富营养化水体中藻类的测定叶绿素a法

【目的和要求】了解富营养化水体评价方法掌握叶绿素a的测定原理及方法。水体富营养化水体富营养化(eutrophication)是指在人类活动的影响是指在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。在自然条件下，湖泊也会从贫营养状态过渡亡的现象。在自然条件下，湖泊也会从贫营养状态过渡到富营养状态，不过这种自然过程非常缓慢。而人为排到富营养状态，不过这种自然过程非常缓慢。而人为排放含营养物质的工业废水和生活污水所引起的水体富营放含营养物质的工业废水和生活污水所引起的水体富营养化则可以在短时间内出现。水体出现富营养化现象时，养化则可以在短时间内出现。水体出现富营养化现象时，浮游藻类大量繁殖，形成水华。因占优势的浮游藻类的浮游藻类大量繁殖，形成水华。因占优势的浮游藻类的颜色不同，水面往往呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等。颜色不同，水面往往呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等。这种现象在海洋中则叫做赤潮或红潮。这种现象在海洋中则叫做赤潮或红潮。水体形成富营养化的指标是：水体水体形成富营养化的指标是：水体中含氮量大于中含氮量大于0.2-0.3 mg/L，含磷量大于，含磷量大于0.010.02mg/L，生化需氧量（，生化需氧量（BOD5）大于大于10mg/L。在。在pH值值79的淡水中细菌的淡水中细菌总数达到总数达到105个个ml，标志藻类生长的叶，标志藻类生长的叶绿素绿素a大于大于10gL。水体富营养化水体富营养化水体富营养化水体富营养化富营养化水体中的常见藻类富营养化水体中的常见藻类 水华鱼星藻（水华鱼星藻（Anabaena flos-aqua）铜色微囊藻）铜色微囊藻（Microcystis aeruginosa）、水华束丝藻）、水华束丝藻（Aphanizomenon flos-aqua）、居氏腔球藻）、居氏腔球藻（Coelosphaerium kuetzingianum）、细针胶刺藻）、细针胶刺藻（Glowotrichia echinulata）、泡沫节球藻（、泡沫节球藻（Nodularia spmigena）在海岸或海湾中，引起在海岸或海湾中，引起“赤潮赤潮”的藻类主要是甲藻，的藻类主要是甲藻，如角藻属如角藻属（Ceratium）、环沟藻属（）、环沟藻属（Gymnodinium）、）、膝沟藻属（膝沟藻属（Gonyaulax）。）。水体富营养化水体富营养化评价水体富营养化的指标评价水体富营养化的指标 v 测定水域中光合作用强度与呼吸作用强度之比测定水域中光合作用强度与呼吸作用强度之比v测定藻类生产潜在能力（测定藻类生产潜在能力（AGP）v黑黑-白瓶法测定光合作用产氧能力白瓶法测定光合作用产氧能力 v其它评价富营养化的方法其它评价富营养化的方法 水体富营养化水体富营养化实验目的和意义叶绿素a与叶绿素b是藻类植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。实验原理实验原理 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和。将上式整理，可以得到下式：Ca=0.0127A663-0.00269A645（3）Cb=0.0229A645-0.00468A663（4）将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为：Ca=12.7A663-2.69A645（5）Cb=22.9A645-4.68A663（6）CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）CT为叶绿素的总浓度实验仪器及材料实验材料实验材料：富营养化水体中的藻类实验仪器及试剂实验仪器及试剂：UV-1700分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；丙酮；石英砂；CaCO3；实验步骤实验步骤 1.提取叶绿素提取叶绿素 于天平上称取于天平上称取0.5g藻体，（也可用打孔器打取一定数量的叶圆藻体，（也可用打孔器打取一定数量的叶圆片，计算总的叶面积），剪碎后置于研体中，加入片，计算总的叶面积），剪碎后置于研体中，加入5ml 80%丙酮，少许丙酮，少许CaCO3和石英砂。仔细研磨成匀浆，用滤斗过滤和石英砂。仔细研磨成匀浆，用滤斗过滤到到10ml量筒中，注意在研钵中加入少量量筒中，注意在研钵中加入少量80%丙酮将研钵洗丙酮将研钵洗净，一并转入研钵中过滤到量筒内，并定容至净，一并转入研钵中过滤到量筒内，并定容至10ml。将量。将量筒内的提取液混匀，用移液管小心抽取筒内的提取液混匀，用移液管小心抽取5ml转入转入25ml量筒中，量筒中，再加入再加入80%丙酮定容至丙酮定容至25ml（最终植物材料与提取液的比（最终植物材料与提取液的比例为例为W：V0.5：501：100，叶色深的植物材料比例要，叶色深的植物材料比例要稀释到稀释到1：200）。）。2.测量光吸收利用722分光光度计或UV1700分光光度计，分别测定叶绿素提取液在645nm和663nm下的吸光度。结果分析结果分析 将测得的数值代入到公式（5）（6）（7）中，计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。最后要计算出单位叶片鲜重中叶绿素的含量：叶绿素a含量(mg/g鲜重)Ca50ml（总体积数）1ml/1000ml/L 0.5g=0.1Ca叶绿素b含量(mg/g鲜重)0.1Cb总叶绿素含量(mg/g鲜重)0.1CT