高效液相基础知识HPLC培训课件

高效液相基高效液相基础知知识HPLCHPLC色谱法原理与分类HPLC的组成HPLC的应用HPLC色谱图名词术语HPLC定量分析原理高效液相色谱基础知识2高效液相基础知识HPLC什么是色谱法色谱法溯源Tswett（茨维特)的实验色谱法原理色谱法的分类色谱法原理及分类3高效液相基础知识HPLC色谱法是一种现代的分离分析方法1906年正式命名(见诸文献)20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代什么是色谱法4高效液相基础知识HPLC100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)色谱法(Chromatography)溯源5高效液相基础知识HPLC一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带分离出不同的化合物 Chromato-颜色 Graphy-图象Tswett（茨维特)的实验6高效液相基础知识HPLC是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase)有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂色谱法原理7高效液相基础知识HPLC相(Phase):物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面8高效液相基础知识HPLC色谱分离原理9高效液相基础知识HPLC按流动相的物态分:气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)色谱法的分类10高效液相基础知识HPLC按固定相的形态分:平面色谱 o 纸色谱 o 薄层色谱 柱色谱色谱法的分类11高效液相基础知识HPLC色谱法的分类示意图12高效液相基础知识HPLC高效液相色谱法HPLC(High Performance Liquid Chromatography)是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:o High 高 o Performance 性能 o Liquid 液体的 o Performance 色谱什么是HPLC？13高效液相基础知识HPLC特点：特点：高压、高效、高速、高灵敏度高压、高效、高速、高灵敏度1.高效分离高效分离 ：n=105/米米2.高速高速 ：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟3.高灵敏度高灵敏度 ：检测下限：检测下限：10-9-10-13g（最小检测量）（最小检测量）4.自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站5.应用范围广应用范围广 ：可测有机物：可测有机物75%-80%适用：适用：高沸点、热不稳定有机及生化高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离试样的高效分离HPLC特点14高效液相基础知识HPLC按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(Normal Phase Chromatography)o 固定相的极性大于流动相反相色谱(Reversed Phase Chromatography)o 固定相的极性小于流动相有机化合物的极性分子间作用力(静电引力,偶分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种表述液相色谱法的分类15高效液相基础知识HPLC有机化合物极性示例16高效液相基础知识HPLC按分离过程的机理分按分离过程的机理分:1 吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离2 分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同3 离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)4 体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)GPC(Gel Permeation Chromatography)固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液液相色谱法的分类17高效液相基础知识HPLC 由五大部分组成：由五大部分组成：溶剂输送系统（贮液器，高压泵）溶剂输送系统（贮液器，高压泵）进样系统（进样阀等）进样系统（进样阀等）分离系统（色谱柱等）分离系统（色谱柱等）检测系统（检测器等）检测系统（检测器等）记录及数据处理系统记录及数据处理系统HPLC的组成18高效液相基础知识HPLC19高效液相基础知识HPLC1.高压输液泵高压输液泵为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10m），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速速是高效液相色谱的特点之一是高效液相色谱的特点之一应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性20高效液相基础知识HPLC高压输液泵：高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）恒压泵（流量随阻力变化重现性差）恒流泵（多用）：往复式恒流泵（多用）：往复式 注射式注射式 作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。性能：性能：有足够的压力有足够的压力 输出流量恒定，可调输出流量恒定，可调 输出压力平稳输出压力平稳 泵室体积小泵室体积小 泵体抗腐蚀、耐酸泵体抗腐蚀、耐酸21高效液相基础知识HPLC梯度洗脱装置梯度洗脱装置作作用用：将将两两种种或或两两种种以以上上溶溶剂剂按按一一定定程程序序连连续续改改变变配配比比，以以改改变变流流动动相相极极性性、离离子子强强度度、PHPH值、提高分离效率。值、提高分离效率。低低压压梯梯度度洗洗脱脱（常常压压混混合合，高高压压进进柱柱，1 1个个泵。）泵。）高高压压梯梯度度洗洗脱脱（高高压压混混合合，高高压压进进柱柱，2 2个个泵。）泵。）22高效液相基础知识HPLC安捷伦泵：小视频色谱学堂：泵23高效液相基础知识HPLC高效液相色谱仪流动相脱气的目的高效液相色谱仪流动相脱气的目的1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。3、防止气泡引起尖峰。4、使基线稳定，提高信噪比。5、降低溶剂的紫外吸收本底。6、减少死体积。7、防止填料氧化。视频：脱气目的 在线脱气机在线脱气机24高效液相基础知识HPLC2.进样装置进样装置进样视频：安捷伦进样视频：岛津25高效液相基础知识HPLC3.分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色色谱谱柱柱一一般般用用内内部部抛抛光光的的不不锈锈钢钢制制成成。其其内内径径为为26mm，柱柱长长为为1050cm，柱柱形形多多为为直直形形，内内部部充充满满3 310 10 m mm高高效效微微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温粒固定相。柱温一般为室温或接近室温 匀浆法填充柱：匀浆法填充柱：将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱液的色谱柱。理论塔板数可达液的色谱柱。理论塔板数可达8 8万万/米米26高效液相基础知识HPLC27高效液相基础知识HPLC4.4.检测器检测器 要求要求:灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,对温度和流速的变化不敏感对温度和流速的变化不敏感检测器类型检测器类型1.紫外可见吸收检测器(UVD)2.荧光检测器(FD)3.蒸发光检测器（ELSD）3.示差折光检测器(RID)4.电化学检测器(ED)5.化学发光检测器(CD)28高效液相基础知识HPLC1.紫外紫外可见光度检测器：可见光度检测器：固固定定波波长长：254nm，低低压压汞汞灯。灯。可可调调波波长长：190800mm，钨灯，氘灯。钨灯，氘灯。光电二极管矩阵检测器：光电二极管矩阵检测器：190700nm。石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电倍增管光电倍增管废液废液29高效液相基础知识HPLC光电二极管矩阵检测器特点：光电二极管矩阵检测器特点：灵灵敏敏度度高高、分分辨辨率率好好、方方便便、快快速速、准准确确，可可扫扫描描得得三三维维流出曲线流出曲线紫外检测器的应用：紫外检测器的应用：对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。紫外检测器的特点：紫外检测器的特点：灵敏度高灵敏度高最小检测浓度最小检测浓度10-9g/ml线性范围宽线性范围宽对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱应用范围广应用范围广30高效液相基础知识HPLC折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）因因 nf（T），故需精密恒温，故需精密恒温（0.001）灵敏度低于灵敏度低于UVUV检测器，且不适合于梯度洗脱检测器，且不适合于梯度洗脱用于无紫外吸收的化合物，如糖类用于无紫外吸收的化合物，如糖类 31高效液相基础知识HPLC 2.荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）荧荧光光分分光光检测器（光栅分光）检测器（光栅分光）氘灯作激发光源，波长范围氘灯作激发光源，波长范围250600nm 应应用用：组组分分吸吸收收一一定定波波长长紫紫外外光光后后发发射射荧荧光光的的物物质质，且荧光强度与浓度成正比。且荧光强度与浓度成正比。特特点点：灵灵敏敏度度更更高高 检检测测限限10-1210-13g/ml（灵敏度比灵敏度比UV检测器高检测器高23个数量级）个数量级）选择性好选择性好 对对温温度度和和流流速速不不敏敏感感，可可进进行行梯梯度度洗洗脱脱 所需试样量少，适于痕量分析所需试样量少，适于痕量分析 应用范围广应用范围广 3、电化学检测器、电化学检测器 电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。32高效液相基础知识HPLC 伏安计、安培计、库仑计和电导计等伏安计、安培计、库仑计和电导计等,首选安培计首选安培计 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 电极表面易中毒电极表面易中毒 33高效液相基础知识HPLC温温 度：度：10103030；相对湿度：相对湿度：8080；最好是恒温、恒湿最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施HPLC的日常维护与保养的日常维护与保养HPLC的日常操作条件：的日常操作条件：34高效液相基础知识HPLC1 Alliance液相色谱系统日常维护：开机程序2 Alliance液相色谱系统日常维护：开机程序HPLC的日常操作的日常操作35高效液相基础知识HPLC选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。36高效液相基础知识HPLC手手柄柄位位在在LoadLoad位位置置时时，用用微微量量进进样样针针将将样样品品从从进进样样孔孔注注射射进进入入定定量量环环中中(定定量量环环充充满满后后，多多余余样品从放空孔排出样品从放空孔排出)手手柄柄转转动动至至InjectInject位位置置时时，阀阀与与液液相相流流路路接接通通，由由泵泵输输送送的的流流动动相相冲冲洗洗定定量量环环，将将样样品品进进入入色色谱柱中进行分析谱柱中进行分析 工作原理：工作原理：1.1.六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养37高效液相基础知识HPLC手柄转动要快速手柄转动要快速：手柄处于手柄处于Load和和Inject之间时，由于之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留途停留部分装液法部分装液法：进样量最多为定量环体积的：进样量最多为定量环体积的75 要求每次进样体积准确、相同要求每次进样体积准确、相同完全装液法完全装液法：进样量最少为定量环体积的：进样量最少为定量环体积的3至至5倍倍 将将定定量量环环内内残残留留的的溶溶液液完完全全置置换换样样品品，达达到到所所要要求求的的精精密度及重现性密度及重现性两种装液方法两种装液方法:38高效液相基础知识HPLC样品必须过滤样品必须过滤：用用0.45(0.22)m的滤膜过滤的滤膜过滤 防止微粒阻塞进样阀防止微粒阻塞进样阀 减少对进样阀的磨损减少对进样阀的磨损进样结束冲洗进样器进样结束冲洗进样器：用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的在进样阀的Load和和Inject位置反复冲洗位置反复冲洗 再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧39高效液相基础知识HPLC使用流动相尽量要清洁使用流动相尽量要清洁进液处的砂芯过滤头要经常清洗进液处的砂芯过滤头要经常清洗流动相交换时要防止沉淀流动相交换时要防止沉淀避免泵内堵塞或有气泡避免泵内堵塞或有气泡每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染污染2.泵的保养泵的保养40高效液相基础知识HPLC在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净要注意流动相的脱气要注意流动相的脱气避免使用高粘度的溶剂作为流动相避免使用高粘度的溶剂作为流动相进样样品要提纯；严格控制进样量进样样品要提纯；严格控制进样量2.色谱柱的保养色谱柱的保养每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭41高效液相基础知识HPLC在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器；在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器；在分析完成后马上关闭检测器在分析完成后马上关闭检测器3.3.紫外灯的保养紫外灯的保养42高效液相基础知识HPLC“分析型液相色谱”目的:得到数据-定性及定量分析 灵敏度的要求 样品的复杂性 样品量的要求 精度及准确度的要求 容易使用HPLC的应用43高效液相基础知识HPLC“制备型液相色谱”目的:得到纯品-分离及纯化 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性44高效液相基础知识HPLC色谱图(Chromatogram):色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间HPLC色谱图名词术语45高效液相基础知识HPLC色谱峰(Peak):):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号峰底(Peak Base):):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(Peak Height):):峰最大值到峰底的距离峰面积(Peak Area):):峰与峰底之间的面积,又称响应值色谱图名词术语:46高效液相基础知识HPLC基线基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号基线飘移基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化基线噪声基线噪声(N)N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动谱带扩展谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象色谱图名词术语:47高效液相基础知识HPLC保留时间保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰最大值所需的时间死时间死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间保留体积保留体积(VR)(Retention volume):组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积死体积死体积(V0)(Dead volume):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积色谱图名词术语:48高效液相基础知识HPLC等度在整个运行过程中溶剂组成保持不变如(60:40 甲醇/水)HPLC 实验的基本类型-等度49高效液相基础知识HPLC梯度在运行过程中溶剂组成变化渐变或台阶式变化如 100%H20/0%MeOH 到 0%H2O/100%MeOHHPLC 实验的基本类型-梯度50高效液相基础知识HPLC这些是导出理论和定义所必需的基本测量这些是导出理论和定义所必需的基本测量洗脱体积和峰宽51高效液相基础知识HPLC简单说来简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远远分离度(R)的定义式52高效液相基础知识HPLC计算分离度的实例计算分离度的实例:分离程度的量度53高效液相基础知识HPLCk 是样品与填料作用强度的直接量度是样品与填料作用强度的直接量度保留因子(k):保留能力的量度54高效液相基础知识HPLC是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述表述分离因子():峰分离程度的量度55高效液相基础知识HPLC理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度用于评价色谱柱的性能(中国2015版药典)理论塔板数(N):分离效率的量度56高效液相基础知识HPLC色谱峰对称性的测量方法57高效液相基础知识HPLC中国药典要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品溶液或系统适应性溶液对色谱系统进行试验和调整,要达到规定的要求色谱系统的适应性实验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子四个指标要求:理论塔板数N:大于规定值(按半峰宽法计算)分离度R:应大于1.5重复性:连续进样5次,峰面积的相对标准偏差不大于2.0%拖尾因子T:应在0.95-1.05之间中国药典对系统适用性的规定58高效液相基础知识HPLC在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量液相色谱法定量的依据是:被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比液相色谱定量分析原理59高效液相基础知识HPLC用“标样”的保留时间(Rt)确认被测组份鉴别需定量的色谱峰(定性)60高效液相基础知识HPLC定性鉴别每个要定量的色谱峰首先用标样确定欲定量之色谱峰的保留时间(Rt)通过比较保留时间,找到未知样中各色谱峰所对应的组份色谱定性是用与标样比较保留时间的方法因此要明确：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份鉴别需定量的色谱峰(定性)61高效液相基础知识HPLC标准加入法同时用其它方法 1其它色谱方法(改变机理,如:用不同的色谱柱)2其它检测器o PDA,光谱图比较、谱库检索o MS，质谱图解析、谱库检索 3其它仪器方法进一步的确认(定性)62高效液相基础知识HPLC确认定量峰的一致性63高效液相基础知识HPLCPDA 纯度角原理64高效液相基础知识HPLCPDA 纯度角测定结果65高效液相基础知识HPLC标准曲线法,分为外标法和内标法:-外标法:液相色谱中用得最多-内标法准确，但是麻烦在标准方法中用得最多常用的定量方法66高效液相基础知识HPLC液相色谱定量分析的步骤67高效液相基础知识HPLC外标法定量(1)68高效液相基础知识HPLC外标法定量(2)69高效液相基础知识HPLC外 标 法 按 各 品 种 项 下 的 规 定，精 密 称（量）取对照品和供试品，配 制 成 溶 液，分 别 精 密 取 一 定 量，进 样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高），按 下 式 计 算 含 量：外 标 法中国药典201571高效液相基础知识HPLC内标法定量(1)72高效液相基础知识HPLC内标法定量(2)73高效液相基础知识HPLC内标法定量(3)74高效液相基础知识HPLC内标法定量(4)75高效液相基础知识HPLC测 定 杂 质 含 量 时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在 建 立 方 法 时，按各品种项下的规定，精 密 称（量)取待测 物对照品和参比物质对照品各适量，配制待测物校 正因子的溶 液，进 样，记录色谱图，按下式计算 待测物的校正因子 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照76高效液相基础知识HPLC也 可 精 密 称（量）取 主 成 分 对 照 品 和 杂 质 对 照 品 各 适量，分 别 配 制 成 不 同 浓 度 的 溶 液，进 样，记 录 色 谱 图，绘制主 成 分浓 度 和 杂质 浓度 对其 峰面 积的 回归 曲线，以主成分回归 直 线斜 率与 杂质 回归 直线 斜率 的比 计算 校正 因 子。加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照77高效液相基础知识HPLC除 另 有 规 定 外，通 常 含 量 低 于 0.5%的 杂 质，峰 面 积 的相 对标 准偏 差（RSD)应 小 于 10%;含 量 在 0.5%2%的 杂 质，峰 面 积 的 RSD应 小 于 5%;含 量 大 于 2%的杂质，峰 面 积 的 RSD应 小 于 2%。加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照精密度78高效液相基础知识HPLC测 定 杂质 含量时，若 无 法 获 得 待 测 杂 质 的 校 正 因 子，或 校 正 因 子 可 以 忽略，也 可 采 用 不 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 法。不加校正因子的主成分自身对照法 79高效液相基础知识HPLC按 各 品 种 项 下 的 规 定，配制供试品溶 液，取 一 定 量 进 样，记 录 色 谱 图。测量各峰的面积和色谱图 上 除 溶 剂 峰以 外的 总色 谱峰 面 积，计算各峰面积占总峰面积 的 百 分 率。用 于 杂 质 检 查 时，由 于 仪 器 响 应 的 线 性 限 制，峰 面 积 归 一 化 法 一 般不 宜用 于 微 量杂 质 的 检 査。面 积 归 一 化80高效液相基础知识HPLC液相色谱定量的精密度81高效液相基础知识HPLC精密度的衡量82高效液相基础知识HPLC准确度的衡量83高效液相基础知识HPLC影响准确度的因素84高效液相基础知识HPLC校正曲线的检测范围85高效液相基础知识HPLC