蛋白酶活力测定课件

蛋白酶活力测定一、概述一、概述二、测定原理二、测定原理三、试剂三、试剂四、操作手续四、操作手续五、计算五、计算六、注意事项六、注意事项1一、概述1 1什么是酶？什么是酶？2 2影响酶催化反应的影响酶催化反应的因素因素3 3什么是酶的活力什么是酶的活力?4 4测定意义测定意义5.5.测定方法测定方法2生物催化剂生物催化剂特殊催化功能的蛋白质特殊催化功能的蛋白质酶的特性:（1 1）作用有专一性、选择性）作用有专一性、选择性（2 2）催化速度快）催化速度快（3 3）反应条件温和）反应条件温和 （4 4）化学本质是蛋白质）化学本质是蛋白质一一一一种种种种酶酶酶酶只只只只作作作作用用用用一一一一种种种种底底底底物：物：物：物：淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶：只只只只能能能能催催催催化化化化淀淀淀淀粉粉粉粉水水水水解解解解 糊糊糊糊精精精精、低聚糖；低聚糖；低聚糖；低聚糖；蛋白酶：只能催蛋白酶：只能催蛋白酶：只能催蛋白酶：只能催化蛋白质水解化蛋白质水解化蛋白质水解化蛋白质水解 氨氨氨氨基酸、肽；基酸、肽；基酸、肽；基酸、肽；在激烈振荡、加热、在激烈振荡、加热、在激烈振荡、加热、在激烈振荡、加热、紫外线、紫外线、紫外线、紫外线、X-X-X-X-射线的照射线的照射线的照射线的照射，重金属盐作用下，射，重金属盐作用下，射，重金属盐作用下，射，重金属盐作用下，它的二、三结构会发它的二、三结构会发它的二、三结构会发它的二、三结构会发生改变。而变性，失生改变。而变性，失生改变。而变性，失生改变。而变性，失去催化能力这种现象去催化能力这种现象去催化能力这种现象去催化能力这种现象叫做叫做叫做叫做酶的失活酶的失活酶的失活酶的失活 3底物浓度底物浓度pHpH温度温度时间时间4 V V V V V V V Vmaxmaxmaxmax 底物浓度底物浓度底物浓度底物浓度C C C C C C C C0 0 0 0 饱和浓度饱和浓度饱和浓度饱和浓度底物浓度底物浓度5 OD pH pH最适溶液溶液pHpH的影响的影响6酶的分类vv酸性蛋白酶酸性蛋白酶 3350 3350 pHpH最适最适=2=24 4；7401 7401 pHpH最适最适=3.0=3.0vv中性蛋白酶中性蛋白酶 1398 1398 pHpH最适最适=7=77.57.5；166 166 pHpH最适最适=7=78 8vv碱性蛋白酶碱性蛋白酶 2709 2709 pHpH最适最适=9=91111；209 209 pHpH最适最适=9.5=9.511117 ODOD T T T T（）T T最适最适温度的影响温度的影响833503350：T T最最适适 ：4545-47-47 4040以以下下稳稳定定13981398：T T最最适适 ：3030-37-37（pHpH：6.0-6.5 6.0-6.5）T T最最 适适 ：4040-50-50（pHpH：7.0-7.0-7.5 7.5）27092709：T T最最适适 ：4545-55-55 4040以以下下稳稳定定。9 Q Q（反应物的消耗量或生成物的生成量反应物的消耗量或生成物的生成量)t t0 0 t t 作用时间的影响作用时间的影响o oA dQdtKdQdtv10结 论酶催化反应酶催化反应在反应初速度时间内在反应初速度时间内最适温度最适温度最适最适pHpH饱合底物浓度饱合底物浓度在最大活力处比较在最大活力处比较11在一定温度、在一定温度、pHpH条件下，条件下，1 1g g酶粉或酶粉或1 1mlml酶酶液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。表示为：单位表示为：单位/g g或单位或单位/mlml。通常人通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为5 5万单位，即：万单位，即：5000050000gg/g g=0.05=0.05g g酪氨酸酪氨酸/1/1g g酶粉。酶粉。蛋白酶的活力定义：蛋白酶的活力定义：12测定意义生皮蛋白生皮蛋白质质 胶原蛋白胶原蛋白（80%-85%80%-85%80%-85%80%-85%）非胶原蛋白非胶原蛋白 弹性蛋白弹性蛋白网硬蛋白网硬蛋白间质蛋白间质蛋白酶的活力会下降酶的活力会下降酶的活力会下降酶的活力会下降酶的催化能力强酶的催化能力强酶的催化能力强酶的催化能力强13测定方法乙醇滴定法、甲醛滴定法等乙醇滴定法、甲醛滴定法等FolinFolin-酚酚法法，紫紫外外分分光光光光度度法法，残残氮量测定法等等。氮量测定法等等。GrossGross法法、明明胶胶粘粘度度下下降降法法、凝凝乳乳作用法作用法 酸酸性性蛋蛋白白酶酶活活性性，还还可可以以根根据据胰胰蛋蛋白酶原激活作用的大小来表示。白酶原激活作用的大小来表示。14 福福林林试试剂剂，在在碱碱性性情情况况下下极极不不稳稳定定。可可被被酚酚类类化化合合物物还还原原，而而呈呈蓝蓝色色反反应应。由由于于蛋蛋白白质质或或水水解解产产物物中中含含有有酚酚基基的的氨氨基基酸酸(酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸等等)也也呈呈这这个个反反应应，因因此此可可以以利利用用这这个个原原理理来测定蛋白酶活性的强弱。来测定蛋白酶活性的强弱。二、测定原理151酶催化反应酪蛋白酪蛋白酶催化酶催化条件条件酪氨酸酪氨酸白白白白色色色色至至至至黄黄黄黄色色色色粉粉粉粉沫沫沫沫，无无无无臭臭臭臭无无无无味味味味，溶溶溶溶于于于于稀稀稀稀碱碱碱碱、浓浓浓浓酸酸酸酸，在在在在弱弱弱弱酸酸酸酸中中中中沉沉沉沉淀淀淀淀，几几几几乎乎乎乎不不不不溶溶溶溶于于于于水水水水，有有有有吸吸吸吸湿湿湿湿性性性性，干干干干燥燥燥燥时时时时稳稳稳稳定定定定，潮潮潮潮湿湿湿湿时时时时迅迅迅迅速速速速变质。变质。变质。变质。条件：条件：条件：条件：底物浓度底物浓度底物浓度底物浓度 温度温度温度温度 pH pH pH pH 时间时间时间时间选择：选择：选择：选择：C C C C0 0 0 0 T T T T最适最适最适最适 pHpHpHpH最适最适最适最适 t t t t0 0 0 0措施：措施：措施：措施：C C C C C C C C0 0 0 0 恒温水浴恒温水浴恒温水浴恒温水浴 缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液 t t t t=t t t t0 0 0 0例子：例子：例子：例子：537 0.5%537 0.5%537 0.5%537 0.5%酪蛋白酪蛋白酪蛋白酪蛋白 40 40 40 40 3.0 10 3.0 10 3.0 10 3.0 10minminminmin例子：例子：例子：例子：1398 0.5%1398 0.5%1398 0.5%1398 0.5%酪蛋白酪蛋白酪蛋白酪蛋白 40 40 40 40 7.5 10 7.5 10 7.5 10 7.5 10minminminmin例子：例子：例子：例子：2709 0.5%2709 0.5%2709 0.5%2709 0.5%酪蛋白酪蛋白酪蛋白酪蛋白 40 40 40 40 10 10 10 10 10 10 10 10minminminmin16 2.显色反应 福林试剂福林试剂 +酪氨酸酪氨酸 OH-OH-HO CHHO CH2 2CHCOOH CHCOOH 还原性还原性 NHNH2 2钼蓝钼蓝+钨蓝钨蓝蓝色物色物质17 显色剂 NaNa2 2WOWO4 4 Na Na2 2MoOMoO4 4 H H2 2O O H H3 3POPO4 4 福林试剂福林试剂 HCL HCL Li Li2 2SOSO4 4 Br Br2 2显色剂显色剂亮金亮金黄色色183朗伯-比尔定律及其应用E E 吸光度吸光度A A 消光值消光值ODOD 光密度光密度 E E=KK L L =lg lg（I I0 0/I I）=K CK C透光率透光率 T =T =I II I0 0入射光强度入射光强度入射光强度入射光强度I I I I0 0 0 0透过光强度透过光强度透过光强度透过光强度I I I I有色真溶液有色真溶液有色真溶液有色真溶液C CL L L L19朗伯-比尔定律的应用 X X RXRX ODOD被测组分的浓度与光被测组分的浓度与光被测组分的浓度与光被测组分的浓度与光密度密度密度密度ODODODOD成直线关系成直线关系成直线关系成直线关系 X X ODOD OD=KCOD=KC RXRX OD=OD=KKCC X X 20选择选择maxmax注 意:max=680max=680nmnmODOD值的范围值的范围ODOD=0.2=0.20.60.6ODOD=0.43=0.43214制作标准曲线酪氨酸浓度酪氨酸浓度C C OD OD C C1 1 ODOD1 1 C C2 2 ODOD2 2 C C3 3 ODOD3 3 C Cn n ODODn n22福林酚法测定蛋白酶活力 方法要点 配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定条件下（条件下（T T、pHpH、t t）与福林试剂显色后，测定与福林试剂显色后，测定光密度光密度ODOD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温度、度、pHpH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋酸终止反应酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移并使未水解的酪素沉淀，过滤，移取滤液，加入碳酸钠调节取滤液，加入碳酸钠调节pHpH为碱性，再加入福为碱性，再加入福林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较，林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较，计算出被测酶制剂的活力。计算出被测酶制剂的活力。23 三、试剂10 10 10 10 CLCLCLCL3 3 3 3CCOOH CCOOH CCOOH CCOOH 水溶液水溶液水溶液水溶液0.550.550.550.55molmolmolmol/L L L L碳酸钠溶液碳酸钠溶液碳酸钠溶液碳酸钠溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液福林试剂福林试剂福林试剂福林试剂 显色剂显色剂显色剂显色剂 一种杂多酸一种杂多酸一种杂多酸一种杂多酸磷钼酸磷钼酸磷钼酸磷钼酸 H H H H3 3 3 3PPPP（MoMoMoMo3 3 3 3O O O O10101010）4 4 4 4 磷钨酸磷钨酸磷钨酸磷钨酸 H H H H3 3 3 3PPPP（W W W W3 3 3 3O O O O10101010）4 4 4 4 24福林试剂的配制NaNaNaNa2 2 2 2WOWOWOWO4 4 4 42H2H2H2H2 2 2 2O 100O 100O 100O 100g g g g NaNaNaNa2 2 2 2MoOMoOMoOMoO4 4 4 42H2H2H2H2 2 2 2o 25o 25o 25o 25g g g g Li Li Li Li2 2 2 2 SOSOSOSO4 4 4 4 50505050g g g gH H H H2 2 2 2O 100O 100O 100O 100mlmlmlml 10 10 10 10hrhrhrhr+85H85H85H85H3 3 3 3POPOPOPO4 4 4 4 50 50 50 50mlmlmlml H H H H2 2 2 2O 50O 50O 50O 50mlmlmlml浓浓浓浓HCL 100HCL 100HCL 100HCL 100mlmlmlml 混匀混匀混匀混匀+溴水溴水溴水溴水 15 15 15 15 冷却冷却冷却冷却 黄色黄色黄色黄色 过滤过滤过滤过滤 回流回流回流回流 金金黄色溶液色溶液25(1)柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液pH=3.0A A液：液：0.10.1mol/Lmol/L柠檬酸柠檬酸 21.01 21.01g g C C6 6H H8 8O O7 7HH2 2O 1000O 1000mlml CH CH2 2COOHCOOH HOC COOH HOC COOH CH CH2 2COOHCOOHB B液：液：0.10.1mol/Lmol/L柠檬酸纳柠檬酸纳 29.4 29.4g g Na Na3 3C C6 6H H5 5O O7 72H2H2 2O 1000O 1000mlml 用时：用时：AB=18.61.4AB=18.61.4混合混合26柠檬酸柠檬酸钠溶液的pH计算弱酸弱酸弱酸盐缓冲体系弱酸盐缓冲体系 pH=pkpH=pka1a1+lg+lg（C C酸酸/C C盐盐）=3.13 =3.13+lg+lg（C C酸酸/C C盐盐）柠檬酸柠檬酸:pKpKa1a1 =3.13 =3.13 pKpKa2a2=4.76 =4.76 pKpKa3a3=6.40=6.4027（2）0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液A A液：液：0.20.2mol/Lmol/L NaH NaH2 2POPO4 4溶液溶液 31.2 31.2g g NaH NaH2 2POPO4 42H2H2 2O 1000O 1000mlmlB B液：液：0.20.2mol/Lmol/L Na Na2 2HPOHPO4 4溶液溶液 71.7 71.7g g Na Na2 2HPOHPO4 412H12H2 2O O 10001000mlml28 pH=7.2的磷酸盐缓冲溶液A A液液 28 28mlml B B液液 72 72mlmlH H2 2O O 1000ml pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液A A液液1616mlmlB B液液8484mlmlH H2 2O O 1000ml29磷酸盐缓冲溶液pH计算 pH=pH=pKpKa a +lg+lg（C C酸酸/C C盐盐）H H2 2POPO4 4-=7.21+lg =7.21+lg HPO HPO4 4=K Ka2a2 =6.1710=6.1710-8-830（3）硼砂氢氧化纳缓冲溶液 pH=10n nA A液：液：0.0550.055mol/Lmol/L Na Na2 2B B4 4O O7 7 8 H 8 H2 2O O 19 19g g Na Na2 2B B4 4O O7 7 8 H 8 H2 2O 1000O 1000mlmln nB B液：液：0.2 0.2 mol/Lmol/L NaOH NaOH 8 8g g NaOH NaOH 1 1000000mlmln nA A液液5050mlmln nB B液液4343mlml H H2 2OO 200200mlml31硼砂氢氧化纳缓冲溶液的pH计算弱酸弱酸弱酸盐缓冲体系弱酸盐缓冲体系NaNa2 2B B4 4O O7 7 +7H+7H2 2O NaOH+4HO NaOH+4H3 3BOBO3 3H H3 3BOBO3 3 +H+H2 2O B(OH)O B(OH)4 4-+H+H+一元弱酸一元弱酸KaKa=5.610=5.610-10-10 pH=pH=pkpka1a1-lg-lg（C C酸酸/C C盐盐）=9.24-=9.24-lglg（C C酸酸/C C盐盐）32 四、操作手续（一）制作标准曲线（一）制作标准曲线 1 1配制配制100100g/mlg/ml酪氨酸标准溶液酪氨酸标准溶液 2 2配制系列浓度的酪氨酸标准溶液配制系列浓度的酪氨酸标准溶液 3.3.与福林试剂反应显色，测与福林试剂反应显色，测ODOD值值 4.4.绘制标准曲线绘制标准曲线 （二）测定蛋白酶活力（二）测定蛋白酶活力实测实测 1 1缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制 2 2底物配制底物配制 3 3待测酶液配制待测酶液配制 4 4测定测定33（一）制作标准曲线1 1配制配制100100g/mLg/mL酪氨酸标准溶液酪氨酸标准溶液 0.10000.1000g g酪酪氨酸酸 0.10.1mol/Lmol/LHCLHCL 100100mlml容量容量瓶 1 1mg/mlmg/ml=1000=1000g/mlg/ml再移取再移取1010mlml 0.10.1mol/LHCLmol/LHCL 100100mlml容量容量瓶 0.0.1 1mg/mlmg/ml=100100g/mlg/ml34思考题n n为什么酪氨酸要干燥至恒重？为什么酪氨酸要干燥至恒重？n n为什么酪氨酸要称准至为什么酪氨酸要称准至0.10000.1000g g？n n为什么酪氨酸用盐酸溶解？为什么酪氨酸用盐酸溶解？n n为为什什么么要要先先配配成成10001000ug/mlug/ml，再再配配成成100100ug/mlug/ml？352配制系列浓度的酪氨酸标准溶液363系列浓度的酪氨酸显色并测OD值酪氨酸标准溶液酪氨酸标准溶液1 1mlml 摇匀摇匀 10 10分钟分钟 蓝色蓝色 冷却冷却1 1cmcm比色皿比色皿680680nmnm波长波长5 5mlml0.550.55mol/Lmol/L Na Na2 2COCO3 34040水浴水浴水浴水浴0号调零，测号调零，测OD值值福林试剂福林试剂福林试剂福林试剂1 1mlml37说明（1 1）各试剂均用刻度移液管移取）各试剂均用刻度移液管移取（2 2）显色后需冷却到室温）显色后需冷却到室温（3 3）每一点测两份，）每一点测两份，ODOD0.010.01 共共36361818支干试管支干试管384数据处理（1 1）画图求直线斜率的）画图求直线斜率的倒数倒数K K（2 2）计算计算K K（3 3）直接查取直接查取（4 4）计算机处理，回归曲线：）计算机处理，回归曲线：C=KC=K.ODOD39（1）画图求直线斜率的倒数K CC K K=ODOD（g/mlg/ml ODOD）ODCC C（g/mlg/ml）CCCCODODODOD40（2）计算K K Kn n n n=K K1 1+K+K2 2+K+K3 3+K+K4 4+K+K5 5 K K=C Cn n n nODODn n n n5 541（3）直接查取（4 4）计算机处理，回归曲线：）计算机处理，回归曲线：C=KODC=KOD42（二）测定蛋白酶活力实测 1 1缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制 2 2底物配制底物配制 3 3待测酶液配制待测酶液配制 4 4测定测定431缓冲溶液的配制酸性蛋白酶。如：酸性蛋白酶。如：537 537 pHpH最适最适=3.0=3.0 柠檬酸柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液柠檬酸钠缓冲溶液 pH=3.0pH=3.0中性蛋白酶。如：中性蛋白酶。如：1398 1398 pHpH最适最适=7=77.57.5；0.02 0.02mol/Lmol/L的磷酸缓冲溶液的磷酸缓冲溶液 pH=7.5pH=7.5碱性蛋白酶。如：碱性蛋白酶。如：2709 2709 pHpH最适最适=9 =9 1111；硼砂硼砂氢氧化纳缓冲溶液氢氧化纳缓冲溶液 pH=10pH=10442底物配制中性、碱性蛋白酶中性、碱性蛋白酶 0.5 0.5或或22酪素酪素 饱合浓度饱合浓度 450.5酪素溶液的配制 0.50.5g g酪素酪素 润涨润涨 透明透明 调调pH=pHpH=pH最适最适 冷却冷却 100 100mlml 0.50.5mol/Lmol/L的的的的NaOHNaOH0.10.1mol/Lmol/L的的的的HCLHCL沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴pH=pHpH=pH最适最适最适最适的缓冲溶液的缓冲溶液的缓冲溶液的缓冲溶液463配制待测酶液0.50.5g g酶粉酶粉 研磨研磨 5 5 研磨研磨 5 5 搅拌搅拌 沉降沉降 转移清液转移清液 研磨研磨 反复反复3-43-4次次 200 200mlml 8 8层干沙布层干沙布 过滤过滤 吸取吸取 10 10mlml滤液滤液 100 100mlml容量瓶容量瓶 缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液47配制酶液的关键vv稀释倍数与称量质量的原则稀释倍数与称量质量的原则 光密度光密度OD=0.4OD=0.4（或或0.2-0.60.2-0.6）vv研磨时间研磨时间48酪蛋白酪蛋白 酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸 +福林试剂福林试剂 蓝色溶液蓝色溶液3测定酶催化酶催化条件条件49操作手续（一）50操作手续 (二)51测定OD 值n n测定温度：室温测定温度：室温n n比色皿厚比色皿厚=1=1cmcmn nmaxmax=680=680nm nm n n“0”“0”号调零，测号调零，测11、22平行平行管管 ODOD0.010.0152解 释n n三个系列试管的异同三个系列试管的异同n n过滤操作过滤操作n n滤液介质滤液介质n n空白选择空白选择n n前后两个前后两个1010分钟有什么不同？分钟有什么不同？53五、计算 KOD6NKOD6N 6KODN6KODN 单位单位/g g =10m 10m10m 10m ODODODOD：实测光密度的平均值；实测光密度的平均值；实测光密度的平均值；实测光密度的平均值；K K K K：酪氨酸（酪氨酸（酪氨酸（酪氨酸（g/mlg/mlg/mlg/ml）/OD/OD/OD/OD；6 6 6 6：过滤前溶液的体积为过滤前溶液的体积为过滤前溶液的体积为过滤前溶液的体积为6 6 6 6mlmlmlml；N N N N：稀释倍数。在此稀释倍数。在此稀释倍数。在此稀释倍数。在此N N N N=2000=2000=2000=2000；m m m m：酶粉质量（酶粉质量（酶粉质量（酶粉质量（g g g g）；）；）；）；10 10 10 10：反应时间为反应时间为反应时间为反应时间为10101010分钟。分钟。分钟。分钟。54六、注意事项n n微量分析，麻烦、细碎。微量分析，麻烦、细碎。n n特别细心操作。特别细心操作。n n严格控制条件、温度、反应时间等。严格控制条件、温度、反应时间等。55