膜片钳技术与离子通道药理学-课件

（Patch clamp techniques&Ion channel pharmacology）膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学1膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件 2膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件 1991 Nobel基金会的颁奖评语：基金会的颁奖评语：膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。3膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件1、细胞电生理学、细胞电生理学3、离子通道药理学、离子通道药理学 2、膜片钳技术及其应用、膜片钳技术及其应用OUTLINE 4膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件 细细 胞胞 电电 生生 理理 学学 Electrophysiology细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动生理方法记录生物电活动测量测量离子、离子通道离子、离子通道细胞兴奋细胞兴奋生物电信号生物电信号细胞电生理学细胞电生理学5膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜的膜的“流动镶嵌模型流动镶嵌模型”细胞膜和离子学说建立（细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al.1946年年）1、生物膜分子结构？2、物质转运功能？脂质双分子层、蛋白质、糖类单存扩散、易化扩散、主动转运、出入胞6膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件7膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件离子通道离子通道 (ion channels)离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（些离子（些离子（些离子（K K K K+、NaNaNaNa+、CaCaCaCa2+2+2+2+等）能选择通透，其功能是细等）能选择通透，其功能是细等）能选择通透，其功能是细等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。胞生物电活动的基础。胞生物电活动的基础。胞生物电活动的基础。8膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件一、离子选择性一、离子选择性一、离子选择性一、离子选择性(selectivityselectivity)（大小和（大小和（大小和（大小和电荷）：电荷）：电荷）：电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道某一种离子只能通过与其相应的通道某一种离子只能通过与其相应的通道某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散跨膜扩散跨膜扩散跨膜扩散(安静：安静：安静：安静：KNa 100KNa 100KNa 100KNa 100倍、兴奋：倍、兴奋：倍、兴奋：倍、兴奋：NaK 10-20NaK 10-20NaK 10-20NaK 10-20倍）；各离子通道在不同状倍）；各离子通道在不同状倍）；各离子通道在不同状倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。态下，对相应离子的通透性不同。态下，对相应离子的通透性不同。态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性二、门控特性二、门控特性二、门控特性(Gating)(Gating)(Gating)(Gating)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，失活状态不仅是通道处于关闭状态，失活状态不仅是通道处于关闭状态，失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从而且只有在经过一个额外刺激使通道从而且只有在经过一个额外刺激使通道从而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通失活关闭状态进入静息关闭状态后，通失活关闭状态进入静息关闭状态后，通失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。道才能再度接受外界刺激而激活开放。道才能再度接受外界刺激而激活开放。道才能再度接受外界刺激而激活开放。开放开放 状态状态open state 失活失活 状态状态Inactive state 静息静息 状态状态 restingstate 激活激活activation 失活失活 inactivation复活复活 recovery离子通道的特性(Characteristic of Ion Channels)9膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件10膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n n配体门控通道配体门控通道配体门控通道配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和阴离子通道：甘氨酸和阴离子通道：甘氨酸和阴离子通道：甘氨酸和 氨基丁酸受体氨基丁酸受体氨基丁酸受体氨基丁酸受体 通道蛋白通道蛋白离子通道离子通道乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体 11膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n n电压门控通道电压门控通道电压门控通道电压门控通道：钾、钠、钙离子通道钾、钠、钙离子通道钾、钠、钙离子通道钾、钠、钙离子通道 通道蛋白通道蛋白离子通道离子通道电压门控钾离子通道电压门控钾离子通道 12膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件研究技术研究技术Patch-clampPatch-clamp技术技术新药开发新药开发NaNa+,Ca,Ca2+2+,K,K+,Cl,Cl-等电流等电流分子生物学技术分子生物学技术单细胞电流记录单细胞电流记录离子通道的结构与功能离子通道的结构与功能药物作用机制药物作用机制基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达通道蛋白功能测定通道蛋白功能测定13膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件1、细胞电生理学、细胞电生理学3、离子通道药理学、离子通道药理学2、膜片钳技术及其应用、膜片钳技术及其应用 OUTLINE14膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Patch-clamp(膜片钳)技术探头探头计算机计算机模数转换模数转换膜片钳放大器膜片钳放大器样品池样品池单细胞单细胞15膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件K+Ca2+Na+-电极电极电极电极-16膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件基基本本原原理理n n利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。17膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜片钳实验室基本设备膜片钳实验室基本设备n n膜片钳放大器膜片钳放大器n n信号转换器信号转换器n n倒置显微镜倒置显微镜n n微操纵器微操纵器n n防震工作台及静电屏蔽笼防震工作台及静电屏蔽笼n n微电极拉制仪及抛光仪微电极拉制仪及抛光仪n n计算机计算机n n专用软件专用软件n n细胞记录槽细胞记录槽n n恒速灌流泵恒速灌流泵18膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Electrophysiology-ApparatusFaraday cageVibration Isolation TableMicroscopeMicro-Manipulators Remote ControllerAmplifiersCCD Camera19膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Electrophysiology-ApparatusMicro-ManipulatorsDAD-VC systemCCD Camera20膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Electrophysiology-Apparatus21膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Electrophysiology-Apparatus22膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Patch clamp23膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜片钳记录的基本步骤膜片钳记录的基本步骤 可概括为可概括为4 4大部分：大部分：1.1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持应的液体，基本原则是保持2 2个平衡：渗透压平个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。衡和酸碱平衡。2.2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有：标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有：急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。当急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。当根据不同的研究要求而相应选择。根据不同的研究要求而相应选择。3.3.膜片钳记录膜片钳记录4.4.资料分析用相应的计算机软件进行资料分析用相应的计算机软件进行 24膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜片钳记录 n电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在0.5-2.0m之间，是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。n亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压，在倒置显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆封接就必须做到：1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅；4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之；5)细胞膜清洁，活性好。25膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件资料分析n一一般般电电学学性性质质：通通过过I/V关关系系计计算算单单通通道道电电导导，观观察察通通道道有有无无整整流流。通通过过离离子子选选择择性性、翻翻转转电电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。位或其它通道激活条件初步确定通道类型。n通通道道动动力力学学分分析析：开开放放时时间间、开开放放概概率率、关关闭闭时时间间、通通道道的的时时间间依依赖赖性性失失活活、开开放放与与关关闭闭类类型型(簇簇状状猝猝发发，Burst)样样开开放放与与闪闪动动样样短短暂暂关关闭闭(flickering)，化化学学门门控控性性通通道道的的开开、关关速速率率常常数等。数等。n药药理理学学研研究究：研研究究的的药药物物，阻阻断断剂剂、激激动动剂剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。或其它调制因素对通道活动的影响情况。n综合分析得出最后结沦综合分析得出最后结沦 26膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜片钳技术的优点n n 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。对单个离子通道进行研究成为可能。27膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜片钳记录的各种模式n n根根根根据据据据膜膜膜膜片片片片与与与与电电电电极极极极之之之之间间间间的的的的关关关关系系系系，可可可可将将将将膜膜膜膜片片片片记记记记录录录录主主主主要分为种模式要分为种模式要分为种模式要分为种模式 。n n首首首首先先先先建建建建立立立立的的的的单单单单通通通通道道道道记记记记录录录录法法法法（Single Single Single Single channel channel channel channel recordingrecordingrecordingrecording）是是是是细细细细胞胞胞胞吸吸吸吸附附附附式式式式，其其其其后后后后又又又又建建建建立立立立了了了了膜膜膜膜内内内内面面面面向向向向外外外外和和和和膜膜膜膜外外外外面面面面向向向向外外外外的的的的模模模模式式式式；还还还还有有有有一一一一种种种种是是是是全全全全细细细细胞胞胞胞记记记记录录录录法法法法（hole hole hole hole cell cell cell cell recordingrecordingrecordingrecording）的的的的全全全全细细细细胞胞胞胞式式式式。现现现现在在在在又又又又发发发发展展展展了了了了开开开开放放放放的的的的细细细细胞胞胞胞吸吸吸吸附附附附式式式式膜膜膜膜内内内内面面面面向向向向外外外外和和和和穿穿穿穿孔孔孔孔囊囊囊囊泡泡泡泡膜膜膜膜外外外外面面面面向向向向外外外外的的的的模模模模式式式式 ，以以以以及及及及穿孔膜片的模式。穿孔膜片的模式。穿孔膜片的模式。穿孔膜片的模式。28膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件29膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件Patch clamp-whole cell30膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件31膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件细胞吸附膜片细胞吸附膜片(cell-attached patch mode)n n一一种种将将微微电电极极吸吸附附在在细细胞胞膜膜上上对对单单离离子子通通道道电电流进行记录的模式。流进行记录的模式。n n优优优优点点点点是是不不破破坏坏细细胞胞的的完完整整性性,内内环环境境保保持持正正常常。缺缺点点是是不不能能人人为为直直接接地地控控制制细细胞胞内内环环境境条条件件，不不能能确确切切判判明明细细胞胞内内电电位位。即即使使在在浴浴液液中中加加入入刺刺激激物物质质，也也不不能能到到达达与与电电极极内内液液接接触触的的膜膜片片的细胞外面。的细胞外面。32膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件内面向外膜片内面向外膜片(inside-out patch)n n在在细细胞胞吸吸附附模模式式高高阻阻封封接接形形成成后后,将将微微管管电电极极提提起起,使使吸吸附附的的膜膜片片从从胞胞体体上上被被切切割割下下来来，就就得得到到“内内面面向向外外”膜膜片片。此此种种模模式式，可可直直接接且且自自由由地地经经浴浴液液介介导导而而调调控控细细胞胞内内液液的的条条件件，并并可可在在和和细细胞胞活活动动无无关关的的形形式式下下观观察察到到单单一一离离子子通通道道的活动。的活动。n n由由于于胞胞质质渗渗漏漏，可可能能丢丢失失某某种种通通道道调调控控因因子子，离子通道活动出现离子通道活动出现run-down run-down（或（或run-uprun-up）现象。）现象。33膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件外面向外膜片外面向外膜片(outside-out patch)n n在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。34膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件全细胞记录式全细胞记录式(hole-cell recording)n n在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘。n n这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。35膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件开放细胞吸附膜内面向外模式开放细胞吸附膜内面向外模式（open cell-attached inside-out mode）n n将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。n n这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。36膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件穿孔膜片模式穿孔膜片模式（perforated patch mode）n n为为克克服服全全细细胞胞模模式式的的胞胞质质渗渗漏漏问问题题，HornHorn和和MartyMarty将将与与离离子子亲亲和和的的制制霉霉菌菌素素（或或二二性性霉霉素素）经经膜膜片片微微电电极极灌灌流流到到含含类类甾甾醇醇的的细细胞胞膜膜片片上上，形形成成只只允允许许一一价价离离子子通通过过的的孔孔，用用此此法法在在膜膜片片上上做做很很多多导导电电性性孔孔道道借借此此对对全全细细胞胞膜膜电电流流进进行行记记录录。因因为为此此模模式式的的胞胞质质渗渗漏漏极极为为缓缓慢慢，局局部部串串联联阻阻抗抗较较全全细细胞胞模模式式高高，所所以以钳钳制制速速度度很慢，故也称为缓慢全细胞模式很慢，故也称为缓慢全细胞模式。37膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件穿孔囊泡膜外面向外模式穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode)n n穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜片断端融合封处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜片断端融合封闭而成）。如果条件较好，此膜囊泡内不仅有细闭而成）。如果条件较好，此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有比较接近正常的细胞内信号传递条件和代谢条件比较接近正常的细胞内信号传递条件和代谢条件的基础上，可能记录到膜外面向外模式的单一离的基础上，可能记录到膜外面向外模式的单一离子通道。子通道。38膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件膜片钳技术的应用n n分辨单通道电流,直接观察通道的开闭过程;n n区分离子通道的离子选择性及其门控特性(如区分电压、化学或门控性通道),发现新的离子通道及亚型;n n在记录单个通道电流()和全细胞电流()的基础上,可分别计算出细胞膜上的通道数()和开方概率(),依公式=;39膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n n用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片);n n研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶等活性变化,以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片);n n研究受体的激活态、失活态和静息态的功能；40膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n n研究不同离子强度对通道特性的影响及细胞内信使物质如1,4,5-三磷酸肌醇、环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、Ca2+等对离子通道型受体的调节机制(内面向外膜片)。n n研究药物对电压和化学内控性通道的影响。41膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n nNeher等首创将膜片钳技术与Fura 2 荧光测钙技术结合,同时进行如细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标变化的快速交替测定,这样便可得出同一事件过程中,多种因素各自的变化情况,进而可分析这些变化间的相互关系。n nNeher将可光解出钙离子的钙螯合物引入膜片钳技术,进而可以定量研究钙离子浓度与分泌率的关系及最大分泌率等指标。膜片钳技术与其它技术相结合膜片钳技术与其它技术相结合42膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n nEberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用,可对形态相似而电活动不同的结果作出分子水平的解释，从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代：基因重组技术,膜通道蛋白重建技术。43膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件 膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革命性意义，而且开辟了一条探索药物作用机制和发展新的更为有效药物的途径。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。膜片钳在药理学研究中的应用膜片钳在药理学研究中的应用 44膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件 膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。45膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n膜片钳技术对离子通道的动力学研究以及药物与通道相互作用机制的研究。n药物对通道电压依赖的激活和灭活过程的影响 n药物对离子通道状态依赖性的作用（如大多数类抗心律失常药与失活状态的Na+通道结合而发挥作用）。n药物的频率依赖性（frequency-dependent）或使用依赖性（use-dependent）（如维拉帕米）以及药物对离子通道亚型的选择性作用等。药物作用机制研究药物作用机制研究 46膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n膜片钳技术还在作用于通道活性受体和第二信使调节的药物的机制研究中发挥了重要作用。如证明了肾上腺素能介质及药物激活受体后，通过第二信使cAMP激活蛋白激酶A，使钙通道磷酸化，由关闭状态转为开放。47膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件 新药开发 n在现代药物研究中，新靶点的建立往往是新药创制的前提。随着膜片钳技术运用对许多新受体亚型的发现和特性研究，新型受体阻断剂将在选择性、高效性上发挥更大的作用。48膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n近十年来药物学研究最重要的成就之一就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和维拉帕米及其衍生物)。n研制出钾通道开放剂（nicorandil、pinacidil等）n类抗心律失常新药是近年来心血管药理的重要研究方向。49膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件n离子通道病及与离子通道调节缺陷有关 疾病的研究。n将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道的功能而达到治疗的目的。50膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件2、膜片钳技术及其应用、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学、离子通道药理学1、细胞电生理学、细胞电生理学OUTLINE5151膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT PPT课件课件离子通道药理学52膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件离子通道的功能(Function of Ion Channels)(Function of Ion Channels)1.1.产生细胞生物电现象产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。与细胞兴奋性相关。2.2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、学习和记忆学习和记忆3.3.维持细胞正常形态和功能完整性维持细胞正常形态和功能完整性 膜离子通道的膜离子通道的基因变异基因变异及及功能障碍功能障碍与许多与许多疾病有关，某些疾病有关，某些先天性先天性与与后天获得性后天获得性疾病是离疾病是离子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子离子通道病通道病(ionchannelpathies)。53膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件Classification of ion channels（一）、非门控离子通道（一）、非门控离子通道 （背景或漏通道）：（背景或漏通道）：始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号的明显影响，如产生静息电位的的明显影响，如产生静息电位的K K+通道。通道。（二）、门控离子通道：（二）、门控离子通道：电压门控（电压门控（Voltage gated channels)Voltage gated channels)离子通道：受膜电位离子通道：受膜电位的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的K K+通道通道、NaNa+通道通道、CaCa2+2+通道。通道。配体门控配体门控（Ligand gated channels)Ligand gated channels)离子通道：由递质与通离子通道：由递质与通道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。机械门控机械门控离子通道离子通道(Mechanically gated ion channels)(Mechanically gated ion channels)：由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。54膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件（一）电压门控离子通道的分类（一）电压门控离子通道的分类55膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件1.1.电压门控钠通道电压门控钠通道 选择性允许选择性允许Na+跨膜通过。维持细胞膜兴奋性及跨膜通过。维持细胞膜兴奋性及其传导（其传导（APAP的的0 0相相）。存在于心房、心室肌细胞）。存在于心房、心室肌细胞和希普系统。和希普系统。特征特征电压依赖性：电压依赖性：去极化去极化激活，产生内向钠电流（激活，产生内向钠电流（INa）快速快速激活（激活（1ms）和）和快速快速失活（失活（10ms）有有特异性特异性激活剂（激活剂（BTX、GTX）和阻滞剂（）和阻滞剂（TTX、STX、CTX）56膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件电压门控钠通道分类神经类钠通道神经类钠通道（对（对TTX敏感性敏感性高高、对、对CTX敏感性敏感性低低）骨骼肌类钠通道骨骼肌类钠通道（对（对TTX和和CTX敏感性敏感性均高均高）心肌类钠通道心肌类钠通道（对（对TTX和和CTX敏感性敏感性均低均低），又分为，又分为持久（慢）钠通道和瞬时（快）钠通道。持久（慢）钠通道和瞬时（快）钠通道。57膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件2.2.电压门控钙通道电压门控钙通道 钙通道钙通道存在于机体各种组织细胞，在正常情况存在于机体各种组织细胞，在正常情况下为细胞外下为细胞外Ca2+内流的离子通道（内流的离子通道（APAP平台期平台期），是调），是调节细胞内节细胞内Ca2+浓度（浓度（Ca2+i）的主要途径。）的主要途径。特征特征:电压依赖性：电压依赖性：去极化去极化激活激活缓慢缓慢激活（激活（20-30ms）和）和缓慢缓慢失活（失活（100-300ms）：在心肌）：在心肌细胞上，当钙通道尚未激活时，钠通道已经失活。细胞上，当钙通道尚未激活时，钠通道已经失活。对离子的选择性较低：对离子的选择性较低：在细胞外在细胞外Ca2+浓度（浓度（Ca2+o）下降）下降时，也允许时，也允许Na+通过。通过。58膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件电压门控钙通道电压门控钙通道 目前已克隆出目前已克隆出L、T、N、P、Q和和R6 6种亚型的电压种亚型的电压依赖性钙通道，依赖性钙通道，心血管系统心血管系统主要有主要有L-型和型和T-型。型。59膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件3.3.电压门控钾通道电压门控钾通道 选择性允许选择性允许K K+跨膜通过的离子通道跨膜通过的离子通道(参于参于RPRP、心率、心率、APDAPD调节调节）。是目前发现的亚型最多、作用最复杂的）。是目前发现的亚型最多、作用最复杂的一类离子通道。一类离子通道。1.1.瞬时外向钾通道电流（瞬时外向钾通道电流（I Itoto）：）：I Ito1to1（不依赖于细胞内钙浓度，对（不依赖于细胞内钙浓度，对4-AP敏感）敏感）是是复极复极1期期的主要参与电流。的主要参与电流。I Ito2to2（依赖于细胞内钙浓度，对（依赖于细胞内钙浓度，对4-AP不敏感）不敏感）可能是减少钙超载的一种负反馈机制（缩短动作可能是减少钙超载的一种负反馈机制（缩短动作电位时程）。电位时程）。60膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件2.2.延迟整流钾通道电流（延迟整流钾通道电流（I IK K）：）：缓慢成分缓慢成分（I IKsKs）和快速成分和快速成分（I IKrKr）是）是APAP2、3相相的主要复极电流。的主要复极电流。类抗心律失常药物类抗心律失常药物选择性阻滞选择性阻滞IKr，使动作电位时程延长。，使动作电位时程延长。超快速成分（超快速成分（I IKurKur）对心房肌复极重要，与房性心律失常有关。）对心房肌复极重要，与房性心律失常有关。3.3.内向整流钾通道电流（内向整流钾通道电流（I IK1K1）：）：I IK1K1主要参与主要参与AP3AP3相相复极晚期复极晚期及及4 4相相RPRP的维持。的维持。4.4.起搏电流（起搏电流（I If f）：）：If由由K+和和Na+共同携带的离子电流。肾上共同携带的离子电流。肾上腺素使腺素使If电流增加，交感神经刺激电流增加，交感神经刺激加快心率加快心率,乙酰胆碱可抑乙酰胆碱可抑制制If，迷走神经，迷走神经减慢心率减慢心率。电压门控钾通道电压门控钾通道61膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件（二）配体门控离子通道（二）配体门控离子通道 当当配配体体与与配配体体门门控控离离子子通通道道结结合合后后，引引起起通通道蛋白构型变化，道蛋白构型变化，致通道开放。致通道开放。心血管系统心血管系统主要有主要有:1.1.乙酰胆碱激活钾通道乙酰胆碱激活钾通道(KACh)：参与迷走调控。参与迷走调控。2.ATP敏感钾通道敏感钾通道(KATP)：心肌缺血、缺氧开放。心肌缺血、缺氧开放。3.3.钙激活钾通道钙激活钾通道(KCa)：参与血管张力调控。参与血管张力调控。62膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件配体门控离子通道配体门控离子通道63膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件一、作用于钠通道的药物一、作用于钠通道的药物 The drugs used in sodium channelThe drugs used in sodium channel 作用于钠通道的药物主要是钠通道作用于钠通道的药物主要是钠通道阻滞药，临床常用的有阻滞药，临床常用的有局部麻醉药局部麻醉药、抗抗癫痫药癫痫药和和类抗心律失常药类抗心律失常药。64膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件离离子子通通道道药药理理学学和和作作用用于于离离子子通通道道的的药药物物B 电压门控的调制剂电压门控的调制剂 长链肽类神经毒素长链肽类神经毒素 C 通道活化增强剂，如通道活化增强剂，如-蝎毒、箭毒蛙蝎毒、箭毒蛙毒素毒素(BTX)、藜芦碱毒素、藜芦碱毒素(VER)等等 65膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件二、作用于钾通道的药物二、作用于钾通道的药物二、作用于钾通道的药物二、作用于钾通道的药物The drugs used in potassium channelThe drugs used in potassium channel 作用于钾通道的药物被称为钾通道调控剂，作用于钾通道的药物被称为钾通道调控剂，包括包括钾通道阻滞药钾通道阻滞药（阻滞细胞内（阻滞细胞内K+外流）和外流）和钾钾通道开放药通道开放药（促进细胞内（促进细胞内K+外流）。外流）。钾通道阻滞药钾通道阻滞药（Potassium channel Potassium channel blockers,PCBsblockers,PCBs）是一类可抑制）是一类可抑制K K+通过膜不同钾通过膜不同钾通道亚型的化合物。包括通道亚型的化合物。包括非选择性非选择性PCBsPCBs（四乙（四乙基铵、基铵、4-4-氨基吡啶）和氨基吡啶）和选择性选择性PCBsPCBs（磺酰脲类（磺酰脲类降糖药、降糖药、类抗心律失常药）。类抗心律失常药）。66膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件钾通道开放药钾通道开放药（PCOsPCOs）是选择性作用于钾通道，增加细胞）是选择性作用于钾通道，增加细胞膜对膜对K K+的通透性，促进的通透性，促进K K+外流外流)的一类药物。的一类药物。促细胞内促细胞内K K+外流，外流，膜超级化膜超级化，降低钙通道开放降低钙通道开放、阻止、阻止CaCa2+2+的重摄取、储存和释放，细胞内的重摄取、储存和释放，细胞内CaCa2+2+下降。均作用于下降。均作用于K KATP ATP，舒张血管平滑肌。舒张血管平滑肌。按化学结构分为按化学结构分为7 7组组:(1)(1)苯并吡喃类苯并吡喃类:克罗卡林克罗卡林 (5)(5)苯并噻二嗪类：苯并噻二嗪类：二氮嗪二氮嗪(2)(2)吡啶类：吡啶类：尼可地尔尼可地尔 (6)(6)硫代甲酰胺类：硫代甲酰胺类：RP25891RP25891(3)(3)嘧啶类：嘧啶类：米诺地尔米诺地尔 (7)1,4(7)1,4二氢吡啶类：二氢吡啶类：尼古地平尼古地平(4)(4)氰胍类：氰胍类：吡那地尔吡那地尔Potassium channel openerPotassium channel opener钾通道开放药钾通道开放药钾通道开放药钾通道开放药（PCOsPCOs）67膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件【药理作用与临床应用】【药理作用与临床应用】高血压：高血压：高选择性地舒张阻力血管高选择性地舒张阻力血管(强，强，吡那地尔吡那地尔和米诺地尔和米诺地尔）。）。心绞痛和心肌梗死：心绞痛和心肌梗死：高选择性地扩张正常及有病变高选择性地扩张正常及有病变的冠脉，改善冠脉血供的冠脉，改善冠脉血供(尼可地尔尼可地尔)。心肌保护作用：心肌保护作用：使缺血心肌细胞膜超极化，恢复紊使缺血心肌细胞膜超极化，恢复紊乱的电解质平衡，减轻乱的电解质平衡，减轻CaCa2+2+超载。超载。充血性心衰：充血性心衰：降低安静及运动时的左、右心室负荷降低安静及运动时的左、右心室负荷(尼可地尔尼可地尔)。Potassium channel opener钾通道开放药（钾通道开放药（PCOs）68膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件钾离子开放剂的应用钾离子开放剂的应用69膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件离子通道药理学和作用于离子通道的药物离子通道药理学和作用于离子通道的药物钾离子通道开放剂的抗心肌缺血作用机制：钾离子通道开放剂的抗心肌缺血作用机制：心心肌肌缺缺血血 K KATPATP激激活活 心心肌肌细细胞胞ATPATP浓浓度度 K KATPATP抑制抑制KCO KCO K KATPATP开开放放 膜膜超超极极化化 恢恢复复电电生生理理平平衡衡 能能量量消消耗耗减减少少 Ca+Ca+超超载载 自自由由基基 心心肌损伤肌损伤 70膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件 钙通道阻滞药钙通道阻滞药(Calcium channel blockers)(Calcium channel blockers)/钙拮钙拮抗药抗药(calcium antagonists)(calcium antagonists)是一类选择性阻滞钙通道，是一类选择性阻滞钙通道，抑制细胞外抑制细胞外CaCa2+2+内流，降低内流，降低CaCa2+2+i i的药物。的药物。三、作用于钙通道的药物三、作用于钙通道的药物 The drugs used in calcium channel类类 选择性作用于选择性作用于L-型钙通道的药物型钙通道的药物 a类（二氢吡啶类）：硝苯地平类（二氢吡啶类）：硝苯地平 nifedipinenifedipine b类（地尔硫卓类）：地尔硫卓类（地尔硫卓类）：地尔硫卓 diltiazemdiltiazem c c类（苯烷胺类）：维拉帕米类（苯烷胺类）：维拉帕米 verapamilverapamil d d类：粉防己碱类：粉防己碱 tetrandrinetetrandrine类类 选择性作用于选择性作用于T T型、型、N N型或型或P P型钙通道的药物型钙通道的药物类类 非选择性钙通道调节药非选择性钙通道调节药71膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件心心律律失失常常与与离离子子通通道道心肌细胞膜上多种离子通道有关。钠、钙、钾通道的表达及功能的异常。如：钠内流增加、钾外流减少，产生Q-T间期延长综合征Ina抑制过强，出现传到阻滞72膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件冠冠状状动动脉脉硬硬化化心心脏脏病病与与离离子子通通道道冠脉阻塞后 心肌梗死静息电位：钾外流增加，细胞缺钾动作电位上升最大速率和钠电流：动作电位复极：73膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件高高血血压压与与离离子子通通道道钙：L型：兴奋收缩偶联 T型：心肌起搏细胞，与细胞生长、增殖和激素分泌有关钾通道：膜的超级化、抑制钙内流氯通道：激活时产生内向电流、引起膜去极化、触发L型钙通道开放导致血管平滑肌松弛。74膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件脑脑缺缺血血与与离离子子通通道道钙超载：细胞损伤钠通道：钠钙交换逆向 钠出细胞 钙入细胞钾通道开放药：钾通道开放 外流 膜超级化 钠通道不易激活，兴奋性降低，电压依赖钙通道失活。75膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件76膜片钳技术与离子通道药理学膜片钳技术与离子通道药理学 PPT课件课件