亚细胞组分分离鉴定课件

亚细胞组分的分离鉴定亚细胞组分的分离鉴定亚细胞组分的分离鉴定1常用的亚细胞组分分离方法（P14）1.1.差速（分级）离心法差速（分级）离心法2.2.密度梯度离心法密度梯度离心法速度区带离心法速度区带离心法等密度离心法等密度离心法3.3.超速离心法超速离心法常用的亚细胞组分分离方法（P14）1.差速（分级）离心法2差速（分级）离心法交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法力使具有不同质量的物质分级分离的方法特点：介质特点：介质密度均一密度均一，速度逐渐提高，样品按，速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀大小先后沉淀细胞器沉降的顺序：核、线粒体、溶酶体与过细胞器沉降的顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体体只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器多用于分离细胞器差速（分级）离心法交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力3密度梯度离心法用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离分离分为速度分为速度区带离心区带离心和等密度和等密度离心离心两种两种可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、白、DNADNA和和RNARNA等生物样品等生物样品密度梯度离心法用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度4超速离心超速离心离心力在离心力在100000 g 100000 g 以上的离心。用于分离或以上的离心。用于分离或分析鉴定病毒颗粒、细胞器或大分子生物样品分析鉴定病毒颗粒、细胞器或大分子生物样品等。等。在操作技术上，最常用的是差速离心和密度梯在操作技术上，最常用的是差速离心和密度梯度离心。度离心。超速离心离心力在100000 g 以上的离心。用于分离或分560006000r/minr/min高速离心机高速离心机2500025000r/min25000r/min 低速离心机低速离心机60006000r/minr/min常见的离心机种类常见的离心机种类6000r/min高速离心机25000r/min超速离心6离心机的使用离心机的使用离心机在运转时，不得移动离心机。离心机在运转时，不得移动离心机。离心机必须放置在坚固水平的台面上，离心机必须放置在坚固水平的台面上，并且保并且保持离心机的平稳持离心机的平稳，以免产生振动。，以免产生振动。放置放置离心管离心管时需注意配平：时需注意配平：加液应称量平衡加液应称量平衡；试管必须对称放入试管必须对称放入加液加液体积应小于离心管体积体积应小于离心管体积2/32/3若运行时有离心试管破裂，会引起较大振动应若运行时有离心试管破裂，会引起较大振动应立即停机处理立即停机处理离心机的使用离心机在运转时，不得移动离心机。7亚细胞组分的分离及观察鉴定亚细胞组分的分离及观察鉴定亚细胞组分的分离及观察鉴定8实验目的实验目的了解亚细胞组分分离的基本方法及原理和了解亚细胞组分分离的基本方法及原理和过程。过程。掌握细胞生物学基本实验操作和实验的综掌握细胞生物学基本实验操作和实验的综合能力。合能力。实验目的了解亚细胞组分分离的基本方法及原理和过程。9实验原理实验原理 细胞内不同的亚细胞组分其比重、细胞内不同的亚细胞组分其比重、大小和形态都不相同，在同一离心场内或大小和形态都不相同，在同一离心场内或不同密度介质条件下离心时其沉降速度也不同密度介质条件下离心时其沉降速度也不相同。根据这一原理，常用差速离心法不相同。根据这一原理，常用差速离心法和密度离心法将细胞内各种组分分离出来。和密度离心法将细胞内各种组分分离出来。实验原理 细胞内不同的亚细胞组分其比重、大小和形10实验步骤（实验步骤（P46P46）3.3.离心，得上清离心，得上清 1 12.2.取大约取大约2g2g大小的肝组织，匀浆，过滤大小的肝组织，匀浆，过滤 1.1.家兔处死，取肝组织。（已完成）家兔处死，取肝组织。（已完成）4.4.沉淀加蔗糖混匀，离心，得上清沉淀加蔗糖混匀，离心，得上清 2 2实验步骤（P46）3.离心，得上清 12.取大约11实验步骤实验步骤 7.7.染色染色6.6.上清上清 1&2 1&2 混匀，离心，得到的沉淀再加蔗糖混匀，离心，得到的沉淀再加蔗糖混匀离心，得沉淀（线粒体）混匀离心，得沉淀（线粒体）5.5.沉淀加蔗糖混匀，离心，得沉淀（细胞核）沉淀加蔗糖混匀，离心，得沉淀（细胞核）实验步骤 7.染色6.上清 1&2 混匀，离心，得到的12实验报告实验报告姓名：班次：组别：实验室：日期：姓名：班次：组别：实验室：日期：一、实验题目一、实验题目二、实验目的二、实验目的三、实验三、实验原理原理四、实验结果四、实验结果 图示实验流程及细胞核、线粒体镜检结果图示实验流程及细胞核、线粒体镜检结果实验报告姓名：班次：组别：实验室：日期：13五五、分析与讨论、分析与讨论六六、思考题、思考题（P47P47）五、分析与讨论14下次实验下次实验生物分子在细胞内定位与分布的分析方法生物分子在细胞内定位与分布的分析方法（DNADNA的的FeulgenFeulgen反应）反应）下次实验生物分子在细胞内定位与分布的分析方法15