色谱联用技术LCMS课件

高效液相色谱质谱高效液相色谱质谱（HPLC-MS）联用技术）联用技术HPLC-MS简称简称LC-MS高效液相色谱质谱（HPLC-MS）联用技术HPLC-MS简1色谱联用技术LCMS课件2 HPLC-MS是是近近些些年年出出现现的的联联用用仪仪器器，发发展展非非常常迅迅速速，弥弥补补了了GC-MS只只能能测测定定挥挥发发性性或或半半挥挥发发性性物物质的不足，使色谱质谱联用技术得到了完善。质的不足，使色谱质谱联用技术得到了完善。GC-MS由由于于接接口口技技术术技技术术难难度度相相对对较较小小，因因此此，开开发发使使用用较较早早，而而HPLCMS接接口口技技术术技技术术难难度度较较大，开发使用较晚。大，开发使用较晚。HPLC-MS所所提提供供的的信信息息与与GC-MS相相同同（TIC、MC、SIM、全扫描三维图等）。、全扫描三维图等）。一一、概述概述 HPLC-MS是近些年出现的联用仪器，发展3 HPLC-MS的特点：的特点：MS作作为为LC的的检检测测器器不不仅仅能能得得到到色色谱谱数数据据，如如：峰峰保保留留时时间间、峰高、峰面积等，同时亦可得到质谱信息。具体如下：峰高、峰面积等，同时亦可得到质谱信息。具体如下：1、质质谱谱为为通通用用性性检检测测器器，可可测测定定不不带带生生色色团团或或荧荧光光基基团团的的化合物；化合物；2、质质谱谱也也是是选选择择性性检检测测器器，用用选选择择离离子子检检测测可可一一次次完完成成定定性、定量分析，且灵敏度性、定量分析，且灵敏度很很高。高。3、提提高高鉴鉴别别化化合合物物的的可可信信度度；可可准准确确分分析析色色谱谱峰峰的的纯纯度度；确定分子量。确定分子量。4、可可分分析析不不适适合合GC-MS分分析析的的亲亲水水性性强强、热热不不稳稳定定及及生生物蛋白化合物。物蛋白化合物。5、在在线线分分析析，免免去去了了色色谱谱组组分分的的收收集集，减减少少样样品品损损失失，缩缩短工作周期。短工作周期。6、适用范围宽，正相、反相、离子对及手性色谱均可使用。、适用范围宽，正相、反相、离子对及手性色谱均可使用。7、采采用用碰碰撞撞诱诱导导解解离离技技术术(CID)以以及及多多极极质质谱谱等等可可提提供供丰丰富的化合物结构信息。富的化合物结构信息。HPLC-MS的特点：MS作为LC的检测器4色谱联用技术LCMS课件5 由由于于HPLC目目前前的的应应用用极极其其广广泛泛，特特别别是是在在我我们们药药学学专专业业应应用用更更为为普普遍遍，所所以以LC-MS在在使使用用上上比比GC-MS有有更更高的使用价值。高的使用价值。由于HPLC目前的应用极其广泛，特别是在我们6 与与GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。基本相同，最大的不同是接口不同。另另外外，LC-MS一一般般用用来来分分析析挥挥发发性性差差，热热不不稳稳定的样品，应用范围增大。定的样品，应用范围增大。非极性化合物不能分析。非极性化合物不能分析。（难以离子化）（难以离子化）Vacuum SystemSample InletDetectorData SystemMass AnalyserIonisation MethodAtmosphere二二、LC-MS的工作原理的工作原理 与GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。71.接口的重要性接口的重要性 接口接口是是HPLC与质量分析器之间的过渡装置并承与质量分析器之间的过渡装置并承担着离子化的任务。担着离子化的任务。由于由于MS需在真空下操作，以便完成离子形成、分需在真空下操作，以便完成离子形成、分离、检测的过程。但是离、检测的过程。但是HPLC出口含有大量的流动相出口含有大量的流动相（溶剂）（溶剂）（0.22mL/min）。）。大量的流动相不得进入大量的流动相不得进入MS？HPLC的流动相处在高压下，液体气化成气体，的流动相处在高压下，液体气化成气体，其膨胀系数约为其膨胀系数约为1000倍以上。倍以上。1mL流动相液体可气化流动相液体可气化成成1000mL气体。气体。流动相的去除是接口的主要任务之一。流动相的去除是接口的主要任务之一。不如不如GC-MS接口成熟，历史较短。接口成熟，历史较短。三三、LC-MS的接口的接口1.接口的重要性 三、LC-MS的接口82.接口的种类（离子化方法）接口的种类（离子化方法）热喷雾热喷雾快原子轰击快原子轰击（FAB）电喷雾电喷雾(API-EI、ESI)大气压化学源大气压化学源(API-CI、APCI)大气压光电离源大气压光电离源(APPI)粒子束粒子束2.接口的种类（离子化方法）9 电喷雾电喷雾电喷雾接口（电喷雾接口（ESI）工作原理）工作原理:三三个个步步骤骤：a、带带电电液液滴滴的的形形成成；b、溶溶剂剂蒸发和液滴碎裂；蒸发和液滴碎裂；c、离子蒸发形成气态离子、离子蒸发形成气态离子 电喷雾电喷雾接口（ESI）工作原理:10a、带电液滴的形成、带电液滴的形成 色色谱谱流流出出物物经经毛毛细细管管顶顶端端喷喷出出，形形成成扇扇状状喷喷雾雾，再再38kV的的高高电电场场作作用用下下，形形成成高高度度电电离离、含含有有溶溶剂剂的的试样微小液滴。试样微小液滴。b、溶剂蒸发和液滴碎裂、溶剂蒸发和液滴碎裂 液液滴滴与与干干燥燥气气作作用用，在在干干燥燥气气的的作作用用下下，溶溶剂剂蒸蒸发发，离离子子向向液液滴滴表表面面移移动动，造造成成液液滴滴表表面面的的离离子子密密度度越越来来越越大大，当当达达到到Rayleigh限限时时，液液滴滴表表面面电电荷荷产产生生的的排排斥斥力力与与液液滴滴表表面面的的张张力力大大致致相相等等，液液滴滴非非均均匀匀破破裂裂，分分裂裂成成更更小小的的液液滴滴，更更小小的的液液滴滴继继续续重重复复蒸蒸发发、电电荷荷过过剩剩和和液液滴分裂的过程。滴分裂的过程。电喷雾接口（电喷雾接口（ESI）工作原理）工作原理:a、带电液滴的形成 色谱流出物经毛细管顶端喷出11c、离子蒸发形成气态离子、离子蒸发形成气态离子 当当液液滴滴分分裂裂至至小小于于10nm时时，其其表表面面形形成成的的电电场场足足够够强强，电电荷荷的的排排斥斥作作用用导导致致部部分分离离子子从从液液滴滴表表面面蒸蒸发发出出来来，最最终终以以单单电电荷荷或或多多电电荷荷离离子子形形式式从从液液滴滴中中转转移移至至气气相相，形成气相离子。形成气相离子。c、离子蒸发形成气态离子 当液滴分裂至小于1012+-+-+-N2气流干燥气流干燥Charged Droplets电喷雾接口（电喷雾接口（ESI）液滴变化示意图）液滴变化示意图:从毛细管喷出从毛细管喷出（在（在38kV电场作用下）电场作用下）气态气态试样离子试样离子+-气态气态试样离子试样离子试样试样+Rayleigh限限10nm+-+-13参见备注 以以上上过过程程是是在在大大气气压压条条件件下下进进行行的的，在在强强电电场场驱驱使使下下，电电离离的的溶溶质质离离子子通通过过一一个个金金属属毛毛细细管管进进入入真真空空区区，并并电场作用电场作用不断加速聚焦进入质量分析器。不断加速聚焦进入质量分析器。ESI的垂直模式：的垂直模式：参见备注 以上过程是在大气压条件下进行的，在强14电喷雾接口的特点电喷雾接口的特点:n 主主要要给给出出准准分分子子离离子子信信息息，（例例如如M+H、M+Na、MH、MNa等等），以以及及大大量量的的多多电荷离子，而较少给出化合物的碎片离子；电荷离子，而较少给出化合物的碎片离子；n 常常用用于于强强极极性性化化合合物物及及高高分分子子化化合合物物的的测测定定，一一般不适于非极性般不适于非极性或弱极性或弱极性化合物的分析；化合物的分析；n 由于温度较低，因此较适用于热不稳定化合物；由于温度较低，因此较适用于热不稳定化合物；n 只能允许非常小的液体流量（只能允许非常小的液体流量（0.21mL）。）。电喷雾接口的特点:15 大气压化学源大气压化学源(API-CI、APCI)大气压化学源大气压化学源 工作原理工作原理 与与ESI相相似似，所所不不同同的的是是通通过过电电晕晕放放电电针针首首先先使使溶溶剂剂离离子子化化，离离子子化化的的溶溶剂剂与与待待分分析析物物气气态态分分子子发发生生离离子子交交换换反反应应，形形成成准准分分子子离离子子，使使分分析析物离子化。物离子化。大气压化学源(API-CI、APCI)大气压化学源 1615015017Sol+H+M MH+Sol （质子转移）（质子转移）或或 Sol+HM MH SolSol+M M+Sol或或 Sol MH M SH （质子抽出）（质子抽出）Sol+H+M MH+Sol18 很很少少产产生生碎碎片片，离离子子流流集集中中在在几几种种离离子子形形式式（一一般为准分子离子），所以灵敏度高。般为准分子离子），所以灵敏度高。信息量少。信息量少。适适用用于于有有一一定定挥挥发发性性的的中中等等极极性性或或弱弱极极性性的的样样品品，分子量分子量2000以下。以下。允允许许使使用用流流速速高高及及含含水水量量高高的的流流动动相相；极极易易与与RPHPLC匹配。匹配。特点：特点：很少产生碎片，离子流集中在几种离子形式（一般为准分子离子19色谱联用技术LCMS课件20色谱联用技术LCMS课件211.接口的选择接口的选择四四、LC-MS分析条件的选择和优化分析条件的选择和优化 ESI和和APCI是两个最常用的接口，他们各自有优缺点是两个最常用的接口，他们各自有优缺点但相互补充。但相互补充。ESI的优势：适用于中等到强极性物质的测定；而弱极的优势：适用于中等到强极性物质的测定；而弱极性或非极性物质无法测定；性或非极性物质无法测定；APCI的优势：适用于弱极性物质的测定。也可分析非的优势：适用于弱极性物质的测定。也可分析非极性化合物，但灵敏度较低。极性化合物，但灵敏度较低。1.接口的选择四、LC-MS分析条件的选择和优化 ESI22色谱联用技术LCMS课件23（1）正离子正离子模模式式 由在溶液中能够形成的离子极性决定离子的极化方式。由在溶液中能够形成的离子极性决定离子的极化方式。如果在溶液中能够形成的离子为正离子，如碱性物质，如果在溶液中能够形成的离子为正离子，如碱性物质，则离子化则离子化模模式选择为正离子式选择为正离子模模式。得到的准分子离子一般式。得到的准分子离子一般为为M+H，其他也较常见的如，其他也较常见的如M+Na、M+NH4、M+Na+CH3OH、M+H+CH3OH 等。等。2.正负离子模式的选择正负离子模式的选择 正离子正离子模模式式一般用乙酸（一般用乙酸（pH34）或甲酸（）或甲酸（pH23）对样品进行酸化，若样品的对样品进行酸化，若样品的pK值已知，值已知，pH至少低于至少低于pK值值2个单位。个单位。（1）正离子模式 由在溶液中能够形成的离子24（2）负离子方式负离子方式 如果在溶液中能够形成的离子为负离子，如如果在溶液中能够形成的离子为负离子，如酸酸性物质，性物质，则离子化方式选择为负离子方式。得到的准分子离子一般为则离子化方式选择为负离子方式。得到的准分子离子一般为MH。负负离子离子模模式式可以用氨水或三乙胺对样品进行碱化，可以用氨水或三乙胺对样品进行碱化，pH至少高于样品至少高于样品pK值值2个单位。个单位。对于酸碱性不明确的物质，可以先使用对于酸碱性不明确的物质，可以先使用APCI（+）模）模式式进行预试。进行预试。（2）负离子方式 如果在溶液中能够形成的离子25（1）种类：甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合）种类：甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及易挥发盐的缓冲溶液物以及易挥发盐的缓冲溶液。3.流动相流动相的种类及流量的种类及流量的的选择选择 若流动相需用缓冲溶液，该缓冲液最好具有挥发若流动相需用缓冲溶液，该缓冲液最好具有挥发性，这样可减少缓冲盐在离子源内的沉积。性，这样可减少缓冲盐在离子源内的沉积。（1）种类：甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及易挥发盐26 应当根据样品所需的极性以及样品的应当根据样品所需的极性以及样品的pH值，调节值，调节流动相的流动相的pH。蛋白酵素蛋白酵素 应当根据样品所需的极性以及样品的pH值，调节27 流动相应当具有低的蒸发热和低的表面张力，以流动相应当具有低的蒸发热和低的表面张力，以增强离子的解吸作用增强离子的解吸作用，离子化效率提高，离子化效率提高。（2）流速：和色谱柱的内径有关，内径越小流量越）流速：和色谱柱的内径有关，内径越小流量越小。小。流动相应当具有低的蒸发热和低的表面张力，以增28MSD与与DAD的比较的比较椰子油椰子油（椰子油）（椰子油）（三甘油）（三甘油）五五、HPLC-MS的灵敏度的灵敏度MSD与DAD的比较椰子油（椰子油）（三甘油）五、HPLC29氨基甲酸盐氨基甲酸盐氨基甲酸盐30六六、LC-MS联用仪的真空联用仪的真空六、LC-MS联用仪的真空31 电喷雾是一种电喷雾是一种“软软”电离技术，通常只形成准电离技术，通常只形成准分子离子，提供分子量信息。但是在实际工作中，分子离子，提供分子量信息。但是在实际工作中，特别是对未知化合物的分析，不仅需要分子量，而特别是对未知化合物的分析，不仅需要分子量，而且更需要尽可能多的化合物碎片信息。且更需要尽可能多的化合物碎片信息。碰撞诱导解离（碰撞诱导解离（CID）可解决这一不足。）可解决这一不足。这里所讲的这里所讲的CID是指是指“源内源内CID，In-Source CID”。七七、碰撞诱导解离（碰撞诱导解离（CID）技术）技术 电喷雾是一种“软”电离技术，通常只形成准分子32参见备注惰性气体惰性气体参见备注惰性气体33没有商业谱库没有商业谱库34缩氨酸缩氨酸缩氨酸35（Tandem Mass Spectrometry）由两个以上的质量分析器串联而成。由两个以上的质量分析器串联而成。简称串联简称串联质谱。质谱。常见的为：三级四极杆质谱常见的为：三级四极杆质谱1.空间上的串联质谱（空间上的串联质谱（tandem-in-space）八八、多极质谱（串联质谱）多极质谱（串联质谱）（Tandem Mass Spectrometry）36API4000三重四级杆质谱仪示意图三重四级杆质谱仪示意图API4000三重四级杆质谱仪示意图37色谱联用技术LCMS课件38CIDl单四极杆与串连四极杆质谱对比CID单四极杆与串连四极杆质谱对比39色谱联用技术LCMS课件40色谱联用技术LCMS课件41串联质谱基本功能：串联质谱基本功能：（各种扫描方式）（各种扫描方式）（1）Q1全扫描全扫描（2）母离子（）母离子（precursor ion）扫描）扫描 初始离子扫描初始离子扫描（3）子离子（）子离子（Product Ion）扫描扫描（4）中性碎片丢失扫描）中性碎片丢失扫描（5）多重反应监测）多重反应监测 （Multiple Reaction Monitoring MRM）串联质谱基本功能：42各种扫描方式的原理解释：各种扫描方式的原理解释：Q1 Full Scan(Start Stop)(Q1全扫描全扫描)Q1 always used as single MS analyzerUsed primarily for ident.of precursor ion各种扫描方式的原理解释：Q1 Full Scan(Star43SIM-Selected Ion Monitoring(选择离子监测选择离子监测)Used to optimize analyzer for specific ionsSIM used for quantitative analysesQ1 SIM used to“optimize”precursor ionMaximize signal in preparation for MS/MSSIM-Selected Ion Monitoring44选择离子监测：选择离子监测：SIM用用于于检检测测已已知知或或目目标标化化合合物物，比比全全扫扫描描方方式式能能得得到到更更高高的的灵灵敏敏度度。这这种种数数据据采采集集的方式一般用于定量。的方式一般用于定量。若若几几种种目目标标化化合合物物用用同同样样的的数数据据采采集集方方式式监测，那么可以同时测定几种离子监测，那么可以同时测定几种离子.选择离子监测：45Precursor Ion Scan(母离子扫描母离子扫描)Q1 sweeps a given mass range,Q3 is fixedUsed to determine the“origin”of particular product ion(s)created in the collision cellFrequently used for drug metabolite identification(common product ion observed in the metabolites)m3+fixedm1+scannedPrecursor Ion Scan(母离子扫描)Q1 sw46Example of Precursor Ion Spectrum600900120015001800m/z,amu5 8 7.57 4 5.68 9 5.68 0 2.46 3 3.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z,amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity,cps6 0 8.3520.3802.4600900120015001800m/z,amu3.0e46.0e49.0e4Intensity,cpsPrecursors ion of 86 Q1 Scan745.6Example of Precursor Ion Spect47母离子扫描的作用母离子扫描的作用 母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。描功能在药物代谢研究中十分重要。母离子扫描的作用 母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的48Product Ion Scan(子离子扫描子离子扫描)-After identification,the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CID-Q1 is fixed,Q3 sweeps a given mass range-Used for structural elucidation（结构确认）（结构确认）-First step to developing quantitative methodm3+scannedm1+fixedProduct Ion Scan(子离子扫描)After i49Example of Product Ion SpectrumEphedrine（麻黄碱）（麻黄碱）,MW=165M+1Example of Product Ion Spectru50中性丢失扫描中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，也可以帮助进行未知类型已知的化合物，也可以帮助进行未知物结构判断。物结构判断。例如：例如：18-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。等等。中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和51Multiple Reaction Monitoring(MRM)多重反应监测多重反应监测Precursor ion fixedProduct ion fixedFragmentation(CID)Many precursor to product ion pairs can be monitored(A-B,A-B,etc.)MRM is the best way to maximize signal intensity of product ionsMRM used primarily for quantitationMultiple Reaction Monitoring(52MRM for Quantitation?Retention TimeIntensityRetention Time IntensityPrecursor ion fixedProduct ion fixedFragmentation(CAD)Increased Sensitivity&SpecificityMRM for Quantitation?Retentio53串联质谱可将复杂质谱简化。串联质谱可将复杂质谱简化。灵敏度、针对性、选择性更强灵敏度、针对性、选择性更强串联质谱可将复杂质谱简化。灵敏度、针对性、选择性更强54 三级四极杆质谱外观图三级四极杆质谱外观图 三级四极杆质谱外观图552.时间上的串联质谱（时间上的串联质谱（tandem-in-time）只有一个质量分析器，离子阱或傅立叶变换离子只有一个质量分析器，离子阱或傅立叶变换离子回旋共振（回旋共振（FT ICR）质谱可实现这种串联技术。）质谱可实现这种串联技术。2.时间上的串联质谱（tandem-in-time）56离子阱工作原理离子阱工作原理离子阱技术离子阱技术离子阱工作原理离子阱技术57色谱联用技术LCMS课件58