCR1例，另3例为双克隆型,随访9例中MRD大于10-3有3例，1年EFS,DFS 0%,显著低于小于10-3（6例）者,58,Toubai T et al. Am J Hematol.,MRD-based risk-groups.,(A) Categorization schematic representation according to combined MRD results of day 11, day 24, and week 16.,(B) Probability of disease-free survival (DFS).,(C) Probability of overall survival (OS). LR indicates low-risk group; IR, intermediate-risk group; and HR, high-risk group.,196例成人ALL患者接受9个时间点的QR-PCR定量MRD监测，,Blood, 1 February 2006, Vol. 107, No. 3, pp. 1116-1123,59,59,Options for MRD in ALL,Methods,Suitable cases (%),Sensitivity,FISH,25-35,?,Ploidy determination,5-25,?,PCR on translocation breakpoints,10-30,10,-4,-10,-6,PCR on TCR genes,40-60,10,-3,-10,-6,PCR on IgH genes,70,10,-3,-10,-6,Colony assay,?,?,Immunophenotyping,35%,10,-4,60,Options for MRD in ALLMethodsS,特殊分子遗传学改变-PCR定性或定量分析,缓解早期一次MRD阳性不能预测疾病的复发，连续阳性或阴性才对预后有评估价值,在疾病复发前可观察到其克隆数量的持续升高,同样可根据MRD的定量分析确定危险程度分级，但仍只限于临床研究中使用,存在问题：,-测定MRD的最佳时间以及分级定量数值仍未确定,-由于白血病克隆的不稳定性常导致重排基因的丢失造成假阴性，对Ph+的ALL尤其注意MRD阴性不代表治愈,61,特殊分子遗传学改变-PCR定性或定量分析缓解早期一次MR,FMC与QRT-PCR,Leukemia. 2004 Oct;18(10):1630-6,测定共22例儿童ALL患者，结果流式细胞和RQ-PCR符合率为72%，不一致率达28%，可能由于FCM的敏感度较低以及免疫球蛋白的克隆演变造成,Br J Haematol 2005 Mar;128(6):774-82,同时运用流式细胞和定量PCR测定免疫表型和表面抗原基因突变，共47例儿童ALL患者，分别适用于91%和84%的患者,认为两者对MRD的测定结果是一致的，并且联合使用可以覆盖所有ALL患者，并且可以减少由于病程中免疫表型变化或克隆演变造成的假阴性结果,62,FMC与QRT-PCR62,一系列问题,监测MRD对临床治疗策略的指导具体化,检测技术的改进，标准化,拓宽MRD检测应用范围,如淋巴瘤,多发性骨髓瘤等,进一步深入MRD的实验室研究，如对MRD细胞定位，内环境对其生长的影响，增殖动力学，与正常造血间的关系等,63,一系列问题监测MRD对临床治疗策略的指导具体化63,