蛋白质工程在医药工业中的应用课件

蛋白质工程在医药工业中的应用第一节抗体工程抗体(antibody)是抗原刺激人或动物机体的免疫系统后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的、能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体可与细菌、病毒或毒素等抗原结合，并通过特定的方式清除异物。第一节抗体工程抗体工程(antibody engineering)是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。抗体的分类根据抗体的制备方法和技术，将抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三类。抗体的分类多克隆抗体：传统的抗体制备的方法是将天然抗原经过各种途径免疫动物，因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以刺激机体产生了多种B细胞克隆针对不同抗原决定簇产生的混合抗体，并合成和分泌各抗体到血清和体液中，这种用体内免疫法所获得的免疫血清。单克隆抗体单克隆抗体当当抗抗原原进进入入体体内内，在在机机体体中中就就会会诱诱导导出出针针对对不不同同抗抗原原决决定定簇簇的的多多种种抗抗体体，如如果果要要把把这这些些抗抗体体一一一一分分开开，用用现现有有的的生生物物化化学学或或物物理理化化学学方方法法是是根根本本办办不不到到的的。1975年年科科勒勒和和米米尔尔斯斯坦坦将将小小鼠鼠免免疫疫细细胞胞与与肿肿瘤瘤细细胞胞融融合合，培培养养出出既既能能迅迅速速生生长长繁繁殖殖又又可可分分泌泌特特异异性性抗抗体体的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞。从从而而获获得得针针对对某某一一特特殊殊抗抗原原决决定定簇簇的的单单克克隆隆抗抗体。体。6南京农业大学 生命科学学院抗体的分类单克隆抗体：同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记及生物学特性等方面都完全相同的均一性抗体。克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。2 鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点:可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强分子小，穿透力强;不含不含FcFc，没有，没有FcFc带来的效应带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。酶标抗体等。3 3 小分子抗体小分子抗体FvFvScFvScFv单区抗体单区抗体最小识别单位最小识别单位FabFab 由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv 或 ScFv FvScFv连接肽连接肽连接肽连接肽 Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)单域抗体VH 约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。(4)最小识别单位CDR4 4 双特异抗体和多价抗体双特异抗体和多价抗体双链抗体双链抗体 （DiabodyDiabody）一词最早由）一词最早由HollingerHollinger等于等于19931993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。Hollinger等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特异性抗体。所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。PCR技术;免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达;噬菌体表面展示文库技术。5 5 抗体库技术抗体库技术 初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P 或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术 19901990年年Mc CaffertyMc Cafferty等成功地建立了等成功地建立了噬菌体表面展示系噬菌体表面展示系统统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fdfd噬菌体基因噬菌体基因3 3的下游，使的下游，使ScFvScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达用亲和层析，两轮富集达10106 6倍。该技术的成功给抗体基倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phage surface display systemphage surface display system)噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N N端端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3 g3或或g8 g8 的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后，转入大肠杆菌，切除后，转入大肠杆菌，该项技术的优点:将将抗体的基因型和表型紧密联系抗体的基因型和表型紧密联系起来起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。激素、酶、药物、随机多肽等的生产。噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。