光谱分析技术课件

光谱分析技术光谱分析技术1.光谱分析技术1.光学导论光学导论光谱：复色光经色散系统分光后，按波长光谱：复色光经色散系统分光后，按波长（或频率）的大小依次排列的图像（或频率）的大小依次排列的图像2.光学导论光谱：复色光经色散系统分光后，按波长2.光学导论光学导论基于测量物质的光谱而建立起来基于测量物质的光谱而建立起来的分析方法称为光谱分析法的分析方法称为光谱分析法吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱分子光谱分子光谱原子光谱原子光谱3.光学导论基于测量物质的光谱而建立起来吸收光谱发射光谱分子光谱光学导论光学导论 吸收光谱吸收光谱 颜色的差异颜色的差异定性定性 颜色的深浅颜色的深浅定量定量4.光学导论 吸收光谱 颜色的差异定性4.光学导论光学导论发射光谱发射光谱化学发光化学发光热热/电激发发光电激发发光光致发光光致发光5.光学导论发射光谱化学发光热/电激发发光光致发光5.光学导论光学导论光谱分析法的准确分类光谱分析法的准确分类分子光谱分子光谱 吸收吸收（根据吸收波段不同细分）（根据吸收波段不同细分）紫外紫外-可见可见 红外红外 发射发射（根据发射原理不同细分）（根据发射原理不同细分）光致发光：光致发光：荧光荧光、磷光磷光 化学发光化学发光6.光学导论光谱分析法的准确分类分子光谱6.光学导论光学导论光谱分析法的准确分类光谱分析法的准确分类原子光谱原子光谱 吸收吸收 发射发射（根据发射原理不同细分）（根据发射原理不同细分）热热/电激发发光：电激发发光：发射发射 光致发光：光致发光：荧光荧光7.光学导论光谱分析法的准确分类原子光谱7.光学导论光学导论 光谱分析光谱分析光学分析！光学分析！光学分析光学分析=光谱分析光谱分析+非光谱分析非光谱分析 非光谱分析：基于物质与辐射的相互作非光谱分析：基于物质与辐射的相互作用，测量辐射的某些性质，如折射、用，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等变化的分散射、干涉、衍射和偏振等变化的分析方法析方法8.光学导论 光谱分析光学分析！光学分析=光谱分析+非光学导论光学导论光谱分析与非光谱分析的区别光谱分析与非光谱分析的区别光谱分析涉及光谱分析涉及“颜色颜色”“谱谱”“能量能量”的的变化变化非光谱分析涉及光的传播方向等物非光谱分析涉及光的传播方向等物理性质的变化，不涉及理性质的变化，不涉及“谱谱”9.光学导论光谱分析与非光谱分析的区别光谱分析涉及“颜色”“谱”光学导论光学导论光的本质：电磁辐射、波粒二象性光的本质：电磁辐射、波粒二象性波波波长波长、频率、频率、速度、速度=c(真空中的真空中的)=3 108 ms-1波长波长：相邻两个波峰或波谷间的直线距离：相邻两个波峰或波谷间的直线距离 单位可以是单位可以是nm、m、cm、m频率频率：在：在1秒时间内经过某点的波数秒时间内经过某点的波数 （即每秒内振动的次数）（即每秒内振动的次数）单位单位Hz(s-1)周期周期T：频率的倒数；波数：频率的倒数；波数：波长的倒数：波长的倒数10.光学导论光的本质：电磁辐射、波粒二象性波波长、频率、速度光学导论光学导论 射射线线x射射线线紫外紫外光光红外红外光光微微波波无线无线电波电波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光电磁波谱：将电磁辐射按照波长或频率的电磁波谱：将电磁辐射按照波长或频率的大小顺序排列起来即称为电磁波谱大小顺序排列起来即称为电磁波谱11.光学导论射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2 nm光学导论光学导论波波长长510-30.10.11010200200400名名称称射线射线x射线射线远紫外光远紫外光近紫外光近紫外光波波长长4007507501.01061.01061.01091.01091.01012名名称称可见光可见光红外光红外光微波微波无线电波无线电波12.光学导论波长510-30.110102002004光学导论光学导论粒粒光子：能量光子：能量E、普朗克常数、普朗克常数h、电子伏特、电子伏特eVh=6.626 10-34 Js1J=6.241 1018 eV=h=hc/当物质所吸收的电磁辐射能量能够满足该物质由低能态(基态)跃迁至高能态(激发态)，将产生吸收光谱当物质通过电、热或光等激发至激发态，再从激发态过渡到低能态或基态时，将产生发射光谱13.光学导论粒光子：能量E、普朗克常数h、电子伏特eV当物质所吸吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱14.吸收光谱发射光谱14.光学导论光学导论某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态需要需要20 eV，请问该分子吸收光的波长？，请问该分子吸收光的波长？解：解：1 eV=1.602 10-19 J 根据公式根据公式=hc/则则=hc/=（6.626 10-34 3 108）/（20 1.602 10-19）=0.62 10-7 m=62 nm15.光学导论某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态解：1 eV=紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法16.紫外-可见分光光度法16.什么是紫外-可见光谱远紫外光区：远紫外光区：10200 nm近紫外光区：近紫外光区：200400 nm UVC：200280 nm UVB：280320 nm UVA：320400 nm可见光区：可见光区：400780 nm红外光区：红外光区：780 nm1 mm17.什么是紫外-可见光谱远紫外光区：10200 nm17.什么是紫外-可见分光光度法基于基于分子外层价电子外层价电子跃迁跃迁产生的产生的在紫外在紫外-可见光谱区可见光谱区的的吸收光谱吸收光谱进行分析的一种常进行分析的一种常用的光谱分析方法。用的光谱分析方法。ultraviolet and visible(UV-vis)spectrophotometry18.什么是紫外-可见分光光度法基于分子外层价电子跃迁产生的在紫外基本原理分子的三种运动状态对应分子的三种运动状态对应有一定的能级。即在分子有一定的能级。即在分子中存在着：中存在着：电子能级电子能级 振动能级振动能级 转动能级转动能级这三种能级都是这三种能级都是量子化量子化的的19.基本原理分子的三种运动状态对应有一定的能级。即在分子中存在着分子能量的变化：分子能量的变化：E=Ee+Ev+Er Ee Ev Er基本原理20.分子能量的变化：基本原理20.基本原理分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：远红外光谱远红外光谱远红外光谱远红外光谱（转动光谱）（转动光谱）（转动光谱）（转动光谱）中红外光谱中红外光谱中红外光谱中红外光谱（振动光谱）（振动光谱）（振动光谱）（振动光谱）紫外紫外紫外紫外-可见光谱可见光谱可见光谱可见光谱（电子光谱）（电子光谱）（电子光谱）（电子光谱）21.基本原理分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：远红外光谱中基本原理带状光谱带状光谱发生电子跃迁时必然发生电子跃迁时必然要发生振动能级和转要发生振动能级和转动能级的跃迁，这使动能级的跃迁，这使得紫外得紫外-可见吸收光可见吸收光谱呈现带状谱呈现带状典型的紫外典型的紫外-可见吸收光谱图可见吸收光谱图吸收峰吸收峰最大吸收波长最大吸收波长(max)22.基本原理带状光谱典型的紫外-可见吸收光谱图吸收峰最大吸收波长基本原理价电子价电子电子电子 饱和的单键饱和的单键 电子电子 不饱和的双键、三键不饱和的双键、三键 n电子电子 孤对电子孤对电子分子中分子轨道有分子中分子轨道有成键轨道成键轨道与与反键轨道反键轨道：它们的能级高低为：它们的能级高低为：n*COHnpsH23.基本原理价电子*n非键轨道反键轨道反键轨道成键轨道 1.*跃迁：跃迁：饱和烃（饱和烃（C-C，C-H）能量很高，能量很高，200nm4.n*跃迁：跃迁：含杂原子不饱和基团（含杂原子不饱和基团（C N，C=O）能量最小，能量最小，200400nm基本原理24.1.*跃迁：基本原理24.影响紫外-可见吸收光谱的因素1 共轭效应共轭效应共轭体系越长，共轭体系越长，与与*的能量差越小，红移效应和的能量差越小，红移效应和增色效应越明显。增色效应越明显。2 立体化学效应立体化学效应空间位阻、跨环效应空间位阻、跨环效应3 溶剂的影响溶剂的影响溶剂效应溶剂效应4 体系体系pH的影响的影响Tips：由于溶剂对电子光谱图影响很由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或大，因此，在吸收光谱图上或数据表中数据表中必须注明所用的溶剂必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。必须正确选择溶剂。25.影响紫外-可见吸收光谱的因素1 共轭效应Tips：25.朗伯-比尔定律定量分析的基础当强度为当强度为I0的一定波长的单色入射的一定波长的单色入射光束通过装有均匀待测物的溶液介质光束通过装有均匀待测物的溶液介质时，该光束将被部分吸收时，该光束将被部分吸收Ia，部分反，部分反射射Ir，余下的则通过待测物的溶液，余下的则通过待测物的溶液It，即有：即有：I0=Ia+It+Ir26.朗伯-比尔定律定量分析的基础当强度为I0的一定波长的单色朗伯-比尔定律如果吸收介质是溶液（测定中一般如果吸收介质是溶液（测定中一般是溶液），式中反射光强度主要与器是溶液），式中反射光强度主要与器皿的性质及溶液的性质有关，在相同皿的性质及溶液的性质有关，在相同的测定条件下，这些因素是固定不变的测定条件下，这些因素是固定不变的，并且反射光强度一般很小。所以的，并且反射光强度一般很小。所以可忽略不记，这样：可忽略不记，这样：I0=Ia+It27.朗伯-比尔定律如果吸收介质是溶液（测定中一般是溶液），式中反朗伯-比尔定律透透光光率率透透光光率率表表示示透透过过光光强强度度与与入入射射光光强强度度的的比比值值，用用T来来表表示示，计计算式为：算式为：T=It/I0T常用百分比（常用百分比（%）表示。）表示。吸吸光光度度透透光光率率的的倒倒数数的的对对数数叫叫吸光度。用吸光度。用A表示：表示：A=-lgT=lg(I0/It)28.朗伯-比尔定律透光率透光率表示透过光强度与入射光强度的比朗伯-比尔定律29.朗伯-比尔定律29.当当用用一一束束强强度度为为I0的的单单色色光光垂垂直直通通过过厚厚度度为为b、吸吸光光物物质质浓浓度度为为c的的溶溶液液时时，溶溶液液的的吸吸光光度度正正比比于于溶溶液液的的厚厚度度b和溶液中吸光物质的浓度和溶液中吸光物质的浓度c的乘积的乘积。朗伯-比尔定律IoItbaA=lg(I0/It)=Kbc30.当用一束强度为I0的单色光垂直通过厚度为b、吸光物质浓度为c朗伯-比尔定律吸光系数：吸光系数：当溶液浓度当溶液浓度c的单位为的单位为g/L,溶液液层厚度溶液液层厚度b的单位为的单位为cm时，时，K叫叫“吸光系数吸光系数”，用，用a表表示，其单位为示，其单位为Lg-1cm-1摩尔吸光系数：摩尔吸光系数：当溶液浓度当溶液浓度c的单位为的单位为mol/L，液层厚度，液层厚度b的单位为的单位为cm时，时，K叫叫“摩尔吸光系数摩尔吸光系数”，用用表示，其单位为表示，其单位为Lmol-1cm-1 =aM (M为吸光物质的分子量为吸光物质的分子量)31.朗伯-比尔定律吸光系数：31.紫外-可见分光光度计岛津岛津 UV-245032.紫外-可见分光光度计岛津 UV-245032.工作原理基仪器结构框图工作原理基仪器结构框图光源光源光源光源碘碘碘碘钨钨钨钨灯灯灯灯氘氘氘氘灯灯灯灯单色器单色器单色器单色器测量池测量池测量池测量池参比池参比池参比池参比池样品池样品池样品池样品池光光光光电电电电倍倍倍倍增增增增管管管管数据处理和仪器控制数据处理和仪器控制数据处理和仪器控制数据处理和仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制紫外-可见分光光度计33.工作原理基仪器结构框图光源碘钨灯氘灯单色器测量池参比池样品池紫外-可见分光光度计单光束分光光度计单光束分光光度计34.紫外-可见分光光度计单光束分光光度计34.双光束分光光度计双光束分光光度计紫外-可见分光光度计35.双光束分光光度计紫外-可见分光光度计35.吸收池的材料吸收池的材料玻璃玻璃玻璃玻璃360 nm360 nm2.25 2.25 m m m mmm紫外-可见分光光度计36.吸收池的材料玻璃360 nm2.25 mm紫外-可见分光光度石英石英石英石英200 nm200 nm2.5 2.5 m m m mmm紫外-可见分光光度计37.石英200 nm2.5 mm紫外-可见分光光度计37.吸收池的形状吸收池的形状可拆卸圆形测量池可拆卸圆形测量池两面透光两面透光圆形测量池圆形测量池两面透光两面透光1cm 长方形测量池长方形测量池两面透光两面透光气体测量池气体测量池两面透光两面透光微量测量池微量测量池两面透光两面透光流动测量池流动测量池两面透光两面透光紫外-可见分光光度计38.吸收池的形状可拆卸圆形测量池圆形测量池1cm 长方形测量池气思考题为什么紫外可见分光光度计的最大吸收为什么紫外可见分光光度计的最大吸收值只能到值只能到3 3或者或者5 5，超过该值便会造成数，超过该值便会造成数据溢出？据溢出？39.思考题为什么紫外可见分光光度计的最大吸收值只能到3或者5，超 生物分子的紫外-可见吸收光谱糖糖紫外可见光谱在糖的分析中紫外可见光谱在糖的分析中,主要作定量检测。最主要作定量检测。最大吸收波长为大吸收波长为218 nm,多糖最大吸收波长为多糖最大吸收波长为206 nm。40.生物分子的紫外-可见吸收光谱糖紫外可见光谱在糖的分析中,生物分子的紫外-可见吸收光谱脂脂脂脂肪肪230240 nm,于有机溶剂中（如乙醇、正己烷等）41.生物分子的紫外-可见吸收光谱脂脂230240 nm,类类脂脂维生素维生素A326 nm于乙醇于乙醇番茄红素番茄红素番茄红素在溶剂正己烷中的谱图番茄红素在溶剂正己烷中的谱图番茄红素在溶剂石油醚中的谱图番茄红素在溶剂石油醚中的谱图生物分子的紫外-可见吸收光谱42.类维生素A326 nm于乙醇番茄红素番茄红素在溶剂正己烷中的 生物分子的紫外-可见吸收光谱蛋白质蛋白质Proteins in solution absorb ultraviolet light with absorbance maxima at 280 and 200 nm.Amino acids with aromatic rings are the primary reason for the absorbance peak at 280 nm.Peptide bonds are primarily responsible for the peak at 200 nm.酪氨酸酪氨酸 色氨酸色氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸43.生物分子的紫外-可见吸收光谱蛋白质Prot生物分子的紫外-可见吸收光谱核酸核酸嘌呤和嘧啶在嘌呤和嘧啶在250280 nm有强有强的吸收作用，综合起来在的吸收作用，综合起来在260 nm吸收值最大。吸收值最大。Tips：1.吸收强度：单核苷酸吸收强度：单核苷酸 单链单链DNA 双链双链DNA（增色效应、减色效应）（增色效应、减色效应）2.A260/A2801.82.0，DNA较纯较纯A260/A280 2.0，DNA样品中含有样品中含有RNA44.生物分子的紫外-可见吸收光谱核酸嘌呤和嘧啶在250280 微生物的紫外-可见吸收光谱600 nm测细菌等微生物的浊度，测细菌等微生物的浊度，用于估计细菌的生长情况。用于估计细菌的生长情况。比如，比如，得到的得到的OD600的数值如果在的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，的对数生长期，OD6003表明细表明细菌已经饱和等。菌已经饱和等。45.微生物的紫外-可见吸收光谱600 nm测细菌等微生物的浊度，核酸蛋白测定仪Eppendorf BioPhotometer plus 46.核酸蛋白测定仪Eppendorf BioPhotometerELISA原理图原理图 固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）酶标仪47.ELISA原理图YY 酶标记的抗原或抗酶标仪Tecan Infinite 200 Pro多功能酶标仪ELISA酶酶 底底 物物显色反显色反应应 测定波长测定波长 辣根过氧化物辣根过氧化物酶酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-连胺基连胺基-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405420-半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450420 48.酶标仪Tecan Infinite 200 Pro多功能酶分子荧光光谱分子荧光光谱49.分子荧光光谱49.什么是荧光光谱某些物质经紫外某些物质经紫外-可见光照射后，能立即放出能可见光照射后，能立即放出能量较低（亦即波长较长）的光量较低（亦即波长较长）的光光致发光光致发光。当照射停止后，如化合物的发射在当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停秒钟内停止，则称止，则称荧光荧光(fluorescence);超过此限度即称为超过此限度即称为磷光磷光(phosphorescence)。50.什么是荧光光谱某些物质经紫外-可见光照射后，能立即放出能量较什么是荧光光谱51.什么是荧光光谱51.基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2荧光发射：荧光发射：当分子处于单重激发态的最低振动能层时，当分子处于单重激发态的最低振动能层时，去活化的一种形式是以去活化的一种形式是以10-910-7s左右的短时间左右的短时间内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。52.基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2荧光激发光谱激发光谱激发光谱固定荧光发固定荧光发固定荧光发固定荧光发射波长，扫射波长，扫射波长，扫射波长，扫描激发波长描激发波长描激发波长描激发波长荧光激发光谱荧光激发光谱荧光激发光谱荧光激发光谱与紫外与紫外与紫外与紫外-可见吸可见吸可见吸可见吸收光谱类似，收光谱类似，收光谱类似，收光谱类似，WhyWhy？横坐标是入射光（激发光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度横坐标是入射光（激发光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度横坐标是入射光（激发光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度横坐标是入射光（激发光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度53.激发光谱激发光谱固定荧光发射波长，扫描激发波长荧光激发光谱与发射光谱发射光谱固定激发光固定激发光固定激发光固定激发光波长，扫描波长，扫描波长，扫描波长，扫描发射波长发射波长发射波长发射波长横坐标是发射光（荧光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度横坐标是发射光（荧光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度横坐标是发射光（荧光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度横坐标是发射光（荧光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度发射光谱(荧光光谱)54.发射光谱固定激发光波长，扫描发射波长横坐标是发射光（荧光）的55.55.2.2.2.2.三维荧光光谱三维荧光光谱三维荧光光谱三维荧光光谱I I F F f f f f(exex 、emem)蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长56.2.三维荧光光谱I F f(ex、em)蒽的激发I I F F f f f f(exex 、emem)蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长57.I F f(ex、em)蒽的发射光谱固定激发波长、蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 58.蒽的三维等高线光谱图 58.蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱59.蒽的三维等荧光强度光谱59.荧光量子产率（荧光效率）化合物化合物化合物化合物 F F0.10.10.290.290.460.460.600.600.520.52k kF F为荧光发射过程的速率常数，取决于荧光物质的分子结构；为荧光发射过程的速率常数，取决于荧光物质的分子结构；为荧光发射过程的速率常数，取决于荧光物质的分子结构；为荧光发射过程的速率常数，取决于荧光物质的分子结构；K Ki i为其他过程（如振动弛豫等）的速率常数总和，主要取决于为其他过程（如振动弛豫等）的速率常数总和，主要取决于为其他过程（如振动弛豫等）的速率常数总和，主要取决于为其他过程（如振动弛豫等）的速率常数总和，主要取决于化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。60.荧光量子产率（荧光效率）化合物F0.10.290.460.荧光与有机化合物的结构1.*是有机化合物产生荧光的主要跃迁是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。类型。2.产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光越容易产生。系，共轭体系越大，荧光越容易产生。产生荧光的条件产生荧光的条件61.荧光与有机化合物的结构1.*是有机化合物产生荧荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。3.刚性平面结构刚性平面结构荧光与有机化合物的结构62.荧光物质的刚性和平面性增加，3.刚性平面结构荧光与有机化合荧光强度与浓度的关系63.荧光强度与浓度的关系63.荧光的淬灭荧荧荧荧 光光光光 淬淬淬淬 灭灭灭灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现相互作用引起荧光强度降低或消失的现相互作用引起荧光强度降低或消失的现相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。象。象。象。荧光淬灭剂荧光淬灭剂荧光淬灭剂荧光淬灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基氧分子、硝基氧分子、硝基氧分子、硝基/羰基羰基羰基羰基/羧基化合物等）。羧基化合物等）。羧基化合物等）。羧基化合物等）。64.荧光的淬灭荧 光 淬 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相荧光能量共振转移（FRET）能量共振转移（能量共振转移（FRET）Fluorescence Resonance Energy Transfer相互作用的研究相互作用的研究65.荧光能量共振转移（FRET）能量共振转移（FRET）相互作用荧光分光光度计光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器问问问问题题题题：荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计与与与与紫紫紫紫外外外外-可可可可见见见见分分分分光光光光光光光光度计有何异同点？度计有何异同点？度计有何异同点？度计有何异同点？66.荧光分光光度计光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理光源紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器荧光分光光度计67.紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理荧光(磷荧光分光光度计Hitachi F-700068.荧光分光光度计Hitachi F-700068.样品池样品池1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收可见分光光度计的吸收可见分光光度计的吸收可见分光光度计的吸收池一样池一样池一样池一样2.2.吸收池的形状：吸收池的形状：吸收池的形状：吸收池的形状：紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光问题：问题：问题：问题：紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光可见分光光度计的吸收池与荧光分光可见分光光度计的吸收池与荧光分光可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？光度计的样品池有什么区别？光度计的样品池有什么区别？光度计的样品池有什么区别？荧光分光光度计69.样品池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计测量池测量池(吸收池吸收池)荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池I0ItI0ItIF,p荧光分光光度计70.紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计I0It荧光光谱的应用芳芳芳芳香香香香族族族族化化化化合合合合物物物物存存存存在在在在共共共共轭轭轭轭的的的的不不不不饱饱饱饱和和和和体体体体系系系系，是是是是有有有有机机机机化化化化合合合合物物物物荧荧荧荧光光光光测测测测定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。1.有机化合物的鉴定有机化合物的鉴定待测物待测物待测物待测物试剂试剂试剂试剂 exexmaxmax ememmaxmax测定范围测定范围测定范围测定范围 ppm ppm丙三醇丙三醇丙三醇丙三醇苯胺苯胺苯胺苯胺紫外紫外紫外紫外蓝色蓝色蓝色蓝色0.120.12糠醛糠醛糠醛糠醛蒽酮蒽酮蒽酮蒽酮4654655055051.5151.515氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶3153154254250.01500.0150维生素维生素维生素维生素A A无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇345345490490020020蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质曙红丫曙红丫曙红丫曙红丫紫外紫外紫外紫外5405400.0660.066肾上腺素肾上腺素肾上腺素肾上腺素乙二胺乙二胺乙二胺乙二胺4204205255250.0010.020.0010.02 青霉素青霉素青霉素青霉素-甲氧基甲氧基甲氧基甲氧基-氯氯氯氯-(-(-氨氨氨氨乙基乙基乙基乙基)-)-氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽4204205005000.06250.6250.06250.625玻璃酸梅玻璃酸梅玻璃酸梅玻璃酸梅3-3-乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚3953954704700.0010.0330.0010.033胍基丁胺胍基丁胺胍基丁胺胍基丁胺邻苯二醛邻苯二醛邻苯二醛邻苯二醛3653654704700.0550.055四氧嘧啶四氧嘧啶四氧嘧啶四氧嘧啶苯二胺苯二胺苯二胺苯二胺3653654854851010-4-471.荧光光谱的应用芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光光谱的应用2.分子标记与追踪分子标记与追踪在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物体进行标记。将荧光分子通过化学方法体进行标记。将荧光分子通过化学方法“挂在挂在”其他其他“不可见不可见”的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家利用的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家利用这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子从黑这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子从黑暗的显微镜视场中暗的显微镜视场中“揪出来揪出来”。量子点量子点（无机纳米粒子）（无机纳米粒子）荧光染料荧光染料（有机小分子）（有机小分子）荧光蛋白荧光蛋白（蛋白质）（蛋白质）72.荧光光谱的应用2.分子标记与追踪在生物学研究中，科学家们荧光光谱的应用2.1荧光在核酸研究中的应用荧光在核酸研究中的应用电泳电泳Midori Green Ethidiumbromide 73.荧光光谱的应用2.1荧光在核酸研究中的应用电泳Midor荧光光谱的应用SYBR Green I2.2荧光在核酸研究中的应用荧光在核酸研究中的应用实时定量荧光实时定量荧光PCR（RT-qPCR）74.荧光光谱的应用SYBR Green I2.2荧光在核酸研究中2.3荧光在核酸研究中的应用荧光在核酸研究中的应用分子信标分子信标荧光光谱的应用Taq-Man75.2.3荧光在核酸研究中的应用分子信标荧光光谱的应用Taq-荧光光谱的应用2.4荧光在蛋白质研究中的应用荧光在蛋白质研究中的应用几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光，且受微环境变化几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光，且受微环境变化几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光，且受微环境变化几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光，且受微环境变化的影响，因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象。的影响，因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象。的影响，因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象。的影响，因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象。76.荧光光谱的应用2.4荧光在蛋白质研究中的应用几种含苯基侧链的荧光光谱的应用2.5 ELISA中的中的“荧光荧光”77.荧光光谱的应用2.5 ELISA中的“荧光”77.荧光光谱的应用下村修等人于下村修等人于1962年在一种学名为年在一种学名为Aequorea victoria的水母中发现能发的水母中发现能发光的蛋白光的蛋白绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）。分子质）。分子质量为量为26kDa，由，由238个氨基酸构成。个氨基酸构成。2008年诺贝尔化学奖授予了下村修以及另外两位科学家（美国年诺贝尔化学奖授予了下村修以及另外两位科学家（美国科学家马丁科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健），以表彰他们发沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健），以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。现和发展了绿色荧光蛋白质技术。78.荧光光谱的应用下村修等人于1962年在一种学名为Aequor细细胞胞标标记记荧光光谱的应用79.细荧光光谱的应用79.活活体体标标记记荧光光谱的应用80.活荧光光谱的应用80.1.传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性光毒性”，因，因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞，在性非常弱，非常适合用于标记活细胞，在GFP出现之前出现之前这完全不可想象。这完全不可想象。2.荧光蛋白与靶蛋白的连接可直接通过二者表达基因的荧光蛋白与靶蛋白的连接可直接通过二者表达基因的融合，转导至宿主细胞，在宿主细胞中翻译表达出靶蛋融合，转导至宿主细胞，在宿主细胞中翻译表达出靶蛋白与荧光蛋白的复合体。白与荧光蛋白的复合体。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光光谱的应用81.1.传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导可以发出各种颜色可以发出各种颜色荧光的荧光蛋白荧光的荧光蛋白荧光光谱的应用82.可以发出各种颜色荧光的荧光蛋白荧光光谱的应用82.荧光光谱的应用量子点(quatum dots)Cd/Pb/Zn-S/Se/Te83.荧光光谱的应用量子点(quatum dots)83.1.1.量子点的荧光强度比常用的有机荧光材料高几十倍。量子点的荧光强度比常用的有机荧光材料高几十倍。2.2.高稳定性，有机荧光材料会遭遇高稳定性，有机荧光材料会遭遇光漂白光漂白，长时间激发，长时间激发后造成荧光效率的不断降低；量子点则可承受长时间高后造成荧光效率的不断降低；量子点则可承受长时间高强度的激发。强度的激发。3.3.量子点的激发光范围广，而发射光范围窄。量子点的激发光范围广，而发射光范围窄。（这意味着什么？）（这意味着什么？）量子点量子点荧光光谱的应用当需要同时荧光标记几个不同靶标时，量子点较广的激发范围当需要同时荧光标记几个不同靶标时，量子点较广的激发范围意味着可以在同一激发光波长下同时激发不同的量子点。意味着可以在同一激发光波长下同时激发不同的量子点。而窄范围的发射光范围则使得不同量子点发出的不同颜色的荧而窄范围的发射光范围则使得不同量子点发出的不同颜色的荧光更易鉴别和测量，减少了干扰。光更易鉴别和测量，减少了干扰。84.1.量子点的荧光强度比常用的有机荧光材料高几十倍。量子点荧光个人观点供参考，欢迎讨论！个人观点供参考，欢迎讨论！