蛋白质的折叠课件

第十五章第十五章蛋白质的合成蛋白质的合成DNA:ATGCATGCATGCRNA:AUGCAUGCAUGCPROTEIN:aa1aa2aa3aa4什么样的碱基序列决定什么样的氨基酸序列呢？如何实现碱基序列到氨基酸序列的转变？第一节第一节蛋白质生物合成的理论基础蛋白质生物合成的理论基础一、一、mRNA（一）、一）、原核生物原核生物mRNA的结构的结构（1）5端SD序列在起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体16SrRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的共同序列，一般为AGGA，此序列称SD序列。它与核糖体小亚基内16SrRNA的3端一段富含嘧啶的序列GAUCACCUCCUUA-OH互补，使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。（2）许多原核mRNA是多顺反子。转译时，各个基因都有自己的SD序列、起始密码子、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止，也就是说，每个基因的翻译都是相对独立的。如E.coli，一个7000bp的mRNA编码5种与Trp合成有关的酶（二）、（二）、真核生物真核生物mRNA的结构的结构（1）真核mRNA5端具有m7GpppN帽子结构，无SD序列。帽子结构具有增强翻译效率的作用。若起始AUG与帽子结构间的距离太近（小于12个核苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下游适当的AUG起始翻译。当距离在17-80个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。（2）真核生物mRNA通常是单顺反子。真核mRNA具有“第一AUG规律”，即当5端具有数个AUG时，其中只有一个AUG为主要开放阅读框架的翻译起点。起始AUG具有二个特点：AUG上游的-3经常是嘌呤，尤其是A。紧跟AUG的+4常常是G。起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率最高。若-3不是A，则+4必须是G。无此规律的AUG，则无起始功能。二、二、遗传密码遗传密码3个碱基编码1个氨基酸,称为三联体密码或密码子（一）、（一）、遗传密码的特点遗传密码的特点64个密码子中有61个编码氨基酸，3个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终止密码子，它们是UAG、UAA、UGA，密码子AUG（编码Met）又称起始密码子。密码子：mRNA上由三个相邻的核苷酸组成一个密码子，代表肽链合成中的某种氨基酸或合成的起始与终止信号。（1）方向性：从mRNA的5到3（2）连读性：编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列，密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子到终止密码子（不包括终止子）构成一个完整的读码框架，又称开放阅读框架（ORF）。如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移位性错误（称为移码）。两个基因之间或两个ORF之间可能会互相部分重叠（共用部分序列）。（3）简并性几种密码子编码一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都编码Gly，那么这4种密码子就称为Gly的简并密码。只有Met和Trp没有简并密码。一般情况下密码子的简并性只涉及第三位碱基。（4）摇摆性密码子中第三位碱基与反密码子第一位碱基的配对有时不一定完全遵循A-U、G-C的原则，Crick把这种情况称为摇摆性，有人也称摆动配对或不稳定配对。密码子的第三位和反密码子的第一位是摇摆位点。反密码子第一位的G可以与密码子第三位的C、U配对，U可以与A、G配对，I可以和密码子的U、C、A配对，这使得该类反密码子的阅读能力更强。（5）通用性：密码子在不同物种间几乎是完全通用的。目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况，这也是如火如荼的转基因的前提。但要注意的是不同生物往往偏爱某一种密码子。三、三、tRNA在氨基酸在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的合成酶催化下，特定的tRNA可与相应的可与相应的氨基酸结合，生成氨基氨基酸结合，生成氨基酸酸tRNA，从而携带氨基酸参与蛋白质的从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。生物合成。tRNA反密码环中部的三个核苷酸构成三反密码环中部的三个核苷酸构成三联体，可以识别联体，可以识别mRNA上相应的密码，上相应的密码，此三联体就称为此三联体就称为反密码反密码(anticodenanticoden)。反密码对密码的识别，通常也是根据碱反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原则，即基互补原则，即AU，GC配对。但配对。但反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之间的配对，并不严格遵循碱基互补原则。间的配对，并不严格遵循碱基互补原则。如反密码第一个核苷酸为如反密码第一个核苷酸为，则可与，则可与A、U或或C配对配对，如为，如为U，则可与则可与A或或G配对配对，这种配对称为这种配对称为不稳定配对不稳定配对。能能够够识识别别mRNA中中5端端起起动动密密码码AUG的的tRNA是是一一种种特特殊殊的的tRNA，称称为为起起动动tRNA。在在原原核核生生物物中中，起起动动tRNA是是一一种种携携带带甲甲酰酰蛋蛋氨氨酸酸的的tRNA，即即tRNAifmet；而而在在真真核核生生物物中中，起起动动tRNA是是一一种种携携带蛋氨酸的带蛋氨酸的tRNA，即即tRNAimet。在在原原核核生生物物和和真真核核生生物物中中，均均存存在在另另一一种种携携带带蛋蛋氨氨酸酸的的tRNA，识识别别非非起起动动部部位位的蛋氨酸密码，的蛋氨酸密码，AUG。四、四、rRNA和核蛋白体和核蛋白体原原核核生生物物中中的的核核蛋蛋白白体体大大小小为为70S，可可分分为为30S小小亚亚基基和和50S大大亚亚基基。小小亚亚基基由由16SrRNA和和21种种蛋蛋白白质质构构成成，大大亚亚基基由由5SrRNA，23SRNA和和35种蛋白质构成。种蛋白质构成。真核生物中的核蛋白体大小为真核生物中的核蛋白体大小为80S，也分为也分为40S小亚基和小亚基和60S大亚基。小亚基由大亚基。小亚基由18SrRNA和和30多种蛋白质构成，大亚基则由多种蛋白质构成，大亚基则由5SrRNA，28SrRNA和和50多种蛋白质构成，在哺乳动多种蛋白质构成，在哺乳动物中还含有物中还含有5.8SrRNA。核核蛋蛋白白体体的的组组装装大肠杆菌核蛋白体大肠杆菌核蛋白体的空间结构为一椭的空间结构为一椭圆球体，其圆球体，其30S亚亚基呈哑铃状，基呈哑铃状，50S亚基带有三角，中亚基带有三角，中间凹陷形成空穴，间凹陷形成空穴，将将30S小亚基抱住，小亚基抱住，两亚基的结合面为两亚基的结合面为蛋白质生物合成的蛋白质生物合成的场所。场所。核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能：核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能：1小小亚亚基基：可可与与mRNA、GTP和和起起动动tRNA结结合。合。2大亚基：大亚基：（1）具具有有两两个个不不同同的的tRNA结结合合点点。A位位（右右）受受位位或或氨氨酰酰基基位位，可可与与新新进进入入的的氨氨基基酰酰tRNA结结合合；P位位（左左）给给位位或或肽肽酰酰基基位位，可与延伸中的肽酰基可与延伸中的肽酰基tRNA结合。结合。（2）具具有有转转肽肽酶酶活活性性：将将给给位位上上的的肽肽酰酰基基转转移给受位上的氨基酰移给受位上的氨基酰tRNA，形成肽键。形成肽键。（3）具有）具有GTPase活性，水解活性，水解GTP，获得能量。获得能量。（4）具有起动因子、延长因子及释放因子的）具有起动因子、延长因子及释放因子的结合部位。结合部位。在蛋白质生物合成过程中，常常由若干核蛋白在蛋白质生物合成过程中，常常由若干核蛋白体结合在同一体结合在同一mRNA分子上，同时进行翻译，分子上，同时进行翻译，但每两个相邻核蛋白之间存在一定的间隔，形但每两个相邻核蛋白之间存在一定的间隔，形成念球状结构。成念球状结构。由若干核蛋白体结合在一条由若干核蛋白体结合在一条mRNA上同时进行上同时进行多肽链的翻译所形成的念球状结构称为多肽链的翻译所形成的念球状结构称为多核蛋多核蛋白体白体。五、起动因子（五、起动因子（IF）这这是是一一些些与与多多肽肽链链合合成成起起动动有有关关的的蛋蛋白白因因子子。原原核核生生物物中中存存在在3种种起起动动因因子子，分分别别称称为为IF1-3。在在真真核核生生物物中中存存在在9种种起起动动因因子子（eIF）。其其作作用用主主要要是是促促进进核核蛋蛋白白体小亚基与起动体小亚基与起动tRNA及模板及模板mRNA结合。结合。六、延长因子（六、延长因子（EF）原核生物中存在原核生物中存在3种延长因子（种延长因子（EFTU，EFTS，EFG），），真核生物中存在真核生物中存在2种（种（EF1，EF2）。）。其作用主要促使氨基酰其作用主要促使氨基酰tRNA进入核蛋白的受进入核蛋白的受体，并可促进移位过程。体，并可促进移位过程。七、释放因子（七、释放因子（RF）原核生物中有原核生物中有4种，在真核生物中只有种，在真核生物中只有1种。其主要作用是识别终止密码，协助种。其主要作用是识别终止密码，协助多肽链的释放。多肽链的释放。八、氨基酰八、氨基酰tRNA合成酶合成酶该该酶酶存存在在于于胞胞液液中中，与与特特异异氨氨基基酸酸的的活活化以及氨基酰化以及氨基酰tRNA的合成有关。的合成有关。每种氨基酰每种氨基酰tRNA合成酶对相应氨基酸以合成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种及携带氨基酸的数种tRNA具有高度特异具有高度特异性性，这是保证，这是保证tRNA能够携带正确的氨基能够携带正确的氨基酸对号入座的必要条件。酸对号入座的必要条件。目前认为，该酶对目前认为，该酶对tRNA的识别，是因为的识别，是因为在在tRNA的氨基酸臂上存在特定的识别密的氨基酸臂上存在特定的识别密码，即第二套遗传密码。码，即第二套遗传密码。九、供能物质和无机离子九、供能物质和无机离子多多肽肽链链合合成成时时，需需ATP、GTP作作为为供供能能物质，并需物质，并需Mg2+、K+参与。参与。氨氨基基酸酸活活化化时时需需消消耗耗2分分子子高高能能磷磷酸酸键键，肽肽键键形形成成时时又又消消耗耗2分分子子高高能能磷磷酸酸键键，故故缩缩合合一一分分子子氨氨基基酸酸残残基基需需消消耗耗4分分子子高高能能磷酸键磷酸键。第二节第二节蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程一、蛋白质合成的一般过程一、蛋白质合成的一般过程（一）、氨基酸的活化和氨酰（一）、氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成的合成氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合成的第一步，由氨酰tRNA合成酶催化。每一种氨酰tRNA合成酶既能识别自己的配体氨基酸，又能识别对应的tRNA。1、活化活化氨酰tRNA合成酶首先识别并结合专一的配体氨基酸，然后氨基酸的羧基与细胞环境中的ATP发生反应形成一个酸酐型的高能复合物（氨酰AMP）。该中间复合物暂时结合在酶上。氨基酸+ATP酶/Mg2+氨酰AMP-酶+PPI2、连接连接由于氨酰tRNA合成酶上还存在专一的tRNA识别位点，因此特定的游离tRNA就会识别并结合到氨酰AMP-酶复合物的活性部位，此时氨基酸就会被转移到tRNA的3端，其羧基与tRNA3端的自由-OH形成氨酰酯键，从而形成氨酰tRNA，这也是一个高能化合物，其能量足以形成肽键。氨酰AMP-酶tRNA氨酰tRNA+AMP+酶由于氨酰tRNA能量低于氨酰AMP，所以这一过程是可以自发的。氨 基 酸 一 旦 与tRNA形 成 氨 酰tRNA后，进一步的去向就由tRNA来决定了。tRNA凭借自身的反 密 码 子 与mRNA上的密码子相识别，从而把所携带的氨基酸送到肽链的一定位置上。（二）、（二）、翻译起始翻译起始（1）小亚基与mRNA结合（2）起始氨酰tRNA进入P位点，它的反密码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基配对。（3）大亚基与小亚基结合形成起始复合物。（三）、（三）、延伸延伸mRNA：5/3/，新生肽：N/C/（1）入位：第二个氨酰tRNA通过密码子反密码子的配对作用进入核糖体的A位点（氨基位点）。（2）转肽：在大亚基上肽酰转移酶的作用下，A位点氨基酸的A-氨基亲核攻击P位点氨基酸的羧基基团并形成肽键，结果两个氨基酸均连到了A位点的tRNA上，该过程称为转肽作用，此时，P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开。（3）移位（也可称转位）：核糖体沿着mRNA移动1个密码子位置，携带肽链的tRNA转位到P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。（四）、（四）、终止终止由于终止密码子不能结合任何氨酰tRNA，于是肽链合成的终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止密码子上，接着肽酰转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉mRNA并解体成大小亚基，翻译结束。在翻译过程中除了核糖体大小亚基、mRNA和氨酰tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。这些辅助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作用。（五）、（五）、翻译后加工翻译后加工不论原核生物还是真核生物，翻译完成后，一些肽链能直接折叠成最终的活性形式，不需要加工修饰，然而经常的情况是新生肽链需要加工修饰（称为翻译后加工或修饰）包括：（1）切除部分肽段（蛋白酶）、（2）在特定氨基酸残基的侧链上添加一些基团（共价修饰）、（3）插入辅因子，还有些单肽要聚合成多亚基蛋白。翻译后加工有两方面目的：（1）功能需要（2）定向转运的需要（这在真核生物中尤为复杂，合成的蛋白要定向运输到细胞质、质膜、各种细胞器如叶绿体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等）。尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有许多相似之处，但也存在差异，这些差异正是一些抗生素治疗和研究应用的基础。抗生素作用氯霉素与50S亚基结合，抑制原核肽转移酶cycloheximide抑制真核肽转移酶活性Erythromycin抑制原核肽链延伸链霉素、卡那霉素结合到原核30S亚基上引起读妈错误，导致合成的多肽连一级结构改变Tetracycline与30S亚基结合，干扰氨酰tRNA的结合表蛋白质合成的选择性抗生素抑制剂二、二、原核生物的蛋白质合成原核生物的蛋白质合成原核生物（大肠杆菌）每秒钟可翻译20个氨基酸，真核生物每分钟才大约50个氨基酸。(一一)、翻译起始翻译起始翻译是从形成起始复合物开始的，在原核生物中该过程需要三个起始因子参与：IF1，IF2，和IF3。（IF1的功能尚不清楚）。（1）IF3首先结合在30S亚基上，防止它过早地与50S亚基结合。（2）mRNA结合到30S亚基上。（3）IF2、fMet-tRNAfmet结合到30S亚基上（4）50S大亚基结合到30S小亚基上，形成起始复合物。(二二)、延伸延伸肽链延伸分三步进行：（1）新的氨酰tRNA进入核糖体的A位点；（2）肽键形成（转肽）；（3）核糖体移位。这三步构成了肽链延伸的一个循环。1、新氨酰新氨酰tRNA入位入位在进入A位点之前，新氨酰tRNA首先必须与延伸因子EFTUGTP结合。延伸因子EFTU是一个GTP结合蛋白，参与氨酰RNA的就位。氨酰RNA入位后，EFTUGTP水解，EFTUGDP从核糖体上释放下来，在第二个延伸因子EFTs帮助下EFTuGDP释放掉GDP并重新结合一分子GTP再生成EFTuGTP。2、肽键形成（转肽）肽键形成（转肽）肽键是在肽酰转移酶催化下形成的。现在认为肽酰转移酶活性存在于50S亚基23SrRNA上。驱动肽键形成的能量由P位点上的氨基酸与它的tRNA的高能肽酰酯键提供。新肽键形成后P位点卸载的tRNA就离开核糖体。嘌呤霉素抑制肽键形成3、核糖体移位。核糖体移位。移位需要另一个GTP结合蛋白EFG（延伸因子，又叫移位酶）的参与。现在认为，GTP水解成GDP时释放出的能量促使核糖体构象发生变化，驱动肽酰tRNA从位点移动到位点。移位后造成核糖体位点空下，等待接纳下一个氨酰tRNA。(三三)、终止终止当终止密码子（UAA,UAG,UGA）进入位点时肽链合成就进入终止期。原核生物有三个释放因子（RF-1,RF-2,RF-3）参与终止。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA与UGA,RF3作用尚不清楚，可能促进RF1与RF2结合。识别过程需要GTP，并改变了核糖体的构象，使肽酰转移酶的功能发生瞬时变化，转变成酯酶功能，将连接肽链与P位点tRNA的肽酰酯键水解开，肽链从核糖体上释放，mRNA与tRNA解离，核糖体解体。原核生物蛋白质合成中的能量计算（合成一个二肽）合成二肽需8个高能键，其后每加一个a.a需4个高能键。例：合成200个a.a残基的多肽：8+1984=8004n=4200=800ATPA（GTP）高能键甲酰-甲硫氨酰-tRNA合成ATP-AMP2起始（IF-2）GTP-GDP1第二个a.a-tRNA合成ATP-AMP2第二个a.a-tRNA进入核糖体（EF-TU）GTP-GDP1核糖体移位（EF-G）GTP-GDP1终止（？）GTP-GDP1(四四)、原核生物的翻译后加工原核生物的翻译后加工一些新生肽链从核糖体上释放下来后可以直接折叠成最终的三维结构。但多数情况下是新生肽要经过一系列的加工修饰，才具有功能。1、切除加工切除加工包括去掉N端的甲酰甲硫氨酸和信号肽序列。信号肽（Signalpeptide），也叫引导肽（leaderpeptide），是决定多肽最终去向的一段序列，通常较短，典型情况下位于N端。在细菌中的一个例子就是多肽要插入细胞质膜必须借助信号肽序列。2、糖基化糖基化尽管在原核生物中，绝大多数的复合糖是糖酯，但 是，也 有 少 量 的 糖 蛋 白 的 报 道，例 如Halobacterium细胞表面的糖蛋白，有关原核生物糖基化的机制及其功能都还不知道。3、甲基化甲基化甲基转移酶利用硫酰苷甲硫氨酸对特定蛋白进行甲基化修饰。在大肠杆菌和有关细菌中发现的一种甲基转移酶能甲基化膜结合的化学受体蛋白的谷氨酸残基。这种甲基转移酶和另外一种甲基酯酶催化的甲基化/去甲基化过程在细菌趋化性的信号转导中起重要作用。4、磷酸化磷酸化近年来，已经发现由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶催化的蛋白质磷酸化/去磷酸化在原核生物中十分普遍。磷酸化/去磷酸化的意义还不太清楚。目前只知在细菌趋化性和氮代谢调空中有瞬间的磷酸化作用。(五五)、原核生物的翻译调控原核生物的翻译调控蛋白质的合成是一个非常耗能的过程。每形成一个肽键要消耗4个高能磷酸键（tRNA装载2个，aa-tRNA入位1个，移位1个）。在大肠杆菌中，用于合成的能量90%都给了蛋白质合成。因此，其合成必然要受到严格的调控。1、原原核核生生物物中中，蛋蛋白白质质合合成成的的调调控控多多在在转转录录的的水水平平上（操纵子模型）进行上（操纵子模型）进行。因为：（1）转录与翻译直接偶联，转录后不久就开始翻译，（2）原核生物mRNA的半衰期很短，大约13分钟，随着环境条件的改变，细胞内产生的mRNA种类会迅速改变。2、mRNA翻译速率也是调控位点。翻译速率也是调控位点。翻译速率的调控大多是由于SD序列的差异造成翻译起始效率的不同。因为SD帮助识别AUG和启动翻译的起始，因此SD序列的变化能影响翻译的起始效率从而调控了mRNA的翻译速率。乳糖将纵子产物Z基因产物：-半乳糖苷酶1Y基因产物：半乳糖透过酶0.5A基因产物：半乳糖乙酰化酶0.2乳糖操纵子的基因产物有3个：它们的翻译量是不等的。3、相相对对过过剩剩的的蛋蛋白白质质翻翻译译产产物物对对自自身身多多顺顺贩贩子子mRNA翻译的负调控。翻译的负调控。多顺贩子mRNA的其中一个产物相对过剩时能抑制整个多顺贩子mRNA的翻译。原核的55种核糖体蛋白由20个操纵子编码。细菌的良好生长要求这些蛋白质的合成之间及其与rRNA的合成之间协调起来。例如PL11操纵子编码核糖体蛋白L1和L11，如果L1相对过剩就会占用了可利用的23SrRNA，结果抑制PL11mRNA的翻译。在23SrRNA缺乏的情况下，L1蛋白也会结合在PL11mRNA的5端抑制自身操纵子的翻译。结论：结论：（1）原核生物蛋白质的合成相对较快，它需要起始因子IF-1、IF-2、I-3，延伸因子EF-TU、EF-TS、EF-G，释放因子RF-1、RF-2、RF-3的参与。（2）尽管原核生物基因的表达多在转录水平上进行调控，但翻译水平上的调控也时有发生，包括SD序列对翻译起始的调控和相对过剩的翻译产物对自身多顺反子mRNA翻译的负调控等。三、三、真核生物的蛋白质合成真核生物的蛋白质合成真核细胞的蛋白质翻译需要大量的蛋白因子，翻译后加工和定向输送比原核复杂得多。(一一)、翻译起始翻译起始真核的翻译起始比原核更复杂，因为：（1）真核mRNA的二级结构更为多样和复杂（2）真核mRNA是经过多重加工的，它被转录后首先要经过各种加工才能从细胞核进入细胞质中，并形成各种各样的二级结构。一些mRNA与几种类型的蛋白质结合在一起形成一种复杂的颗粒状，有时称核糖核蛋白粒（ribonucleoproteinparticle）,在翻译之前，它的二级结构必须改变，其中的蛋白质必须被去掉。（3）核糖体需要扫描mRNA以寻找翻译起始位点真核mRNA没有SD序列来帮助识别翻译起点，因此核糖体要扫描每一个mRNA。核糖体结合到mRNA的5端的帽子结构并向3端移动一寻找起始位点。这种扫描过程很复杂，知之甚少，真核的翻译起始用到的起始因子（eIF）至少有9种，多数的功能仍需进步研究。（1）40S小小亚亚基基-(eIF-3)结结合合到到(eIF-2-GTP)-Met-tRNAi复复合合物物上上形形成成40S前前起起始始复复合合物物（40Spreinitiationcomplex）（2）mRNA结结合合到到40S前前起起始始复合物上形成复合物上形成40S起始复合物。起始复合物。（3）40S起起 始始 复复 合合 物物 扫扫 描描mRNA寻寻找找适适当当的的起起始始密密码码子子（通常是（通常是5端附近的端附近的AUG）。）。（4）40S复复合合物物与与60S大大亚亚基基结合形成结合形成80S起始复合物。起始复合物。(二二)、延伸延伸与原核类似，也可分为aa-tRNA的入位、转肽、核糖体移位三步反应。(二二)、延伸延伸与原核类似，也可分为aa-tRNA的入位、转肽、核糖体移位三步反应。1、入位入位50kD的延伸因子eEF-1-GTP与aa-tRNA结合，引导aa-tRNA进入A位点。aa-tRNA的反密码子与mRNA的密码子正确配对后eEF-1-GTP水解掉一个P，随后eEF-1-GDP离开核糖体，留下aa-tRNA。在eEF-1、eEF-1的帮助下，eEF-1-GDP再生为eEF-1-GTP。在真菌（如酵母）中，需要另一个延伸因子eEF-3与eEF-1共同引导aa-tRNA的入位。2、肽键形成（转肽）肽键形成（转肽）核糖体大亚基的肽酰转移酶活性催化A位点-氨基亲核攻击P位点的aa的羧基，在A位点形成一个新的肽键。P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开3、核糖体移位核糖体移位移位需要一个100kD的延伸因子eEF-2-GTP。eEF-2-GTP结合在核糖体未知的位置上，GTP水解成释放的能量使核糖体沿mRNA移动一个密码子的位置，然后eEF-2-GDP离开核糖体。(三三)、终止终止真核细胞中有两个释放因子eRF-1和eRF-3（GTP结合蛋白）介导终止。当GTP结合到eRF-3后它的GTPase活性就被激活，eRF-1和eRF-3-GTP形成一个复合物，当UAG，UGA，UAA进入A位点时，该复合物就结合到A位点上，接着GTP水解促使释放因子离开核糖体，mRNA被释放，核糖体解体成大小亚基，新生肽在肽酰转移酶催化下被释放。真核生物蛋白质合成中的能量计算（合成一个二肽）合成二肽需10个高能键，其后每加一个a.a需4个高能键。例：合成200个a.a残基的多肽：10+1984=802（4n+2）=4200+2=802ATP（GTP）高能键甲硫氨酰-tRNA合成ATP-AMP2起始（IF-2）2GTP-GDPATP-ADP3第二个a.a-tRNA合成ATP-AMP2第 二 个 a.a-tRNA进 入 核 糖 体（eEF-1-GTP）GTP-GDP1核糖体移位（eEF-2-GTP）GTP-GDP1终止（eRF-3-GTP）GTP-GDP1(四四)、真核生物的翻译后加工真核生物的翻译后加工许多真核生物的新生肽都要经过翻译后加工或修饰，这种加工修饰可以发生正延伸着的肽链中和翻译后。一般情况下，翻译后修饰一是为了功能上的需要，另一种情况是折叠成天然构象的需要。1、切除加工切除加工典型的情况包括切除N-端甲硫氨酸、信号肽序列和切除部分肽段将无活性的前体转变成活性形式。一些酶的前体（称为前体酶proenzyme，或酶原zymegen）或无活性的多肽前体（称为前体蛋白，proprotein）只有切除特定的肽段后才能从无活性形式转变成活性形式。图是胰岛素的翻译后加工包含信号肽的胰岛素前体称为前胰岛素原（pre-proinsulin）。去掉信号肽的胰岛素的前体称为胰岛素原(proinsulin)。进一步切除称为C链的肽段后才能形成活性形式的胰岛素（insulin）2、糖基化糖基化真核生物中糖基化修饰很普遍。通常情况下，分泌蛋白的寡糖链较复杂，而内质网膜蛋白含有较高的甘露糖。3、羟基化羟基化在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中pro和lys是经过羟基化的。此外，在乙酰胆碱酯酶（降解神经递质乙酰胆碱）和补体系统（参与免疫反应的一系列血清蛋白）都发现有4-羟辅氨酸。4、磷酸化磷酸化蛋白磷酸化参与代谢调控和信号转导以及蛋白与蛋白之间的相互作用。例如，PDGF受体的酪氨酸残基经过自身磷酸化后才与细胞质定位蛋白质结合。5、亲脂修饰亲脂修饰最常见的亲脂修饰是酰化和异戊二烯化。豆蔻酰化却是最常见的酰化形式之一。N-豆蔻酰化（豆蔻酸以酰酰氨键形式共价连在肽链N端的残基上）能增加特定G蛋白的亚基对膜结合的、亚基的亲和力。蛋白质亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白与蛋白之间的相互作用。6、甲基化甲基化通过甲基转移酶进行。天冬氨酸的甲基化能促进已破坏蛋白的修复或降解。在2，3-二磷酸核酮糖羧化酶（rihilose-2,3-biosphosphatecarboxylase）、钙 调 蛋 白（calmodulin）、组氨酸（histone）、某些核糖体蛋白和细胞色素C中都有甲基化的赖氨酸残基。其它可甲基化的氨基酸残基还有His（如组蛋白、视紫红质、eEF-2）、Arg（如休克蛋白、核糖体蛋白）。7、二硫键形成二硫键形成二硫键通常只发现于分泌蛋白（如胰岛素）和某些膜蛋白中，在细胞质中由于有各种还原性物质（如 谷 胱 甘 肽 glutathione和 硫 氧 还 蛋 白thioredoxin）所以细胞质蛋白没有二硫键。因为内质网腔是一个非还原性环境，所以粗糙内质网上的新生肽只暂时形成二硫键。当新生肽进入内质网腔时，一些肽链可能会按氨基酸次序依次暂时形成二硫键，但最终会通过交换二硫键位置的形式形成正确的结构，内质网中可能还有一种二硫键异构酶（disulfideisomerase）催化该过程。(五五)、真核生物的翻译调控真核生物的翻译调控1、mRNA向细胞质的运输向细胞质的运输核膜创造的转录与翻译的隔离为基因的表达提供了一个重要的调控机会。mRNA的加工（内含子切除）、mRNA向细胞质的运输都是调控位点。mRNA向细胞质的运输是一个受到严格控制的过程，至少需要mRNA5端的帽子和3端的polyA尾巴。2、mRNA的稳定性的稳定性mRNA的半衰期从20分钟到24小时。在mRNA上有一些去稳定序列（destablizationsequence）,它们的二级结构是核酸酶的底物，也有些稳定序列（stablizationsequence）。特定蛋白与mRNA上特定序列的结合能影响它的稳定性。3端的腺苷化和去腺苷化会影响它的稳定性和翻译活性。在核中，mRNA被加工后运输到细胞质时含有100200个polyA尾巴，当polyA缩减到30个以下时整个mRNA就会被降解。在特定条件下polyA能被选择型地延长或缩短。3、翻译的负调控翻译的负调控一些阻遏蛋白能结合在特定mRNA的5端阻止翻译的进行，如铁蛋白的合成。铁蛋白是储铁的蛋白，主要发现于肝细胞中。铁蛋白mRNA上有铁应答元件（IRE），阻遏蛋白可以结合在上边，当细胞中铁浓度高时，那么大量的铁原子就结合到阻遏蛋白上，使它从IRE上解离，铁蛋白mRNA就可以被翻译。4、起始因子磷酸化。起始因子磷酸化。当遭遇热休克、病毒感染、生长因子缺乏等逆境时，真核细胞eIF-2就发生磷酸化，大部分蛋白质的合成降低，而一些hsp核其它蛋白的翻译增强，以应付热休克和其他胁迫条件，但其机理还不清楚。5、translationalframeshifting一些mRNA似乎含有结构信息，在阅读框内可以从+1或-1出开始阅读，结果翻译出两条或多条多肽。这种情况常见于被反转录病毒感染的细胞内。(6)真核生物双功能mRNA极少数真核mRNA上，可能从两个不同AUG起始合成蛋白质。若两个AUG属于同一阅读框，则形成两个长短不同的蛋白质，其中有部分多肽完全相同。若两个AUG处于不同的阅读框中，则合成两个序列完全不同的蛋白质。一条mRNA可合成两种蛋白质，称双功能mRNA。(7)只有最后一个终止密码子的多基因mRNA的翻译。真核生物的泛素蛋白基因。酵母有5个泛素基因，重复组成基因簇。人类有9个。每个基因编码76个a.a的泛素。泛素羧端水解酶可识别泛素的空间构象，当翻译进行到一个单位出来后，泛素的控间构象形成，这种酶可切下泛素单位。8、蛋白质的选择性降解四、四、蛋白质合成后的定向转运蛋白质合成后的定向转运由于真核细胞的结构和功能很复杂，所以 蛋 白 质 合 成 后 的 定 向 转 运（targeting,translocation）的机制也很复杂。转录本的区隔化细胞质中蛋白质的分布是不对称的，如果蝇卵中的bicoid（对果蝇发育中的基因表达起调控作用），果 蝇 头 部 的 正 常 发 育（如 头 节）需 要 卵 头 部（anterior）高浓度的bicoid，卵尾部低浓度的bicoid促进果蝇尾部的发育。将第一个卵的尾部细胞质取出并替掉第二个卵的头部，那么由受体卵发育出的幼虫就有两个尾部。现在认为细胞质中蛋白质的梯度是由转录本的取隔化造成的。所谓转录本的区隔化就是特定mRNA与细胞质中特定位点的受体结合。bicoidmRNA是从附近的nurse细胞进入正发育的卵母细胞中，一旦进入卵母细胞，bicoidmRNA通过其3端与顶部细胞骨架的特定组分结合。当成熟的卵发育时，bicoidmRNA的翻译（与bicoid蛋白的扩散偶连）就造成了bicoid蛋白的浓度梯度。多肽的两种转运机制：（1）翻译转运同步机制（）翻译转运同步机制（cotranslationaltransfer）分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质网和高尔基体滞留蛋白等。首先在游离核糖体上合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后，部分多肽以芽泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。（2）翻翻 译译 后后 转转 运运 机机 制制（posttranslationaltranslocation）叶绿体蛋白和线粒体蛋白。在细胞质游离核糖体上被完全合成后通过新生肽的信号序列（引导肽Leaderpeptide）直接运往目的地并被加工。(一一)、信号肽信号肽:翻译转运同步机制翻译转运同步机制信号肽是GunterBlobel1975年提出的，用以解释多肽向内质网的跨膜转运。含信号肽的多肽进入内质网的过程：当包含信号肽的多肽被合成一部分时，信号肽识别体（SRP）就识别信号肽并结合到核糖体上，翻译暂时停止，SRP与内质网膜上的受体（停泊蛋白，dockingprotein）结合，核糖体与内质网结合，SRP离开，延伸的肽链通过内质网上的肽移位装置（translocon）进入内质网，信号肽被切除。新生肽的命运就取决于信号肽和其他的信号序列。对于分泌蛋白来说，跨膜转运后要切除N端信号肽，多肽进入内质网腔，此后还要在高尔基体进行下一步的修饰加工。跨膜蛋白转运的起始阶段与分泌蛋白类似，N端的信号肽作为起始信号结合在膜上，多肽链的其余部分线形穿过膜。单跨膜蛋白（singlepassmembraneprotein）有一个终止转运信号（stoptransfersignal）,它阻止后续肽段的继续穿膜（图18.14B），多跨膜蛋白有一系列交替出现的起始和终止信号（图18.14C）。被转运到内质网中的多肽多数还要运往它处。经过初步的翻译后修饰，可溶性蛋白和膜结合蛋白被运输到高尔基体，这种运输是经过运输泡进行的（图18.15），滞留内质网中的蛋白有滞留信号，在许多脊椎动物中它是C端的四肽：Lys-Asp-Glu-Leu（简称KDEL）。在高尔基体中，多肽进一步被修饰，如N-糖苷键型寡糖链进一步被处理，特定Ser和Thr残基进行O-糖苷键型糖基化修饰。溶酶体蛋白添加一个6-磷酸甘露糖残基后被运往溶酶体。现在还不清楚下一步有什么信号指导分泌蛋白运往细胞表面（经过胞外分泌，exocytosis），什么信号指导质膜蛋白的运输，有人提出一种默认机制（缺省机制，defaultmechanism）：在缺失指导信号的情况下的一个特定的顺序事件。信号肽：P412信号识别体：P412(二二)、翻翻译译后后转转运运机机制制（posttranslationaltranslocation）线粒体和叶绿体蛋白是在细胞质游离核糖体上完全合成后运输来的，同样，这种运输也需要信号序列。图18.16是细胞色素C1向线粒体的运输。细胞色素C1合成要被转运到线粒体的内膜空间（它是ETC复合物的一个组分），细胞色素C1的转运需要两个序列（N端），第一个指导它运往线粒体基后质被切除，第二个指导它运往内膜空间后被切除，细胞色素C1肽链折叠并结合一个血红素辅基后与内膜上的复合物结合。Uptakeofproteinsintothemitochondrialmatrix六、六、蛋白质的折叠蛋白质的折叠蛋白质的一级结构和它的三维构象以及生物功能的直接关系一直是现代生物化学研究的重点。这方面的一个重要的经典的范例是Christuian Anfinsen 在1950年后期做的一系列实验（1972年获得诺贝尔化学奖）。图18.17变性的牛胰RNase在适当的条件下能重新折叠成天然的生物活性的状态。这暗示如果多肽的aa的物理、化学性质以及驱动折叠过程的力（如键的旋转、自由能氨基酸在多水环境中的特性）都已知的情况下应该可以预测一个蛋白的三维结构，然而尽管用尽各种先进的技术，进展仍然缓慢。总的说来，蛋白质的折叠是一个楼梯式的（stepwise）过程，在这个过程中，二级结构的形成是早期的特征，疏水作用似乎是很重要的驱动力。因为表面氨基酸残基的替代很少影响蛋白质的结构和构象，相反，疏水核中氨基酸残基的替代常常导致严重的结构变化。传统的蛋白质折叠模式（仅仅靠氨基酸残基侧链之间的相互作用驱使蛋白质折叠成最终的形式）有很大的不可解释性：（1）时间性。蛋白质的合成通常只需要几秒到几分钟，如果一个新生肽要尝试完各种可能的构象直到最稳定的构象，那么计算一下每个键旋转到最终的生物活性形式所用的时间至少要用年来衡量，甚至是一个天文数字。（2）复杂性如果基于物理数据（如键角、旋转的角度）来折叠，那么要计算折叠的数学模型显然太复杂了，在这么短的时间内完成这么快、这么精巧的一个过程似乎不可能。近年来，已经确定，生活细胞中蛋白质的折叠和转运是在分子伴侣的帮助下进行的。其中大部分是hsp。它存在于所有的生物中，从细菌到高等动植物已发现了几种类型的分子伴侣。此外，它们还存在于原核性质的细胞器中，如线粒体、叶绿体和内质网。到目前为止发现所有的分子伴侣在序列同源性上都很高。图18.18分子伴侣在蛋白折叠方面的作用表现在两方面：（1）从多肽开始合成到折叠的这段时间里，分子伴侣可以保护多肽链不受其他蛋白的攻击，一些线粒体和叶绿体蛋白在插入细胞器膜之前必须保持未折叠状态。（2）帮助蛋白质正确快速地折叠或组装成多亚基蛋白。在蛋白质折叠中有两类分子伴侣：（1）Hsp70s。Hsp70s是在折叠的早期阶段起作用的分子伴侣家族。大量的Hsp70s。大量的Hsp70s单体结合在未折叠的疏水的正延伸肽段上。每一个Hsp70s有两个结合位点：未折叠多肽结合位点和ATP结合位点。多肽从Hsp70s上释放需要能量。内质网的Hsp70s还是多肽跨膜转运所必须的。（2）Hsp60s。一旦未折叠的多肽从Hsp70s上被释放，它就结合到一些Hsp60s上（也称chaparonins,cpn60s）。Hsp60s形成一个巨大的桶状结构，它有两个盖，位折叠蛋白进入桶中，Hsp60s帮助它形成正确的结构。分子伴侣还能帮助因各种胁迫而部分去折叠蛋白的重新折叠，如果不能重新折叠的话，分子伴侣就促进它的降解。本章要点mRNA上密码子与tRNA上反密码子的碱基配对是遗传信息翻译的基本机制。翻译包括三个阶段：起始、延伸、终止。每个阶段都有相应的翻译因子的参与。蛋白质合成后还要一系列的翻译后修饰、折叠和定向转运。翻译后修饰包括切除、共价修饰、插入辅因子。真核与原核的翻译后调控不同，原核有SD序列调控和翻译的自身负调控，真核较复。蛋白质的折叠可以发生在肽链合成中或合成后，它是在分子伴侣的作用下进行。本章问题1.不同生物间rRNA和核糖体蛋白的三维结构极其相似，为什么？2.遗传密码的特性3.怎样理解氨酰tRNA合成酶的作用是第二遗传密码？4.叙述发生在氨酰tRNA合成酶上的两个反映5.氨酰tRNA合成酶有时也会出错，它是如何检测和校正的？6.叙述蛋白质合成三个阶段的主要事件7.翻译因子在原核和真核的翻译过程中个起什么功能？8.写出下列多肽的密码子，有几种可能？9.判断下列过程发生在蛋白质合成的哪个阶段/A核糖体亚基与mRNA结合B多肽被正确合成C核糖体沿着mRNA移动D核糖体解离成亚基10.估计一下合成200个AA需要多少个ATP和GTP？11.翻译因子中GTP的作用12.原核和真核翻译的主要区别13.举例说明翻译后修饰的意义14.SD序列和30S亚基的配对为原核提供了识别起始密码子和Met密码子的机制，那么真核如何办呢？15.每一个延伸循环的三步反应16.原核与真核翻译调控的主要区别17.描述SRP的结构和功能18.描述translocon在共翻译转运中的作用19.mRNA的结构如何影响翻译的调控20.假设一个典型的分泌蛋白要被分泌到胞外，描述一下细胞内的加工过程。21.要用一个多肽的一级结构来预测它的高级结构，主要的困难和问题在那里？22.叙述分子伴侣在蛋白质折叠中的作用。23.多核糖体：一条mRNA上同时有多个核糖体与之结合，它们以不同进度进行多肽连的合成。24遗传密码如何编码？有那些特点？mRNA上每三个相邻的核苷酸编成一个密码子，代表肽链合成种的某种氨基酸或合成的起始和终止信号，4种核苷酸共组成64种密码子。特点：方向性；编码方向：mRNA的5到3连续性：密码子之间连续排列，即无间隔也无重叠。兼并性：除了Met、Trp只有一个密码子之外，其余每种氨基酸都有26个密码子摆动性：在密码子与反密码子相互识别的过程种，密码子的第一个核苷酸起决定性的作用，第二个尤其是第三个核苷酸能在一定的范围内进行变动。通用性：不同生物功用一套密码。25保证准确翻译的关键是什么？氨基酸与tRNA的特异性结合依靠氨酰tRNA合成酶的特异识别作用。密码子与反密码子特异结合，依靠互补碱基配对结合实现，也有赖于核糖体的构象正常而实现正常的装配功能。