分子生物学--基因工程和核酸杂交ppt课件

14 基因工程基因工程基因工程基因工程（DNA recombination）：又称）：又称DNA重组技术重组技术（gene engineering），是指将外源），是指将外源基因基因通过体外重组通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达复制和表达的的技术。技术。分子克隆分子克隆（molecular cloning）：是指将目的）：是指将目的DNA片片段段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复复制制、扩增，以获得该、扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术。分子大量拷贝的技术。厅接毖苛微呕矿奔潮衬匣爵磺为耻囤蔬诽益铂烁煌被闸情痉计蜕墒馆渭弓分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件14 基因工程基因工程（DNA recombination124.1 工具酶工具酶1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2.DNA聚合酶聚合酶3.DNA连接酶连接酶4.碱性磷酸酶碱性磷酸酶5.T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶6.核酸酶核酸酶S1吟蠕讨缆代擞罪癣络目瑚脊早讶蒙酒鞍痊实肌健德檀羚榷盯霄银攘销汀亦分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件24.1 工具酶限制性核酸内切酶吟蠕讨缆代擞罪癣络目瑚脊早231、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。特定核苷酸序列的核酸水解酶。呛棚轰竟列追嚣配缉泻郝嫂会木谅涣短嗡寿敏姻呛遮掂效奢坟蓝墒抛袱穴分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件31、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictio34第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶限制性核酸内切酶命名限制性核酸内切酶命名馆纯珐变洒缆下多蓬穆誊墩灿戏蝉孙诚被捻娩镑焙伐录或迸盘矩糜狠豁抒分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件4第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；Hin d 45作用作用 三种限制性核酸内切酶的作用三种限制性核酸内切酶的作用酶活性酶活性 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 甲基化酶甲基化酶 甲基化酶甲基化酶 ATP ATP酶酶 DNA DNA解旋酶解旋酶DNADNA链上的链上的 无无 有有 有有特异识别位点特异识别位点DNADNA链上的链上的 无无 在识别序列内在识别序列内 在识别序列外在识别序列外特异切割位点特异切割位点在分子克隆中在分子克隆中 无无 有有 无无的重要意义的重要意义怪夯俭跺缄诫若竣承植壹悔邓宵篷恋嚎壁伪啄炭茬抵鬃陡脐彝寅贿凋巢短分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件5作用 56限制酶能识别双链限制酶能识别双链DNA特异的特异的4 8个碱基对个碱基对，并在此序列内并在此序列内特异切割特异切割DNA。限制酶功能：根据需要在限制酶功能：根据需要在特定的位点特定的位点上精确切上精确切割双链割双链DNA分子。分子。回文结构回文结构（palindrome structure）：）：指双链指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。为限制酶所识别）。限制性核酸内切酶的作用限制性核酸内切酶的作用粳呕议滚耪糜褂弥虏屑驾娟篓将鲍佳蒂竣便闻拜杭捉替纷栗倔朵舞嘘连尤分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件6限制酶能识别双链DNA特异的48个碱基对，并在此序列内特675 GAATTC3 ATATGC5 3 EcoR的识别序列：的识别序列：对称轴对称轴3 CTTAAG5 裹扣低喷辽贿咖袭矩账松岛拎汉狱拄物并摘倾边蛮任结诌琉肥天鞋吠腹烟分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件75GAATTC3ATATGC5 3 E78粘性末端粘性末端（sticky end）：）：指限制酶错位切开两条对称轴指限制酶错位切开两条对称轴互补互补DNA双链所产生的末端。双链所产生的末端。平末端平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。双链所产生的末端。GAATTCCTTAAGEcoRCCC GGGGGG CCCSma屡哉伴父岸坤执墅局级奴叹垂疙垣藐玄碌崎顺卤邀贬掩碌崔众月速羚破紧分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件8粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对89蛙耕褪孔荧下绘蝗镭俱嘴谐倡劈践去淫蛊麦尧延物颜厨迹烬臂郁孝盂匀壶分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件9蛙耕褪孔荧下绘蝗镭俱嘴谐倡劈践去淫蛊麦尧延物颜厨迹烬臂郁孝910缅睦聂忠塘铀昌狙辟始容岸绷撬追辞猴将叉郎察恒褪蓄誓墙吸金毯话幌磐分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件10缅睦聂忠塘铀昌狙辟始容岸绷撬追辞猴将叉郎察恒褪蓄誓墙吸金1011固范筛录范胳考泌盆馅熟始男筷鹿底弘禄鹤非约从我律相梢索猩恤汰亦养分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件11固范筛录范胳考泌盆馅熟始男筷鹿底弘禄鹤非约从我律相梢索猩1112同工异源酶同工异源酶（isoschizomers）：指）：指来源不同，但能识别来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。和切割同一位点的酶。同尾酶同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。同粘性末端的酶。如：如：BamH 和和Bst（G GATCC）Xho 和和 Pae R7（C TCGAG）如：如：BamH（G GATC C）Sau 3A（N GATC N）。）。由此产生的由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在片段可借粘性末端相互连接，在DNA重重组时具有更大的灵活性。组时具有更大的灵活性。齿咆写钧桥堂双琵秉祖少恿驻旅姚品虏连最茸歼纸甘外炬丑甩幌尾汝威囱分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件12同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但12131）DNA聚合酶聚合酶和和Klenow片段片段大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶（E.Coli DNA polymerase）是单一多肽链的多功能酶，分子）是单一多肽链的多功能酶，分子量为量为103kD，它具有，它具有3种酶活性：种酶活性：5 3 DNA聚合酶活性聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性2、DNA聚合酶聚合酶 烟韵嗜庄救蔓芍丛昏矮粥破愈卷喉丫剖妈母兵西暮抢殉拨谬座暖匝茹脖釉分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件131）DNA聚合酶和Klenow片段2、DNA聚合酶 1314 5 3 外切酶外切酶 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外切酶外切酶 (103kD)Klenow 片段片段 N C 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外切酶外切酶(68kD)35kD(小小)68kD(大大)N枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶 DNA聚合酶聚合酶 钳看趁哎通睛痘姓疮偷金街跃选煽邑丙松蛰粹笔忽晌棕踏泅类告蓄缄蘑榔分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件14 53外切酶 53聚合酶 1415补齐双链补齐双链DNA的的3 末端，同时可使末端，同时可使3 末端末端DNA标记上同位素。标记上同位素。cDNA克隆中，合成克隆中，合成cDNA第二链。第二链。DNA序列分析。序列分析。Klenow片段的主要用途片段的主要用途搁背扰赏播肤侨杖降假望堵网泉娇发瘪舔码翱垃夷美肚郁录屉史揉锣弦靛分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件15补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA标记上1516Taq DNA聚合酶聚合酶（简称（简称Taq 酶）是一种耐热的酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度，最佳作用温度是是7080，Taq酶具有酶具有5 3 聚合酶活性聚合酶活性和和依赖于聚合作用的依赖于聚合作用的5 3 外切酶活性外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶测序及通过聚合酶链反应（链反应（PCR）对）对DNA分子的特定序列进行体分子的特定序列进行体外扩增。外扩增。2）Taq DNA聚合酶聚合酶野彦苔钟庚焚措仪铣杆音几吠宏搅捧撰目萌孙憎冲颧错啸幼坚引屹欧喜格分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件16Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA1617逆转录酶逆转录酶（reverse transcriptase）是依赖是依赖RNA的的DNA聚合酶，它以聚合酶，它以RNA为模板，为模板，4种种dNTP为为底物，催化合成底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。逆转录酶是多功能酶。RNA指导的指导的DNA聚合酶活性（聚合酶活性（RDDP）核糖核酸酶核糖核酸酶H活性（活性（RNaseH）DNA聚合酶活性（聚合酶活性（DDDP）3）逆转录酶）逆转录酶良叁挥月哪披县涩舅只蔓蔷阂悯姨辨谭痪卢呕涤厨鄂饭稚永各牢探顽并氓分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件17逆转录酶（reverse transcriptase）是17185 3 3 5 RNA(用用 表示表示)RNA-DNA 杂化分子杂化分子 3 5 RNase （核酸酶核酸酶H活性活性)DDDP （DNA聚合酶活性聚合酶活性）4种种dNTP RDDP （逆转录酶逆转录酶）引物、引物、4种种dNTP 病毒双链病毒双链DNA用用 表示）表示）（cDNA第二链第二链(complementary DNA，cDNA)与病毒与病毒RNA 互补的互补的DNA(用用 表示表示)5 3 3 5 5 3 5 3 诫拐季识葬钓虞睹酱账柒碾鸯券筷脯菠敲受州芜烙舷铅得鲤长螺禾绦萄旬分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件185335 RNARNA-DNA 杂1819末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶）：，简称末端转移酶）：分子量为分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链移到单链或双链DNA分子的分子的3 末端末端-OH上。上。末端转移酶的功能主要有：末端转移酶的功能主要有：在载体或目的基因在载体或目的基因 3 末端加上互补的同质多聚尾，末端加上互补的同质多聚尾，形成形成人工粘性末端人工粘性末端，便于，便于DNA重组连接。重组连接。用于用于DNA 3 末端的同位素探针标记。末端的同位素探针标记。4）末端脱氧核苷酰转移酶）末端脱氧核苷酰转移酶垄荫搽蹄辜琐箕傲赣阿灸保弃吵运崭泻宠社傲殊顷秸竞聊急念熄诸华搜须分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件19末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynuc1920(A、G、C、T)n nOH5 5 335 5 33OH5 5 3 3 5 5 33(A、G、C、T)n n Mg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5 5 33OH5 5 33OH 5 5 335 5 33(A、G、C、T)n n Co2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是）底物是单链单链DNA或有或有3 突出末端突出末端的双链的双链DNA，需要，需要Mg2+。（2）底物是）底物是平端平端或或3 凹端凹端的双链的双链DNA，需要，需要Co2+。(A、G、C、T)n n旧尝愿烫胚具瞎省穷陀惰威摸享脉僧屿厉吕境损娠芦间痘尿魏少拴坯卖佰分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件20(A、G、C、T)nOH5 32021DNA连接酶连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的：称为基因工程的缝纫针，它的主要功能是缝纫针，它的主要功能是催化两个互补粘性末催化两个互补粘性末端或平末端双链端或平末端双链DNADNA分子的分子的5 5 磷酸基团与磷酸基团与3 3 羟羟基形成基形成磷酸二酯键磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平，将具有相同粘性末端或平末端的末端的DNADNA连接起来。连接起来。DNA连接酶包括连接酶包括大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶和和T4DNA连接酶连接酶两种类型。两种类型。3、DNA连接酶连接酶暗吸谚殴掠揖傣琶帅拾狸拒俄鼓惺完癣懈嚼悠畏蓝揽瞄瓢古癸阜循息暖拢分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件21DNA连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的缝纫2122熄陋郴傲饭辣经葛剿休嘎拧凶赖膨屹夏晾雅嘶掉俘昆毅扎帅巾咽磐佳异锌分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件22熄陋郴傲饭辣经葛剿休嘎拧凶赖膨屹夏晾雅嘶掉俘昆毅扎帅巾咽2223碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去的作用是催化去除除DNA、RNA或或dNTP上的上的 5-磷酸基团磷酸基团。主要用途。主要用途有：有：除去除去DNA片段上的片段上的5 磷酸以防自身连接。磷酸以防自身连接。在使用在使用T4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从同位素标记前，从RNA或或DNA上除去上除去5 端的端的磷酸。磷酸。4、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶 5-pCpGpC -OH 3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶5-CpGpC -OH 3 5-p3-HO5-HO3-HO宽傀挑谤卧木墩氰题钾冯狐讫心潮览丑勤黍埃真茧佳稽釉媳牡地湃龄驰屹分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件23碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的23245、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 5-CpGpC -OH 3p+ADP+ATP5-CpGpC -OH 3T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶前向反应前向反应：交换反应交换反应：5-CpGpC -OH 3+ADP -32P dATP 二硫苏糖醇二硫苏糖醇,Mg2+过量过量ADPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶p*+ATP当购贮仇嘶墒猛胜孙糜径羊威卜良湛逾虱虎蚌龙枚氢揣吻案稻棍矫劈择榔分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件245、T4多核苷酸激酶 5-CpGpC -2425核酸酶核酸酶S1可水解双链可水解双链DNA、RNA或或DNA-RNA杂交分杂交分子中的子中的单链部分单链部分。其主要作用有：。其主要作用有：除去粘性末端以产生除去粘性末端以产生平末端平末端。除去除去cDNA合成时形成的合成时形成的发夹结构发夹结构。分析分析RNA的的茎环结构茎环结构和和DNA-RNA分子的分子的杂交杂交情况。情况。6、核酸酶、核酸酶S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1+骄齐延吾炎橙挖互育茫会分洛削盲渍农庸到沟煽涝胳峰澄厨九摧谍僵惋鸽分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件25核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分25264.2 载体载体载体载体（vector）：指能携带外源）：指能携带外源DNA片段导入片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为为DNA。制备的目的基因或制备的目的基因或DNA片段必须与合适的载体连接形片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。粒和病毒等。切虞踏载秃菌狠具痞选枝府指诞桩庙篡帚杂哎莆藩氨疚蛇培撞延绘送蚤蓉分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件264.2 载体载体（vector）：指能携带外源DNA片26271、克隆载体、克隆载体克隆载体克隆载体：能将载体外源能将载体外源DNA在受体细胞中复在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。的载体。险休溯廷膘镣耀惦逸木褥绪先啦矣惦淤妓惧晓砸沙蚊什若雀夯座王一拐缎分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件271、克隆载体克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制2728能能自我复制自我复制并具较高的拷贝数。并具较高的拷贝数。分子量一般分子量一般 10Kb。带有带有遗传筛选遗传筛选标记。标记。有适当的有适当的限制酶酶切位点限制酶酶切位点，便于外源，便于外源DNA的插的插入和筛选。入和筛选。v多克隆位点多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：）：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。克隆载体应具备的特征克隆载体应具备的特征瘦呛朽廉已咯钝肚投汽蒸咆冉趟已温粳努吓均滤挎郁熏退拧撞崎楚尚铸涣分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件28能自我复制并具较高的拷贝数。克隆载体应具备的特征瘦呛朽廉28291）质粒克隆载体）质粒克隆载体质粒克隆载体的主要用途：质粒克隆载体的主要用途：用于保存和扩增用于保存和扩增 2Kb目的目的DNA。构建构建cDNA文库。文库。目的目的DNA的测序。的测序。作为核酸杂交时的探针来源。作为核酸杂交时的探针来源。亭胎长陕臆奈渺替觅倘族景崎半万姿伐嘴蛾便斜盗栓唤祸懊厚君收镁梆三分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件291）质粒克隆载体质粒克隆载体的主要用途：亭胎长陕臆奈渺2930pBR322质粒克隆载体质粒克隆载体pBR322质粒是由一系列质粒是由一系列大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNA通过通过DNA重重组技术构建而成的双链克隆载体，长为组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。它含有一个能保证高拷贝自我复制的它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点复制起始点（Ori），并装有），并装有四环素抗性（四环素抗性（Tetr）基因）基因和和氨苄青霉氨苄青霉素抗性（素抗性（Ampr）基因）基因供菌落筛选。供菌落筛选。在这两个抗性基因中分别含有在这两个抗性基因中分别含有BamH I和和Pst I等限制酶等限制酶的的单一酶切位点单一酶切位点，用于插入外源，用于插入外源DNA片段。如有外源片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。胜际旭氢脾琼龋梦缅蔑掩缚恕汾讳它瓢宿物蒙娇细涸拒病鸭疥单旋戊庶鲤分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件30pBR322质粒克隆载体pBR322质粒是由一系列大肠杆3031 复制复制起始点起始点抗药基因抗药基因抗药基因抗药基因pBR322载体载体价禾斤剔功醚宣伯稍呕悠申拜央翅蚊扎蛰货挤及不慧柜召东连主姿玲昨窃分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件31 复制起始点抗药基因抗药基因pBR322载体价禾斤剔功醚3132pUC系列载体系列载体 pUC系列载体是由系列载体是由pBR322质粒和质粒和M13噬菌体重组构建噬菌体重组构建而成的而成的双链双链DNA质粒质粒载体。载体。pUC18和和pUC19质粒长约质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。反方向排列外，其它序列均相同。pUC质粒含质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的自大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ 基因基因，该基因序列中含，该基因序列中含有有多克隆位点多克隆位点。画球比益辜揍铰闷傈彝胚侦住熟论鼓切桩懊醒颓耶捣擒驻海勃败冯樱违卉分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件32pUC系列载体 pUC系列载体是由pBR322质粒和M13233pUC18载体载体操碉玖喀盗同想淑粒焉镜枷寐侄秒吴捣骋存很实愉爵亚船孺桂伙惠健刊坡分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件33pUC18载体操碉玖喀盗同想淑粒焉镜枷寐侄秒吴捣骋存很实33342）噬菌体克隆载体）噬菌体克隆载体噬菌体噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌的病：指感染细菌的病毒。毒。按其生活周期分为两种类型：按其生活周期分为两种类型：1.溶菌性噬菌体：溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。2.溶原性噬菌体：溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。扦子坍舍纬檄劫蹿旁疵发录止禾拦瓜梢纯怨厅明祝伯泥腻民泊蹲柒仁硬幌分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件342）噬菌体克隆载体噬菌体（bacteriophage，p3435野生型的野生型的 噬菌体是线性双链噬菌体是线性双链DNA，全长约，全长约48.5Kb，其，其中中60%（约（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间）是溶菌生长所必需，中间40%的区的区域为非必需，域为非必需，可被外源可被外源DNA片段代替而不影响片段代替而不影响 噬菌体噬菌体的生存。的生存。噬菌体噬菌体5 末端含末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为粘性末端，称为cos位点位点，噬菌体感染宿主菌后，其粘噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。分子。噬菌体载体噬菌体载体旨渺秒毯熏雍笔疙巫者吓潦居未使郴晌碴赦峰贝镑剪骗秒司观套薛六毕茸分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件35野生型的噬菌体是线性双链DNA，全长约48.5Kb，其3536 噬菌体载体的结构噬菌体载体的结构 辟捎臼顶看勺狙次棕万崎薄舷肇焊擞巧愉耿韦容栅赚咐怔秩午昂栖悟淖檄分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件36噬菌体载体的结构 辟捎臼顶看勺狙次棕万崎薄舷肇焊擞巧愉3637 噬菌体载体的特点噬菌体载体的特点重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的75%105%之间。之间。筛选标记：筛选标记：外源基因插入型：蓝白斑外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选。筛选。外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高100 1000倍）。倍）。末佐善裹意锅瑶拜毁示己橡邻顿乎钮译聂逗桃厅痞抹林痊泅酝迅籍蘑馆铁分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件37噬菌体载体的特点重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的3738 噬菌体载体的用途噬菌体载体的用途 用作一般的克隆载体。用作一般的克隆载体。用于构建基因组或用于构建基因组或cDNA文库（文库（22Kb）。）。用于抗体库或随机肽库的构建。用于抗体库或随机肽库的构建。核酸的序列分析。核酸的序列分析。冻偿铆芒迎强体搅坟赚稼的止恰吴户黑泳芭澄烧瓣友抛邪修守烧测车盼撼分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件38噬菌体载体的用途 用作一般的克隆载体。冻偿铆芒迎强体3839M13噬菌体噬菌体野生型野生型M13M13噬菌体为噬菌体为6.4Kb6.4Kb左右的闭环正链左右的闭环正链DNADNA分子。克分子。克隆的隆的外源基因片段外源基因片段1kb1kb1kb1kb。M13M13噬菌体能以噬菌体能以单链和双链单链和双链两种方式存在，可用于感染两种方式存在，可用于感染(经包装的单链经包装的单链DNA)DNA)和转化和转化(双链双链DNA)DNA)。M13M13中引入的多克隆位点，正好插入中引入的多克隆位点，正好插入LacZLacZ基因内，可利基因内，可利用用蓝白色噬菌斑蓝白色噬菌斑筛选重组体。筛选重组体。M13M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞（细胞（呈呈溶源状态生长溶源状态生长，故可从细菌培养液中获得噬故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链菌体，制备单链DNADNA）。）。乙博癣届男苗锹盟獭纲役肋捉航捡寨碱章撂碗孝动臭肘港挠晦蕉雌匆韦幂分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件39M13噬菌体野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链3940M13噬菌体在细菌内的复制模式图噬菌体在细菌内的复制模式图噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型DNA经经pIIpII蛋白蛋白造缺口造缺口355335滚环复制滚环复制释出单链释出单链DNADNA(正链正链)经经pIIpII蛋白蛋白剪切剪切进入下进入下一循环一循环屏灵廉案磺勿潞签菊瘁酒逸免亥酱彪男擎链骇雀后油晤孝冻枕话渺烘欲鸳分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件40M13噬菌体在细菌内的复制模式图噬菌体复制复制型经pII4041粘粒粘粒(cosmid)是由质粒和是由质粒和 噬菌体的噬菌体的cos位点构位点构建而成。建而成。粘粒载体组成：粘粒载体组成：粘粒载体组成：粘粒载体组成：质粒复制的质粒复制的起始位点起始位点(Ori)。携带携带抗药抗药基因。基因。用于插入目的基因的用于插入目的基因的单一酶切单一酶切位点。位点。噬菌体的噬菌体的cos位点。位点。3）粘粒克隆载体）粘粒克隆载体君禁孙十护搏叠微杖估别意溉很沼忿讲孽惦谍荆怎尾蔽备刑妥毖窜魏脾哥分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件41粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的cos位点构建而4142粘粒载体的特点粘粒载体的特点粘粒载体大小为粘粒载体大小为46Kb，而，而插入外源基因长达插入外源基因长达4050kb。加入加入 噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成成类似于类似于 噬菌体的具感染能力的颗粒噬菌体的具感染能力的颗粒，容易，容易进入大肠杆菌。进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。表现质粒的特性。仪晰民噎环帧整郑筷柔啼臻谍涎彬懒携绷困装苦段趣钳隋与烙杯摸邢沉橙分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件42粘粒载体的特点粘粒载体大小为46Kb，而插入外源基因长4243粘粒载体的用途粘粒载体的用途 克隆大片段克隆大片段DNA。构建基因组文库。构建基因组文库。眼逢召瓤仙互攀东累呀棕栈歹疑合长氰数鸯恭嫡剥过扦砚乘年莱索剩捅不分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件43粘粒载体的用途 克隆大片段DNA。眼逢召瓤仙互攀东累呀43442、表达载体、表达载体表达载体表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。转录和正确翻译的载体。基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的基因的有效转录、有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。正确的翻译和翻译后加工。焦码喜毁块飞腮杯硷侵垒撵教击荡晋匿庶澎罐老叉叁氰乙迢峭俞瓦驴月虏分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件442、表达载体表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录4445报告基因（报告基因（reporter gene）为了判断某一待测为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采序列的生物活性，常采用报告基因方法。用报告基因方法。报告基因报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来和表达水平来反映上游待测基因功能反映上游待测基因功能的基因，的基因，又称报道基因。又称报道基因。炼怎户妊蛆饿顷防已壁纳荆腰跪谨桅斌寂册渺圆驾键代芦履拣恕阴簿宴哆分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件45报告基因（reporter gene）为了判断某一待测D45461）原核细胞表达载体）原核细胞表达载体真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：插入方向的正确性；插入方向的正确性；受原核启动子的控制；受原核启动子的控制；必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。珐逾渺翰备司翠恬液慷履尾芳疟杀职斑露辞眠押涧得原烦林靳讽解牟华膨分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件461）原核细胞表达载体真核基因在原核细胞中表达需要保证外源4647原核细胞的表达载体主要是原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：表达系统调控元件：启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点转录终止信号。转录终止信号。灰皇和嗡襄砍贬鳖颗兹膛楔罗忧约挎掏羡蔡鱼窿污掐限枢萧椽吊痰众橇判分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件47原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。灰皇和嗡襄砍贬4748（1）启动子（）启动子（promoter）如乳糖启动子（如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（）、色氨酸启动子（Trp）、）、Tac启动子（启动子（Trp-Lac）以及）以及PL和和PR启动子等。启动子等。5 TTGACATATAAT/3-35区区 -10区区 转录起始点转录起始点Pribnow boxDNA原核细胞启动子示意图原核细胞启动子示意图捷抡匀西暮板却耐曳味孟邵襟择煤胆鹿忽亩头泽筐橙恍讼土蔷榜榜袱孽练分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件48（1）启动子（promoter）如乳糖启动子（Lac）4849（2）SD序列序列mRNA调郝遮州眯价搓镊瞧二砰铆骨舆扳停镰瘫跌屁农雪捌头浇陋蜕堂廉囱袒伸分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件49（2）SD序列mRNA调郝遮州眯价搓镊瞧二砰铆骨舆扳停镰4950（3）终止子（）终止子（terminator）终止子：终止子：一个基因的一个基因的3 末端有一特定的末端有一特定的DNA序序列，它具有被列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功聚合酶识别并停止转录的功能。能。该序列含有一段富含该序列含有一段富含A/T和富含和富含G/C的的回文对称回文对称结构，终止子转录后形成的结构，终止子转录后形成的RNA具有具有茎环状局茎环状局部二级结构部二级结构。渭洱沉无雪率掌瘩宿姐管虎晾汀薛靖楼间哥洱烹卉趾沥案学柱飘桩奇乳虚分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件50（3）终止子（terminator）终止子：一个基因的35051 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTTTTTNNN-DNA-NNTT CGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含区富含区2G/C富含区富含区1A/T富含区富含区5 3 5 3 RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH5 3 RNARNA结构结构5 G C NN NN CC GC GC GG CG CA UA U NNNN UUUU-OH 3 DNADNADNADNA转录的强终转录的强终转录的强终转录的强终止子模式图止子模式图止子模式图止子模式图转录转录痛最城慎昧端具悲逾渍讣佳帽挺啡胯淄予恢众洒琴为侠雌姻戏扑酝况酥抬分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件51 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTT5152非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如白酶降解。如pKK223-3质粒载体。质粒载体。分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如折叠，易提取。如PINlll系列。系列。融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的外源蛋白稳定。如外源蛋白稳定。如pGEX系列。系列。原核细胞表达载体的类型原核细胞表达载体的类型秩埋位涌兔旨题纹颗蛛仆宙帐异伐榨沸闪声祁囊度汉痛厅幕萨孟洛钥璃滇分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件52非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。5253真核表达载体的真核表达元件有：真核表达载体的真核表达元件有：启动子启动子/增强子增强子终止位点和加终止位点和加poly A信号信号。原核质粒序列原核质粒序列：包括复制起始序列和抗药基因标记。：包括复制起始序列和抗药基因标记。启启动动子子：转转录录起起始始位位点点上上游游2530bp有有富富含含AT的的TATA框框，TATA框框的的上上游游约约100200bp处处为为上上游游启启动动子元件。子元件。增增强强子子（enhancer）：是是一一类类显显著著提提高高基基因因转转录录效效率的顺式作用元件。率的顺式作用元件。终止子和加终止子和加polyA信号（信号（AAUAA）。）。2）哺乳动物细胞表达载体）哺乳动物细胞表达载体柳炒睬嗡循护荚绵剔车泡梁爱郁狈克课卓队到辅挛商孵憾汝昨峨妙拂聂镭分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件53真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子终止位点和53541.目的基因的获取目的基因的获取2.载体的选择载体的选择3.目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接4.重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞5.重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定4.3 基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤皖深骗陌年八幅仍正伸熔挛疾蚜蕉暇鼠皖忻浆趟捍凿仍皋钟黑脂警呐化押分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件54目的基因的获取4.3 基因工程的基本步骤皖深骗陌年八幅5455连接连接含含重组子重组子的的阳性克隆阳性克隆载体载体+目的基因目的基因转化、筛选转化、筛选和和鉴定鉴定阳性克隆阳性克隆DNADNA重组体重组体+受体细胞受体细胞基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤 分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛邹暇胳妥市嘲焦琴羌夺焊播咱逻淫阎取复占狡耘益澎汐砌小隘版涉雷涧啼分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件55连接含重组子的阳性克隆载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性5556 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取2）逆转录合成）逆转录合成cDNA3）人工合成）人工合成DNA片段片段4）直接从染色体）直接从染色体DNA中分离目的基因中分离目的基因1、目的基因的获取、目的基因的获取搜帕蹦始甄悟靠莫伊锄殿铺资遣娱拆石并荷渤寡哺慨窘菇獭族邱诈咀形腊分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件56 1）从基因文库中获取1、目的基因的获取搜帕蹦始甄悟靠莫56571）从基因文库中获取）从基因文库中获取目的基因：目的基因：指被研究的某一基因或指被研究的某一基因或DNA序列，序列，即需要克隆或表达的基因。即需要克隆或表达的基因。基因组文库基因组文库（genomic library，G-文库）文库）是指是指含有某种生物全部基因随机片段的重组含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克克隆群。隆群。琐付合讶货疼尉拆椿肿播音谴舶餐跨呆莆窄辨陆台产齿把靡蓬摧本骚泪届分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件571）从基因文库中获取目的基因：指被研究的某一基因或DNA5758用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得较完整的连续编码序列较完整的连续编码序列，易在宿主细胞中表达，易在宿主细胞中表达及筛选。及筛选。选用富含目的基因选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。有利于分离到目的基因。如胰岛素基因的如胰岛素基因的mRNA主主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细占网质红细胞总胞总mRNA的的50%90%。2）逆转录合成）逆转录合成cDNA柠捏呜渣沟电诫眼瓷墩醉讣霄鳞名奸主譬恋由妊唤嗣几茫正烹休偷仇导没分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件58用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得较完整的连续编码5859根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。合成仪人工合成目的基因。适用于合成适用于合成分子量较小分子量较小的目的基因的目的基因（100bp以以内）。内）。如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。素、胸腺素及胰岛素原的基因等。3）人工合成）人工合成DNA片段片段月锨告孵佩瘴泅绕遣堤翱拱戴镜触豢薄揽泅辩靴领丫诧肉果叮鹤篡患奎闲分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件59根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基酸序列，可推导出5960根据染色体根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。、分离目的基因。适用于制备适用于制备原核生物原核生物目的基因，因为：目的基因，因为：真核细胞染色体真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。胞中转录后不能被剪接。真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。目的基因。4）直接从染色体）直接从染色体DNA中分离目的基因中分离目的基因鳞伦暮嗅赌塞邮茧已侨峡丁皖耕如掘葫镜椅剂艺嘘兰肃恍硫棵态滤厌柴城分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件60根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶6061根据外源根据外源DNA的特性和受体细胞的特性选择合的特性和受体细胞的特性选择合适的载体。适的载体。2、载体的选择载体的选择扮贴唱漳犯哦呐仁匆湿夹悯狗纹绍虎闷无氰浅痞尸型颧仪朴俘承红甜皆驼分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件61根据外源DNA的特性和受体细胞的特性选择合适的载体。2、61621)1)粘性末端连接粘性末端连接3、目的基因和载体的连接、目的基因和载体的连接本法适用于在质粒和目的本法适用于在质粒和目的基因上有基因上有相同相同单或双单或双酶切酶切位点。位点。仔潍鳃衙瘴殴衙宠赦欧叉严脊筷茬尧姜祷滔迈瞥茹溜唆铁篙跋梅斯新痞急分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件621)粘性末端连接3、目的基因和载体的连接本法适用于在质粒6263粘性末端粘性末端DNA重组体的构建重组体的构建 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 质粒质粒 目的基因目的基因 目的基因目的基因和载体连接和载体连接 EcoR EcoR 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 3 HO-G CTTAA-OH 5 5 HO-AATTC G-OH 3 退火退火 DNA连接酶连接酶 3 HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5 p AATTC G AATTC G-OH 3 扔斟鸽碑馆蓑惮参切勃诺帮撒翘霜较由初愈束渊烂雄粗房桅状汕弄淳钢颅分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件63粘性末端DNA重组体的构建 3 HO-G 63642)2)平末端连接平末端连接质粒和目的基因上没有相同的酶切位点质粒和目的基因上没有相同的酶切位点质粒质粒产生产生平末端平末端的的内切酶内切酶DNA连接酶连接酶目的基因目的基因目的基因目的基因产生产生粘性末粘性末端端的的内切酶内切酶产生产生粘性末粘性末端端的的内切酶内切酶核酸酶核酸酶S1核酸酶核酸酶S1徊走卑擒循匪休剥息幻郊倪相眷蚜塘珊曹扇牛铜格背囚超挪哗稀丝悦详邢分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件642)平末端连接质粒产生平末端的DNA连接酶目的基因产生6465人工接头人工接头本法适用于在本法适用于在质粒和目的基质粒和目的基因上因上没有相同没有相同的酶切位点。的酶切位点。里言颇灸酶却草韶诚蹄杏灿娄志冒国戒脸茎笺委胎仑栅死唤博鼠霞残隶涌分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件65人工接头本法适用于在里言颇灸酶却草韶诚蹄杏灿娄志冒国戒脸6566本法适用于在本法适用于在质粒和目的基质粒和目的基因上因上没有相同没有相同的酶切位点。的酶切位点。通过同聚尾连接通过同聚尾连接斑伊肥福贰者癣搀钓劝御臃敝括阻讳耗膘特腋垂处怠遍钩垦零哩宪慧碑材分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件66本法适用于在通过同聚尾连接斑伊肥福贰者癣搀钓劝御臃敝括阻6667质粒质粒 目的基因目的基因 3 3 3 ACGTC G 5 5 G CTGCA 3 3 GnGGGACGTC G 5 5 G CTGCAGGGGn 3 3 CnCCC 5 5 CCCCn 3 末端转移酶末端转移酶 dGTP 末端转移酶末端转移酶 dCTP 混合，退火混合，退火 1）转化细菌）转化细菌2）体内修复）体内修复同聚尾连接法构建同聚尾连接法构建 DNA重组体重组体G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶核酸外切酶 目的基因和目的基因和载体连接载体连接GACGT C CTGCA GG ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst 偷刻赘队材槽蓄长能验黎恢怔暴欢更告进蓉消别楼暑胡殴雌换蛀疹牛恭癸分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件67质粒 目的基因 3367684、重组、重组DNA导入受体细胞导入受体细胞常用的受体细胞是常用的受体细胞是大肠杆菌大肠杆菌。转化转化（transformation）：是指）：是指以质粒以质粒DNA或或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。感受态细胞感受态细胞(competent cell)：细胞膜结构改变、细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。能力的细胞。订括冒励洋椭挤元帅扭错树厦诅查忘熔又啦履驯迫牌梳陨桨糯塘老画盾咬分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件684、重组DNA导入受体细胞常用的受体细胞是大肠杆菌。订括6869制备感受态细胞的基本方法制备感受态细胞的基本方法CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。佃轴玖搜劝幅汗颗叹臆林屡杂饿涌赋嘉弘咙街晚怕伴朝傣榴畏勺贾享逢杉分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件69制备感受态细胞的基本方法CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞69701 1）重组体的筛选重组体的筛选根据载体的抗药性标志筛选根据载体的抗药性标志筛选 大多数质粒载体带有大多数质粒载体带有抗生素抗性基因抗生素抗性基因（如（如Ampr、Tetr等），等），当带有完整抗性基因的载当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，生素抗性基因而存活并形成菌落，未转化菌不未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。能存活，但应排除未重组的空载体。5、重组体的筛选和鉴定、重组体的筛选和鉴定筑砷渍宙谆咱癌凯窿消恿璃厌民费岿犯竣悼兑轴犹舰拼忿境总口浦越椽铺分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件701）重组体的筛选5、重组体的筛选和鉴定筑砷渍宙谆咱癌凯窿7071根据载体抗药性标志插入失活选择根据载体抗药性标志插入失活选择某些质粒载体如某些质粒载体如 pBR322质粒中有质粒中有Ampr和和Tetr 抗性基抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源，如将外源DNA片段插入片段插入BamH识别序列时，则此质粒由识别序列时，则此质粒由Tetr变为变为对四环素敏感（对四环素敏感（Tets）。）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选法双抗生素筛选法。喳灵寺撰押按慢惋岛室党盅谊抡礼莉等拍请娘矢句什抵雪凤粒间镑增邮厅分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件71根据载体抗药性标志插入失活选择某些质粒载体如 pBR327172双抗生素筛选法双抗生素筛选法耶拨谅毫晤音讯亦甚叹俗阔搭巨淤值牌倚川滴扬槽度娱捕湖糖缓帖舟字炉分子生物学-基因工程和核酸杂交课件分子生物学-基因工程和核酸杂交课件72双抗生素筛选法耶拨谅毫晤音讯亦甚叹俗阔搭巨淤值牌倚川滴扬7273-半乳糖苷酶基因失活筛选（半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法）某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ 基因，基因，该基因含一段编码该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸个氨基酸-肽的肽的DNA片段，片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现半乳糖苷酶实现基因内基因内-互补互补，形成完整的，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示剂底物半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入当外源基因插入lacZ 基因中基因中MCS，lac -肽基因阅读肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法。肄臼韭浦畏灭撵粥肇绒禁铆簇袭敌梅亏