散射光和拉曼光的影响及消除课件

3 3散射光和拉曼光的影响及消除散射光和拉曼光的影响及消除 n蕾莱（瑞利）（蕾莱（瑞利）（Rayleigh scattering Rayleigh scattering lightlight）散射光）散射光光子和物质分子碰撞时，未发生能量交换，仅运动方向发生改变，其波长和入射光波长相同，这种散射光叫做瑞利散色光。n发射光波长与激发光波几乎相等。由溶剂、容器、胶体等散射引起，距离荧光峰较远，只要选择适当的波长，由单色器消除。3散射光和拉曼光的影响及消除 蕾莱（瑞利）（Rayleig13 3散射光和拉曼光的影响及消除散射光和拉曼光的影响及消除n拉曼散射光拉曼散射光Raman scattering Raman scattering light)light)光子和物质分子碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，将部分能量转给物质分子或从物质分子得到能量，均使光子能量发生改变。前者使光子能量减少，波长比入射光更长；后者使光子能量增加，波长比入射光要短，这两种光均称为拉曼散色光。n发射光波长与荧光波长相近，即与荧光峰靠近，难区别。由空白溶剂产生。3散射光和拉曼光的影响及消除拉曼散射光Raman scat23 3散射光和拉曼光的影响及消除散射光和拉曼光的影响及消除n消除方法消除方法：因为荧光波长不随激发光的改变而改变，而拉曼散射光随激发光改变而改变，所以，只要采用波长较短的激发光进行激发，就可避免干扰。n例如，硫酸喹啉及其溶剂（硫酸溶液）在不同波长激发下的散射光。3散射光和拉曼光的影响及消除消除方法：因为荧光波长不随激发33 3散射光和拉曼光的影响及消除散射光和拉曼光的影响及消除350荧光荧光448448350拉曼拉曼400400320拉曼拉曼360360320荧光荧光448448拉曼拉曼360360溶剂溶剂的激发光谱的激发光谱,拉拉曼散射曼散射硫酸喹啉及其溶剂（硫酸溶液）在不同波长激发下的光谱。320nm激发激发350nm激发激发3散射光和拉曼光的影响及消除350荧光448350拉曼4043 3散射光和拉曼光的影响及消除散射光和拉曼光的影响及消除n硫酸喹啉分别用320nm，350nm激发时的荧光光谱。n320nm激发，拉曼光在360nm，对荧光（448nm）无影响；350nm激发，拉曼光在400nm，与荧光（448nm）叠加，产生干扰。因此，采用波长较短的激发光采用波长较短的激发光（320nm）进行激发，就可避免拉曼光的进行激发，就可避免拉曼光的干扰。干扰。3散射光和拉曼光的影响及消除硫酸喹啉分别用320nm，355第二节第二节 分子荧光光谱仪分子荧光光谱仪 荧光计、荧光分光光度计基本结构相似。仪仪器器基基本本结结构构 由激发光光源源、样样品品池池、用于选择激发光波长和荧光波长的单单色色器器、检测器检测器及记录仪记录仪组成。第二节 分子荧光光谱仪 荧光计、荧光分光光度计基本结构相似6荧光光谱仪荧光光谱仪激发单色器激发单色器或滤光片或滤光片记录仪发射单色器发射单色器或滤光片或滤光片荧光荧光光源光源激发激发样品池样品池检测器检测器荧光光谱仪激发单色器记录仪发射单色器荧光光源激发样品池检测器7仪器测量基本原理仪器测量基本原理 n由光源发射的光经激发单色器激发单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。可以在溶液的各个方向观察到荧光，但由于激发光一部分可透过溶液，为了消为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行光成直角的方向上进行。n为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了发射单色发射单色器器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。n注意荧光测量方向。注意荧光测量方向。仪器测量基本原理 由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发光81.1.光源光源 在紫外-可见区范围，通常的光源是荧光计用溴钨灯或高压汞灯。荧光分光光度计用氙弧灯，连续光源，可用于200700nm，在300400nm光谱强度几乎相等。新型激发光源：高功率连续可调染料激光光源激光光源。1.光源 在紫外-可见区范围，通常的光源是荧光计92.2.单色器单色器 激发单色器激发单色器（第一单色器）（第一单色器）在光源和样品池之间，滤去非特征波长的激发光。发射单色器发射单色器（第二单色器）（第二单色器）在样品池和检测器之间设置，为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，。荧光计用滤光片作单色器，分光能力差。荧光分光光度计用棱镜或光栅作单色器，分光能力强。2.单色器 激发单色器（第一单色器）在光源和样品池之间，103.3.样品池样品池n荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，四面透光四面透光，通常用石英石英，形状以方形和长方形为宜。3.样品池114.4.检测器检测器n荧光计用光电池或光电管，荧光分光光度计用光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。4.检测器12第三节 分子荧光光谱法的应用一、定性分析一、定性分析二、定量分析二、定量分析三、其他应用三、其他应用第三节 分子荧光光谱法的应用一、定性分析13分析方法的特点分析方法的特点n 灵敏度高灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之间。比UV-Vis的灵敏度高得多！WHY？n 选择性好选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。n 试样量少和方法简单n结结构构信信息息量量多多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。n 应用不广泛应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。分析方法的特点 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.14一、定性分析一、定性分析n任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱激发光谱与发射光谱发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。n定性鉴定物质的可靠性较紫外可见光谱更强，但定性必须有标准物质在同样条件下对照。一、定性分析任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射15二、定量分析n荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。nIf =Ian 式中为荧光量子效率，又根据Beer定律nIa=I0-I=I0(1-10-b C)n I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 1 1荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系二、定量分析荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率161 1荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系nIf=I0(1-10-b c)nI If =f =I0(1-e-2.303bc)nTaylor展开：n当当 lclc 0.050.05时，时，I If f=2.303I=2.303I0 0 bcbcn当入射光强度当入射光强度I I0 0 和和b b一定时一定时，上式为：If=kc1荧光强度与溶液浓度的关系If=I0(1-10 171 1荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系n即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，作为荧光定量分析的依据。n但这种线性关系只有在极稀的溶液极稀的溶液中，当当 bcbc 0.050.05时才成立时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。nI If f =2.3032.303II0 0 bcbcn提高入射光强度提高入射光强度I I0 0，有利于提高灵敏度，有利于提高灵敏度，改变量子产率改变量子产率，有利于提高灵敏度；当，有利于提高灵敏度；当增加，荧光强度增加，荧光强度I If f增加增加。1荧光强度与溶液浓度的关系即荧光强度与荧光物质的浓度成之181 1荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系n对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。这种弯曲，随着样品池厚度的增加而出现得更早。1荧光强度与溶液浓度的关系对于较浓溶液，由于猝灭现象和自19荧光光度法的灵敏度比紫外可见荧光光度法的灵敏度比紫外可见光度法高的原因光度法高的原因（1）增大光源强度，可提高荧光测定的灵敏度，而不能提高紫外-可见分光光度法的灵敏度；（2）荧光光度法直接测定发射荧光的强度，荧光强度大，信号强；而紫外可见光度法测定吸收光前后的强度变化（吸光度），信号弱。荧光光度法的灵敏度比紫外可见光度法高的原因（1）增大光源强度20荧光光度法的选择性比紫外可见荧光光度法的选择性比紫外可见光度法高的原因光度法高的原因荧光光谱有激发光谱和发射光谱。能吸收光的物质不一定都能发荧光；不同物质吸收某一相同波长的光后所发射的荧光波长也不尽相同。荧光光度法的选择性比紫外可见光度法高的原因荧光光谱有激发光谱21标准荧光物质标准荧光物质作荧光强度测量时，标准荧光物质的作用是作荧光强度测量时，标准荧光物质的作用是什么？如何进行测量的？什么？如何进行测量的？答：作荧光强度测量时，标准荧光物质的作用是校正仪器，用标准荧光物质把仪器读数定位到某个值，以此为标准，测定空白溶液、标准溶液及样品溶液的（相对）荧（相对）荧光强度光强度，使标准样和样品溶液有一较好的读数。标准荧光物质作荧光强度测量时，标准荧光物质的作用是什么？如何222.2.单组分的荧光直接测定和间接测单组分的荧光直接测定和间接测定定 直接测定直接测定：被测物发荧光间接测定间接测定：利用化学反应使非荧光物质转变为能用于测定的荧光物质；荧光猝灭法荧光猝灭法，利用某物质使荧光化合物的荧光降低来进行测定。如对氟、硫、铁、银等的测定。2.单组分的荧光直接测定和间接测定 直接测定：被测物发荧光23应用于应用于n无机化合物n有机化合物定量方法定量方法：当当 lclc 0.050.05时，时，I If f=2.303I=2.303I0 0 bcbcn当入射光强度当入射光强度I I0 0 和和b b一定时一定时，上式为：If=kc标准曲线法、直接比较法标准曲线法、直接比较法求出被测物浓度求出被测物浓度。2.2.单组分的荧光直接测定和间接单组分的荧光直接测定和间接测定测定 应用于2.单组分的荧光直接测定和间接测定 243.3.多组分的荧光测定多组分的荧光测定n由于有激发和发射波长可分别选择，因此选择性也较好，方法灵敏度比吸收光度法高13数量级。3.多组分的荧光测定由于有激发和发射波长可分别选择，因此选择25三、其他应用（自学）激光诱导荧光分析法激光诱导荧光分析法具有超高灵敏度，可应用于生物大分子的分析。1.溶液中单分子行为的研究2.基因研究及检测三、其他应用（自学）激光诱导荧光分析法具有超高灵敏度，可应用26第四节 磷光光谱法与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1 1）磷光辐射的波长比荧光长）磷光辐射的波长比荧光长 分子的T1态能量比S1态低。（2 2）磷光的寿命比荧光长）磷光的寿命比荧光长 由于荧光是S1 S0跃迁产生的，这种跃迁是自旋许可的跃迁，因而S1态的辐射寿命通常在10-7 10-9s，磷光是T1 S0跃迁产生的，这种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射寿命要长，大约为10-4 10s，（3 3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感。子敏感。第四节 磷光光谱法与荧光相比，磷光具有如下三个特点：27一、低温磷光 n低温磷光分析中，液氮液氮是最常用的合适是最常用的合适的的冷却剂冷却剂。因此要求所使用的溶剂，在液氮温度（77K）下应具有足够的粘度粘度并能形成透明的刚性玻璃体形成透明的刚性玻璃体，对所分析的试样应具有良好的溶解特性良好的溶解特性。试样的刚性可减少磷光的碰撞猝灭。一、低温磷光 低温磷光分析中，液氮是最常用的合适的冷却剂。因28一、低温磷光n溶剂的选择溶剂的选择 溶剂应易于提纯，以除去芳香族和杂环化合物等杂质。溶剂应在所研究的光谱区域内没有很强的吸收和发射。最常用的溶剂是EPA，它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶剂含有重原子的混合溶剂IEPA（由EPA：碘甲烷=10：1组成），有利于系间跨越跃迁，可以增加磷光效应。一、低温磷光溶剂的选择 溶剂应易于提纯，以除去芳香族和杂环29二、室温磷光n由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法。二、室温磷光由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因30固体基质室温磷光法n 此法基于测量室温下吸附于固体基质上吸附于固体基质上的有机化合物所发射的磷光。n所用的载体种类较多，有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸钠、聚合物、纤维素膜）等。理想的载体理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加其刚性刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。固体基质室温磷光法 此法基于测量室温下吸附于固体基质上的有机31胶束增稳的溶液室温磷光法 n当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损失减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。利用利用胶束稳定的因素，结合重原子效应，并对溶胶束稳定的因素，结合重原子效应，并对溶液除氧，液除氧，是该法的三个要素。是该法的三个要素。胶束增稳的溶液室温磷光法 当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶32三、磷光分析仪 n磷光分析仪与荧光分析仪相似，在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测定。（1）样品池样品池如将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶盛有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。（2）可转动的斩波片可转动的斩波片或或圆柱形筒圆柱形筒在激发光单色器和样品池之间，样品池和发射光单色器之间，各装一个斩波片，并由一个同步电动机带动，这两个斩波片可调节为同相或异相，同相时，磷光和荧光一起进入发射光单色器，测得的是两者总光强；当斩波器调节为异相时，激发光被遮断，此时，荧光的寿命短，立即消失，磷光寿命长，所测到的仅为磷光。具有时间分辨功能。三、磷光分析仪 磷光分析仪与荧光分析仪相似，在荧光分光光度计33三、磷光分析仪三、磷光分析仪可转动的圆柱形筒可转动的圆柱形筒可转动的斩波片可转动的斩波片三、磷光分析仪可转动的圆柱形筒可转动的斩波片34四、应用 n磷光强度与浓度的关系磷光强度与浓度的关系nIp =2.303 p I0 bcn p磷光量子效率nIp也只有在低浓度时，才与浓度c成线性关系，但磷光的浓度线性范围要比荧光大。n磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。四、应用 磷光强度与浓度的关系35第五节 化学发光与生物发光分析n 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光化学发光。n利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法化学发光分析法。n化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光生物发光。如萤火虫、某些细菌、真菌、原生动物、蠕虫以及甲壳动物等所发射的光。第五节 化学发光与生物发光分析 某些物质在进行化学反应时，由36一、化学发光分析的基本原理 n化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。n任何一个化学发光反应都应包括化学激化学激发发和发光发光两个步骤，必须满足如下条件：一、化学发光分析的基本原理 化学发光是吸收化学反应过程产生的37化学发光必须满足如下条件：（1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓。（大多数化学发光反应为氧化还原反应）（2）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。（3）发光效率高。激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。化学发光必须满足如下条件：（1）化学反应必须提供足够的激发38化学发光效率cln化学发光效率clcl，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学效率r和激发态分子的发光效率f。定义为：ncl=发射光子的分子数/参加反应的分子数=r f 化学发光效率cl化学发光效率cl，又称化学发光的总量子39二、化学发光反应类型 1.1.直接化学发光直接化学发光 直接发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。A+B C*+DC*C+h式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射光子。二、化学发光反应类型 1.直接化学发光 402.2.间接化学发光间接化学发光 间接发光间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。A+B C*+D C*+F F*+E F*F+h 式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。2.间接化学发光 间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初412.2.间接化学发光间接化学发光例如，臭氧的化学发光反应没食子酸+O3 A*（受激中间体）+O2罗丹明B+A*罗丹明B*+B（最终氧化产物）罗丹明B*罗丹明B+h（584nm）测定大气中微量臭氧测定大气中微量臭氧。2.间接化学发光例如，臭氧的化学发光反应没食子酸+O3 423.3.液相化学发光液相化学发光 n 按按反反应应体体系系的的状状态态分分类类，可分为液相化学发光、气相化学发光等。n 液相化学发光在痕量分析十分重要n 用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺鲁米诺、光泽精光泽精、洛粉碱洛粉碱等。n 例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子。3.液相化学发光 按反应体系的状态分类，可分为液相化433.3.液相化学发光液相化学发光例如，在生化分析中，氨基酸+O2 氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶 酮酸+NH3+H2O2H2O2+鲁米诺 A*A*产物+h max=425nm（鲁米诺3-氨基苯二甲酸肼）用于测定氨基酸含量用于测定氨基酸含量。pH 9-113.液相化学发光例如，在生化分析中，pH 9-11443.3.液相化学发光液相化学发光n鲁米诺与H2O2的化学反应。可检测低至10-9mol/L的H2O2，此反应可被一些痕量金属（过渡金属）催化，使发光大大增强，另一方面，又可被Ce4+、Hf4+等抑制，使发光大大减弱，这样就可测定很多金属测定很多金属离子，检测限可低至离子，检测限可低至0.01g/g0.01g/g。3.液相化学发光鲁米诺与H2O2的化学反应。可检测低至10-454.4.气相化学发光气相化学发光 n主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。n臭氧与乙烯的化学发光反应；n一氧化氮与臭氧的化学发光反应。4.气相化学发光 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于46三、生物发光分析法三、生物发光分析法 n生物发光分析中，通常涉及到酶促反应和发光反应，这类发光分析不仅灵敏度高，选择性也很高。n例如，三磷酸腺苷（ATP）的测定，就是生物发光分析的成功实例。n细菌发光也可用于发光分析。三、生物发光分析法 生物发光分析中，通常涉及到酶促反应和发光47三、生物发光分析法三、生物发光分析法 n生物化学发光分析法在免疫反应和酶的固定化技术的应用中也有不少实例。总之，生物化学发光分析为生化分析提供了一条新的途径，可使生化分析趋于微量、特异、灵敏和快速。三、生物发光分析法 生物化学发光分析法在免疫反应和酶的固定化48四、化学发光分析仪四、化学发光分析仪 n化学发光分析法的测量仪器主要包括样样品池品池、检测器检测器、放大器放大器和记录系统记录系统。记录系统记录系统试液试液样品池样品池检测器检测器放大系统放大系统泵泵试液试液四、化学发光分析仪 化学发光分析法的测量仪器主要包括样品池、49四、化学发光分析仪四、化学发光分析仪 n化学发光反应在样品池中进行，样品和试剂混合的方式有不连续取样体系不连续取样体系，加样是间歇的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内，然后用进样器加入分析物。n另一种方法是连续流动体系连续流动体系，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，而以峰高进行定量测量。四、化学发光分析仪 化学发光反应在样品池中进行，样品和试剂混50