第三节动物细胞工程-课件

第三节第三节 动物细胞工程动物细胞工程1 动物细胞特点无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化动物细胞间的连接方式紧密连接间隙连接隔壁连接中间连接桥粒连接2 动物细胞培养定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。3 发展历史1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞4 生长特性贴附生长型 如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型细胞 如血液白细胞，淋巴组织细胞等5 体外培养细胞基本技术体外培养特点体外培养工具体外培养条件体外细胞生长增殖过程培养方法大规模培养技术5.1 体外培养特点营养条件苛刻适应性差,敏感培养时间长，易污染培养工具器皿为各种类型的培养瓶、培养皿、培养室、小室等载体：空心纤维和微珠5.2 体外培养工具空心纤维微球5.3 体外培养条件温度，37度pH：7.2-7.4气体，氧，二氧化碳，氮气营养条件 需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供动物细胞培养基天然培养基：主要有血清，组织提取液、鸡胚汁合成培养基无血清培养基动物细胞培养必需的溶液平衡盐水培养基pH细胞消化液：把组织解离成分散细胞 胰蛋白酶消化液和EDTA溶液抗生素溶液5.4 体外细胞生长增殖过程原代培养期传代培养期衰退期5.5 培养方法悬滴：最早由Harrison 1907年创立旋转管：灌注小室培养瓶培养板原代培养与传代培养技术1）组织快培养首先从机体获得组织快，然后放入一个培养皿中用Hanks液洗，用小剪刀剪成1 mm3的组织快，加入少许培养液，塞上瓶塞置于37度培养箱培养，成单层后做传代培养。为促进细胞帖壁，也可以瓶内壁涂一层血清。组织消化培养过程取材分离和组织消化培养过程 接种、培养-常规检查传代培养技术当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展成片，占满器皿表面。这时需要对其分离培养，这一操作过程称为传代。（1）吸取培养瓶内旧培养液。（2）加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。（3）2-5 min后检查，如有细胞间隙变大或细胞质回缩现象，终止消化。（4）吸出消化液，加入Hanks液。（5）用吸管轻打瓶壁，使细胞脱落成悬浮液（6）重新接种贴壁培养技术贴壁培养的材料：1）玻璃2）塑料 3）金属 4）微载体基本操作1）将培养材料用物理或生物化学法分散成细胞悬浮液。2）过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。3）放入CO2培养箱培养。生长过程及优点游离期吸附期繁殖期退化期优点：1）贴壁培养比较容易更换培养基2）容易采用灌注培养，提高细胞密度。3）更有效表达同一产品。4）方便地调节培养液和细胞比例。5）易于观察细胞生长状况。5.6 大规模培养技术悬液培养，使用微球载体微载体培养多孔载体培养微囊化培养中空纤维法动物细胞生物反应器培养动物细胞培养用生物反应器种类：微载体式中空纤维式：最经典，最常用灌注培养式旋转壁式6 动物细胞培养的应用1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等，酶类，激素，病毒生长因子，疫苗，单抗等，酶类，激素，病毒杀虫剂杀虫剂（1 1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干 扰素、扰素、单克隆抗体等。单克隆抗体等。（2 2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（3 3）用于检测有毒物质）用于检测有毒物质（4 4）用于生理、病理、药理等方面的研究，）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据为治疗和预防疾病提供理论依据动物动物 细胞培养细胞培养培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等动物细胞动物细胞原代培养 分裂10次细胞株传代培养 分裂50次(细胞系)(细胞株)细胞系无限分裂遗传物质未发生改变遗传物质发生改变无限增值植物体培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白培养目的葡萄糖动物血 清蔗糖 植物激素液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目细胞株、细胞系植物体培养结果分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株培养目的葡萄糖动物血蔗糖 植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较动物细胞融合诱导动物细胞融合的方法诱导动物细胞融合的方法物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的动物病毒动物细胞融合的用途动物细胞融合的用途制备单克隆抗体主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较 采用此方法可以将两个不同种、属的动物优点集中在一起，产生具有双亲优点的可繁殖的杂种动物。细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重大意义。这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺细胞和狂犬病毒的培养工艺DMEM培养基培养基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分锥形瓶逐级锥形瓶逐级放大培养放大培养加碱（碳酸加碱（碳酸氢钠）氢钠）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培养液灌注培养液微载体微载体5L种子罐培种子罐培养养培养液培养液50L生生物物反反应应器器接种狂犬接种狂犬病毒病毒出液口出液口收获病毒收获病毒6.1 单单克隆抗体克隆抗体 19751975年英国科学家年英国科学家Milstein和和Kohler将将产产生抗体生抗体 的淋巴的淋巴细细胞同胞同肿肿瘤瘤细细胞融合，成功建立了胞融合，成功建立了单单克隆抗克隆抗 体技体技术术，而，而获获得得1984年年诺贝诺贝尔尔医学和生理学医学和生理学奖奖。每个每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某对某 种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限细胞可以无限 增殖，因此杂交瘤细胞可在增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内体外培养或移植到体内 条件下分泌大量单条件下分泌大量单克隆抗体。克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。体。（1 1）提出问题：）提出问题：从动物血清中分离抗体的方法产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏（2 2）设计方案：）设计方案：由于每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，就可以产生单克隆抗体。由于B淋巴细胞不能无限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可达到目的。杂杂交交瘤瘤细细胞胞产产生生 单单克克隆隆抗抗体体示示意意图图单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用在基础理论研究中具有重要意义在基础理论研究中具有重要意义在疾病诊断、治疗和预防方面，在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性高、灵敏度高等优越性。具有特异性高、灵敏度高等优越性。生物导弹生物导弹组织工程应用细胞生物学和工程学的原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖，扩增，然后移植到人体内所需的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的。6.2 动动物克隆物克隆 生物繁殖后代通常是以精、卵生物繁殖后代通常是以精、卵细细胞胞结结合的有性生殖合的有性生殖方式方式进进行。通行。通过营过营养体养体细细胞繁殖个体的方法称胞繁殖个体的方法称为为无性繁无性繁殖。克隆是指离体条件下的无性繁殖。殖。克隆是指离体条件下的无性繁殖。1981年年Illmenses 率先率先报报告用小鼠幼胚告用小鼠幼胚细细胞核克隆出正常小鼠。随后，胞核克隆出正常小鼠。随后，1984年年Willadsen用未成熟羊胚用未成熟羊胚细细胞核克隆出一胞核克隆出一头头羊。羊。英国英国PPI生物技生物技术术的的罗罗斯林（斯林（Roslin）研究所的）研究所的维维尔尔穆特穆特(Wilmut)博士博士2019年年2月月27日在世界著名日在世界著名权权威威杂杂志志Nature宣布的用乳腺宣布的用乳腺细细胞的胞的细细胞核克隆出一只胞核克隆出一只绵绵羊羊“多莉多莉(Dolly)”的消息。的消息。“多莉多莉”的的诞诞生，既生，既说说明了体明了体细细胞核的胞核的遗传遗传全能性，也翻开了人全能性，也翻开了人类类以体以体细细胞核胞核竞竞相克隆相克隆哺乳哺乳动动物的新篇章。此物的新篇章。此项项技技术术因而荣登美国因而荣登美国Science周刊周刊评评出的出的2019 年十大科学年十大科学发现发现 的榜首。的榜首。绵绵羊羊B乳腺乳腺细细胞核胞核易核卵易核卵融合卵融合卵绵绵羊羊C子子宫宫多莉多莉植入植入植入植入生生产产克克隆隆多多莉莉羊羊示示意意图图取出取出未受精卵未受精卵去核去核电电激激体外胚胎体外胚胎发发育育绵绵羊羊A多莉多莉克隆猴克隆猴 (1)遗遗传传素素质质完完全全一一致致的的克克隆隆动动物物将将更更有有利利于于开开展展对对动动物物(人人)生生长长、发发育、衰老和健康等机理的研究；育、衰老和健康等机理的研究；(2)有利于大量培养品有利于大量培养品质优质优良的家畜良的家畜;(3)经经转转基基因因的的克克隆隆哺哺乳乳动动物物，将将能能为为人人类类提提供供源源源源不不断断的的廉廉价价的的药药品品、保保健健品品以以及及较较易易被被人人体体接接受受的的移移植植器官；器官；(4)科学家将很快地从目前的同种克隆技科学家将很快地从目前的同种克隆技术术推推进进到异种到异种克隆克隆,即借腹即借腹怀怀胎的新胎的新领领域域,这这无疑将大大促无疑将大大促进对濒临灭进对濒临灭种的哺乳种的哺乳动动物的保物的保护护工作。工作。克隆技克隆技术术将将对对21世世纪产纪产生的重大影响生的重大影响克隆动物的研究意义1.1.用于生物学和医学研究的实验动物用于生物学和医学研究的实验动物2.2.改良动物品种改良动物品种 3.3.治疗人类疾病治疗人类疾病4.4.保护濒危动物保护濒危动物缺点:1.克隆技术却是一个降低繁殖力的方法；2.克隆动物在遗传上是全等的，一种特定的病毒或其它疾病的感染，将会带来灾难；3.会扰乱物种的进化规律，干扰性别比例。6.3 干干细细胞工程胞工程 Thank you拯畏怖汾关炉烹霉躲渠早膘岸缅兰辆坐蔬光膊列板哮瞥疹傻俘源拯割宜跟三叉神经痛-治疗三叉神经痛-治疗