微小RNA及其在医学中的应用-课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,微小RNA及其在医学中的应用,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微小RNA及其在医学中的应用,微小RNA及其在医学中的应用,微小RNA及其在医学中的应用微小RNA及其在医学中的应用,1,一、微小RNA的发现,人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2。其它,98的基因组有什么功能,呢？约24为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？,微小RNA及其在医学中的应用,一、微小RNA的发现 人类基因组中，蛋白质编码区只占1-,2,后基因组时代的中心法则,RNA 加工,基因调节,DNA 修复和重组,基因组的保持,基因组的表达,微小RNA及其在医学中的应用,后基因组时代的中心法则RNA 加工 基因调节DNA 修复,3,后基因组时代的基因调控：,RNA 调控,微小RNA及其在医学中的应用,后基因组时代的基因调控：RNA 调控微小RNA及其在医学中的,4,人类基因组绝大部分被转录成,RNA,非编码,RNA,的数量是编码,RNA,的数百倍,生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码,RNA,内，而非编码序列内。,微小RNA及其在医学中的应用,人类基因组绝大部分被转录成RNA微小RNA及其在医学中的应用,5,2006年的诺贝尔生理学奖获得者：,Andrew Z. Fire,Craig C. Mello,微小RNA及其在医学中的应用,2006年的诺贝尔生理学奖获得者：Andrew Z. Fir,6,第一个被发现的miRNA (,lin-4,)由哈佛大学的Victor Ambros 发现的（1993）,第二个被发现的miRNA（l,et-7）,由哈佛大学的博士后Frank Slack,(Ruvkun 实验室）发现的（2000),Victor Ambros,Gary Ruvkun,微小RNA（,microRNA, miRNA,）的发现,微小RNA及其在医学中的应用,第一个被发现的miRNA (lin-4)由哈佛大学的Vict,7,第一个被发现的miRNA: lin-4,Ruvkun G, Wightman B, Ha I. The 20 years it took to recognize the importance of tiny RNAs. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S93-6.,Lee R, Feinbaum R, Ambros V. A short history of a short RNA. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S89-92,微小RNA及其在医学中的应用,第一个被发现的miRNA: lin-4Ruvkun G, W,8,微小RNA及其在医学中的应用,微小RNA及其在医学中的应用,9,近年来被鉴定的miRNAs越来越多,至今超过17000 miRNAs已被发现,可以免费获得,http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/,微小RNA及其在医学中的应用,近年来被鉴定的miRNAs越来越多 微小RN,10,二、微小RNA的特点,微小RNA及其在医学中的应用,二、微小RNA的特点微小RNA及其在医学中的应用,11,微小RNA的作用特点,主要是在蛋白质水平调控,端-个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的端非翻译区（,unstranslated region, UTR）,分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译,是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白,微小RNA及其在医学中的应用,微小RNA的作用特点主要是在蛋白质水平调控微小RNA及其在医,12,小干扰RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA的异同点,微小RNA及其在医学中的应用,小干扰RNA（small interfering RNA;,13,相同点,siRNA,miRNA,长度,22nt左右,合成的底物,由双链RNA或RNA前体形成的,Dicer酶,是Dicer的产物,Argonaute家族,需要Argonaute家族蛋白参与,蛋白RISC组分,都是RISC组分，其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠,作用方式,在转录水平后和翻译水平起作用,siRNA和miRNA的相同点,微小RNA及其在医学中的应用,相同点 siRNA miRNA长度22nt,14,不同点,siRNA,miRNA,机制性质,外源引起，如病毒感染诱导产生，异常情况,生物体自身的正常调控机制,直接来源,长链双链RNA,发夹miRNA前体,分子结构,双链RNA,单链RNA,对靶RNA特异性,较高,相对较低,互补性,一般要求完全互补,不完全互补，存在错配现象,生物学功能,抵抗病毒感染； 沉默过分表达的mRNA； 保护基因组免受转座子的破坏,对机体生长发育，神经分化，脂类代谢，细胞增殖分化，肿瘤发生有重要作用,微小RNA及其在医学中的应用,不同点siRNAmiRNA机制性质外源引起，如病毒感染诱导产,15,三、微小RNA的主要功能,miRNA,发育,增殖,(干细胞),疾病,分化,凋亡,微小RNA及其在医学中的应用,三、微小RNA的主要功能miRNA 发育疾病分化微小RNA及,16,Victor R. Ambros,秀丽线虫 C. elegans,1. 调控发育过程,微小RNA及其在医学中的应用,Victor R. Ambros秀丽线虫 C. elegan,17,miR-124a局限表达于神经组织,miR-1局限表达于骨骼肌和心肌,青鳉,斑马鱼,小鼠,果蝇,miRNA的表达具有组织特异性,微小RNA及其在医学中的应用,miR-124a局限表达于神经组织青鳉斑马鱼小鼠果蝇miRN,18,( Science 2004),3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程,2. 调控细胞分化,微小RNA及其在医学中的应用,( Science 2004)3种miRNA控制造血干细胞向,19,3. miRNAs与心血管疾病,（调控心肌前体细胞的增殖）,微小RNA及其在医学中的应用,3. miRNAs与心血管疾病（调控心肌前体细胞的增殖）微,20,microRNA,host or virus,禽流感病毒,Avian influenza virus,疱疹病毒家族,EBV,KSHV,MHV-68,HCMV,HSV-1,HBV,HCV,逆转录病毒家族,HIV-1,多瘤病毒家族,SV40(Simian virus 40),腺病毒家族,hAV(adenovir,),4、,miRNA 与病毒感染,微小RNA及其在医学中的应用,microRNA禽流感病毒疱疹病毒家族HBV,HCV逆转录,21,miRNA与肝炎病毒,HCV,HBV,miRNA,基因表达,信号传导,肝细胞肝癌发生、发展,诊断、治疗,微小RNA及其在医学中的应用,miRNA与肝炎病毒HCVHBVmiRNA基因表达信,22,在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNA,HCV,HBV,has-miR-191,Worse survival in acute myeloid leukemia,p53 tumor supressor pathway,has-miR-34,has-let-7a,ras and c-myc genes,has-miR-133b,Sequamous cell carcinoma,has-miR-142-5p,Hematopoietic specific,Normal,微小RNA及其在医学中的应用,在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNAHCVHBVhas-mi,23,5.微小RNA与肿瘤的关系,微小RNA及其在医学中的应用,5.微小RNA与肿瘤的关系微小RNA及其在医学中的应用,24,微小RNA调控癌基因表达,微小RNA及其在医学中的应用,微小RNA调控癌基因表达微小RNA及其在医学中的应用,25,下调miRNA表达，促进了E2F1的表达,Western,Blotting,NorternBlotting,微小RNA及其在医学中的应用,下调miRNA表达，促进了E2F1的表达Western Bl,26,有些微小RNA可能是致癌基因,mir-1792高表达,微小RNA及其在医学中的应用,有些微小RNA可能是致癌基因mir-1792高表达微小RN,27,增加mir-1719b的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤形成,微小RNA及其在医学中的应用,增加mir-1719b的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤,28,miRNAs与肿瘤的关系,微小RNA及其在医学中的应用,miRNAs与肿瘤的关系微小RNA及其在医学中的应用,29,miRNA与疾病关系的研究策略,哪些miRNA表达,miRNA文库筛选,分离,克隆,测序,miRNA表达谱分析,哪些基因是miRNA,的靶基因,哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动,miRNA在什么时候、,在哪里表达,功能分析,治疗,诊断,微小RNA及其在医学中的应用,miRNA与疾病关系的研究策略哪些miRNA表达miRNA文,30,(一)胃癌概述,胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。,中老年发病较多，男女比例约2比1,全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。,四、微小RNA与胃癌的关系,微小RNA及其在医学中的应用,(一)胃癌概述胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。四、微小RNA,31,(二)目前胃癌诊治的现状,早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期,。,进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约1年。胃癌5年总生存率一般在10%左右。,胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移,肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物,微小RNA及其在医学中的应用,(二)目前胃癌诊治的现状早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临,32,胃癌组织癌旁组织,总 RNA 提取,定量RT-PCR,miRNA芯片,细胞培养, MGC803, SGC-7901,组织类型 细胞分化 侵润深度 TNM分期 转移,生长曲线MTT 定量PCR检测 细胞周期凋亡检测 靶基因分析,(三)技术路线,临床研究,体外实验,功能分析,反义寡核苷酸阻断miRNA的表达,综合分析确定miRNAs可能的致癌机制,微小RNA及其在医学中的应用,胃癌组织癌旁组织总 RNA 提取定量RT-PCRmiR,33,(四)胃癌组织中微小RNA的表达谱,芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNA,Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol.,2009, 24(4): 652-657,19种差异表达的微小RNA,12, 7 ,miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现,miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达,微小RNA及其在医学中的应用,(四)胃癌组织中微小RNA的表达谱 芯片分析胃癌组织中异常表,34,高表达的微小RNA（miR-106a）,与胃癌分期的关系,(五)临床病理因素分析结果,Xiao B, Guo J, et al. Clin Chim Acta. 2009;400(1-2):97-102.,微小RNA及其在医学中的应用,高表达的微小RNA（miR-106a）与胃癌分期的关系(五),35,miR-106a异常表达的临床意义,因素 病例数 变化倍数,P,直径,5cm3068.59,258.49 0.001,5cm25 14.65,29.21,分化,中 237.36,15.48 0.001,低 2259.62,299.13,淋巴结转移,+46 50.69,209.88 0.001,- 910.24,20.52,远处转移,+ 9142.35,414.60 0.001,- 4624.84,107.37,侵润,T120.14,0.04,T2266.09,12.72 0.001,T31750.49,173.91 =0.005,T410140.69,390.79,微小RNA及其在医学中的应用,miR-106a异常表达的临床意义,36,实时定量PCR 结果,Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6,癌组织中mir-421的表达明显高于癌旁组织,微小RNA及其在医学中的应用,实时定量PCR 结果Jiang C, Guo J, et a,37,体外实验结果,合成特异性微小RNA引物、用未转染肿瘤细胞中的对照，比较转染后癌细胞中微小RNA表达的变化,蒋振，郭俊明，,等.,中国病理生理杂志,2009, 25(9): 1726-1730.,微小RNA及其在医学中的应用,体外实验结果合成特异性微小RNA引物、用未转染肿瘤细胞中的对,38,下调miR-421表达对胃癌细胞生长的影响,Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6,微小RNA及其在医学中的应用,下调miR-421表达对胃癌细胞生长的影响Jiang C,39,miR-421靶蛋白实验结果,筛选微小RNA匹配度最高的肿瘤相关靶基因、检测靶基因在蛋白质水平上的变化,Jiang C, Guo J，et al. Journal of Gastroenterology.,DOI 10.1007/S00535-009-0135-6,微小RNA及其在医学中的应用,miR-421靶蛋白实验结果筛选微小RNA匹配度最高的肿瘤相,40,胃癌相关微小,RNA,的功能研究,肿瘤抑制基因,Rb,和,PTEN,分别受到miR-106和miR-21的调控; E2F1受到miR-17-92基因簇调控,免疫组化,Rb,PTEN,E2F1,癌旁 癌,Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol.,2009, 24(4): 652-657,微小RNA及其在医学中的应用,胃癌相关微小RNA的功能研究 免疫组化,41,结 论,实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点,miR-421发生的初期阶段中可能起重要作用,它可能是一个新的胃癌诊断候选标志物,通过临床病例检测， miR-421在肿瘤病人中阳性率为73.33%，阳性率较高优于现在临床胃癌标志物CEA检出灵敏度（仅40%）,微小RNA及其在医学中的应用,结 论实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调mi,42,