荧光显微成像系统的原理及构成

荧光显微成像系统的原理及构成荧光显微成像系统的原理及构成原理原理 普通光学显微镜普通光学显微镜 通过普通光源的照明观察标本通过普通光源的照明观察标本荧光显微镜荧光显微镜 利用一定波长的光，激发显微镜下标本内利用一定波长的光，激发显微镜下标本内 的荧光物质，使之发射荧光的荧光物质，使之发射荧光什么是荧光？什么是荧光？物质吸收的短波光，发射出的长波光物质吸收的短波光，发射出的长波光特点：荧光波长特点：荧光波长激发光波长激发光波长 荧光强度荧光强度激发光强度激发光强度 有不同程度的衰减有不同程度的衰减荧光显微镜的特点荧光显微镜的特点光源能供给大量特定波长范围的激发光，光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度使受检标本内的荧光物质能获得必要强度 的激发光的激发光具备相应的滤光镜系统。具备相应的滤光镜系统。荧光显微镜的种类透射式透射式落射式落射式 目镜目镜目镜目镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜 物镜物镜物镜物镜暗场聚光镜暗场聚光镜暗场聚光镜暗场聚光镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜 汞灯汞灯汞灯汞灯透射荧光显微镜原理图透射荧光显微镜原理图标本标本标本标本汞汞汞汞 灯灯灯灯激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜物物物物 镜镜镜镜 标标标标 本本本本落射荧光显微镜原理图落射荧光显微镜原理图 透射式透射式汞灯光源汞灯光源激发滤色镜激发滤色镜暗场聚光镜暗场聚光镜吸收滤色镜吸收滤色镜 落射式落射式汞灯光源汞灯光源激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜荧光显微镜的主要部件各部件介绍各部件介绍光源光源 多采用多采用200W的超高压汞灯作光源的超高压汞灯作光源 提供激发光（紫外和蓝紫光）提供激发光（紫外和蓝紫光）滤色系统滤色系统 激发滤色镜：选择激发光的波长激发滤色镜：选择激发光的波长 吸收滤色镜：透过荧光，阻挡杂光吸收滤色镜：透过荧光，阻挡杂光 （完全阻挡激发光通过）（完全阻挡激发光通过）B B B B 透过透过透过透过B B B B 阻挡阻挡阻挡阻挡T%T%T%nmnm分色镜分色镜 反射激发光，透过荧光反射激发光，透过荧光暗场聚光镜暗场聚光镜 来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的因此视野是暗的 A A A A 透过透过透过透过A A 反射反射反射反射T%物镜物镜 各种物镜均可应用，但最好使用消色差的各种物镜均可应用，但最好使用消色差的物镜物镜 提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜物镜目镜目镜 在荧光显微镜中多用低倍目镜，如在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5和和6.3荧光图像的记录方法荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像具有：荧光显微镜所看到的荧光图像具有：形态学特征和荧光的颜色、亮度形态学特征和荧光的颜色、亮度判断结果时，必须将二者结合起来综合判断判断结果时，必须将二者结合起来综合判断 记录结果：主观指标（即工作者目力观察）记录结果：主观指标（即工作者目力观察）客观指标（细胞分光光度计、图像客观指标（细胞分光光度计、图像 分析仪等）分析仪等）荧光显微摄影技术荧光显微摄影技术 由于荧光很易减弱褪色，要及时摄影记录由于荧光很易减弱褪色，要及时摄影记录结果，所以荧光显微镜摄影技术对于记录荧光结果，所以荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要。图像十分必要。因紫外光对荧光猝灭作用大，所以曝光速因紫外光对荧光猝灭作用大，所以曝光速速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微镜摄影系统装置，或用动显微镜摄影系统装置，或用CCD与计算机连与计算机连接，将图像存在计算机硬盘上。接，将图像存在计算机硬盘上。CCD主要功能：主要功能：光信号转电信号光信号转电信号电信号转成数字信号电信号转成数字信号配合计算机形成影像配合计算机形成影像CCD概念概念CCDCharged Coupled Device:电荷耦合元件电荷耦合元件大量的独立的光敏元件排列在一起大量的独立的光敏元件排列在一起每个光敏元件称为像素每个光敏元件称为像素 像素像素图像的基本单位：最小的视觉显示单位图像的基本单位：最小的视觉显示单位.CCD结构及工作原理结构及工作原理CCD结构结构感光二极管（感光二极管（Photodiode）并行信号寄存器（并行信号寄存器（Shift Register）-用于暂时储存感光后产生的电荷用于暂时储存感光后产生的电荷串行信号寄存器（串行信号寄存器（Transfer Register）-用于暂时储存并行寄存器的模拟信号用于暂时储存并行寄存器的模拟信号并将电荷转移放大并将电荷转移放大信号放大器信号放大器-用于放大微弱电信号用于放大微弱电信号数摸转换器数摸转换器-将放大的电信号转换将放大的电信号转换 成数字信号成数字信号隔行传输式（Interline Transfer）-感光元件产生电信号-电荷转移到并行寄存器-电荷从并行寄存器转移到串行寄存器-串行寄存器将电信号转到模拟寄存器-放大、数摸转换、数字信息v快速-暴光和数据读出可同时进行v可采用软件控制的电子快门工作动态范围小CCD 种类种类-传输方式传输方式全帧（Full Frame）-感光元件产生电信号-电荷转移到串行寄存器-放大、数摸转换、数字信息v动态范围宽v信噪比高v分辨率高成像速度慢必须借助机械快门控制暴光量CCD 种类种类-传输方式传输方式全转（Full Fransfer）-综合Full Frame和Interline Transfer特点，在器件上划分感光区和寄存区-暴光和数据转移可以同时进行v保证单位像素上的感光面积v保证了拍摄速度CCD 种类种类-传输方式传输方式CCD种类种类-扫描方式扫描方式面阵或面扫描（面阵或面扫描（Area Arrays）：可以在一次曝光中以任意快门速度捕捉动可以在一次曝光中以任意快门速度捕捉动体，创建二维的影像体，创建二维的影像 主要应用在高阶数码相机、监视器和摄录主要应用在高阶数码相机、监视器和摄录像机等像机等CCD种类种类-扫描方式扫描方式线阵或线扫描（线阵或线扫描（Linear Arrays）：）：排成一排的像素构成，逐行扫描成像排成一排的像素构成，逐行扫描成像（获取彩色图像时，为了分别得到获取彩色图像时，为了分别得到RGB三基色三基色的信息，需要扫描三次，每次对应一种颜色的信息，需要扫描三次，每次对应一种颜色）适合获取静态图像，分辨率高适合获取静态图像，分辨率高CCD种类种类-扫描方式扫描方式三线三线（Tri-Linear Sensor）：）：排成三排的像素构成，每一排对应一种基排成三排的像素构成，每一排对应一种基色（色（RGB）不用扫描三次，且能得到很高的分辨率和不用扫描三次，且能得到很高的分辨率和色域色域CCD与显微镜的连接与显微镜的连接物镜激发滤色片生物标本分色镜吸收滤色片激发光源谢谢 谢谢