分子病理学方法优质课件

分子病理学方法分子病理学方法分子病理学方法1分子病理学方法优质课件21.探讨疾病发生分子机制的基本思路探讨疾病发生分子机制的基本思路探讨基因结构的改变与疾病发生的关系探讨基因结构的改变与疾病发生的关系探讨基因表达的改变与疾病发生的关系探讨基因表达的改变与疾病发生的关系蛋白质水平蛋白质水平核酸水平核酸水平寻找疾病相关基因寻找疾病相关基因1.探讨疾病发生分子机制的基本思路探讨基因结构的改变与疾病发32.分子克隆及分子探针制作技术分子克隆及分子探针制作技术限制性内切酶限制性内切酶质粒载体质粒载体分子克隆的步骤分子克隆的步骤分子探针的制作分子探针的制作常用标记物及显示系统常用标记物及显示系统2.分子克隆及分子探针制作技术限制性内切酶4核酸酶核酸外切酶核酸内切酶核酸酶核酸外切酶5限制性内切酶限制性内切酶限限制制性性内内切切酶酶是是核核酸酸酶酶的的一一种种，核核酸酸酶酶通通常常是是指能够水解磷酸二脂键裂解指能够水解磷酸二脂键裂解DNA或或RNA的酶。的酶。有有些些核核酸酸酶酶对对DNA的的裂裂解解是是非非特特异异的的，也也就就是是说它们在核酸分子内的切割是随机的。说它们在核酸分子内的切割是随机的。而而另另一一些些酶酶却却能能识识别别DNA分分子子的的某某些些特特定定序序列列对对DNA分分子子有有选选择择的的切切割割，这这种种酶酶就就称称为为限限制制性内切核酸酶（限制酶）。性内切核酸酶（限制酶）。限制性内切酶限制性内切酶是核酸酶的一种，核酸酶通常是指能够水6回文结构回文结构：双链DNA中含有的结构相同、方向相反的序列。例如：5GGTACC3 3CCATGG5回文结构回文结构：双链DNA中含有的结构相同、方向相反的序列7分子病理学方法优质课件8限制性内切酶限制性内切酶（Eco R）GAATTCCTTAAG5NNNNG AATT CNNNN33NNNNC TTAA GNNNN5 5NNNNG pAATTCNNNN33NNNNCTTAAp GNNNN5限制性内切酶（Eco R）GAATTC9限制性内切酶限制性内切酶（Hae）GGCCCCGG5NNNNNGG CCNNNNN33NNNNNCC GGNNNNN55NNNNNGG pCCNNNNN33NNNNNCCp GGNNNNN5限制性内切酶（Hae）GGCC10 5 G A A T T C 3 Restriction Enzyme:EcoRI3 C T T A A G 5 Cleavage5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 Sticky endsDNA Ligases3 T T A A P5 OH+3 T T A A P5 OH3 C G P5 OH3 T A C G P5 OHACBComplementary ends base-pair5 A A T T 3 3 T T A A 5 OHPPOH+Unpaired B and C5 A A T T 3 3 T T A A 5 DNA ligasesMechanism 5 G A A T T C11分子病理学方法优质课件12分子病理学方法优质课件13分子病理学方法优质课件14分子病理学方法优质课件15分子病理学方法优质课件16质粒载体质粒载体质粒的基本特性质粒的基本特性复制能力复制能力选择标记选择标记常用的质粒载体常用的质粒载体质粒载体发展的三个阶段质粒载体发展的三个阶段常用的质粒载体常用的质粒载体质粒载体质粒的基本特性17Plasmids in E.coli cellFrom a lysed E.coli cell:The E.coli genome consists of a single chromosome which is a double-stranded circular DNA molecule with 4,639,221 base pairs.E.coli also contain smaller circular DNA molecules that are free in the cytosol(plamids);see white arrows in figure.Plasmids in E.coli cellFrom a 18分子病理学方法优质课件19分子病理学方法优质课件20分子病理学方法优质课件21分子病理学方法优质课件22分子克隆的步骤分子克隆的步骤分子克隆的步骤23分子克隆的基本步骤归纳起来为5个字：分、切、接、转、筛。分：克隆目的基因。切：限制内切酶切开质粒和目的基因。接:将目的基因连接到载体中，形成重组质粒。转：将重组质粒转化入感受态细菌中。筛：筛选重组成功的转化子。分子克隆的基本步骤归纳起来为5个字：分、切、接、转、筛。24分子病理学方法优质课件25分子克隆流程图分子克隆流程图分子克隆流程图26分子探针的制作分子探针的制作分子探针的制作27缺口平移法缺口平移法 Nick translation缺口平移法 Nick translation28随机引物法随机引物法 Random primed DNA labeling随机引物法 Random primed DNA label29体外转录法体外转录法 In vitro transcription体外转录法 In vitro transcription30末端标记法末端标记法 Endlabeling末端标记法 Endlabeling31常用标记物及显示系统常用标记物及显示系统同位素同位素生物素生物素 Biotin地高辛地高辛 Digoxigenin常用标记物及显示系统同位素32同同 位位 素素 32P半衰期半衰期14.3天天 35S半衰期半衰期87.4天天 125I 半衰期半衰期59.7天天 3H半衰期半衰期12.35年年同 位 素 32P半衰期14.3天33生生 物物 素素 生生物物素素是是最最早早用用来来替替代代同同位位素素的的非非放放射射性性标标记记物物，其其分分子子量量小小（244 Da），可可 与与 亲亲 合合 素素（avidin）特异结合）特异结合。生 物 素 34地地 高高 辛辛 异异 羟羟 基基 洋洋 地地 黄黄 毒毒 苷苷 配配 基基（Digoxigenin）又又称称地地高高辛辛，是是近近几几年年被被广广泛泛采采用用的的非非放放射射性性标标记记物物之之一一。DIG是是从从植植物物洋洋地地黄黄中中提提取取的的半半抗抗原原类类固固醇醇物物质质，通通过过连连接接臂臂（Linker-arm）与与dUTP或或UTP连连接接，形形成成Dig-dUTP或或Dig-UTP复复合合物物，利利用用各各种种标标记记技技术术可可将将Dig-dUTP引引入入新新合合成成的的探探针针DNA链中。链中。地 高 辛 异羟基洋地黄毒苷配基（Digoxigenin）35分子病理学方法优质课件363.分子杂交技术分子杂交技术分子杂交的基本策略分子杂交的基本策略常用分子杂交技术常用分子杂交技术3.分子杂交技术分子杂交的基本策略37分子杂交的基本策略分子杂交的基本策略宽松杂交宽松杂交严格漂洗严格漂洗分子杂交的基本策略38Tm值的计算值的计算Tm()=16.6 log M+0.41(%G+C)+81.5 820/L 1.2(100-h)M the monovalent cation concentration%G+C the base compositionL the duplex length(bp)h the percent interstrand homology(0.7 per one per cent Formamide)Tm值的计算Tm()=16.6 log M+0.39最佳杂交温度的设定最佳杂交温度的设定Th=Tm 25（for DNA probe）Th=Tm 15（for RNA probe）最佳杂交温度的设定Th=Tm 25（for DN40常用分子杂交技术常用分子杂交技术Southern杂交杂交(Southern blot hybridization)Northern杂交杂交(Northern blot hybridization)斑点杂交斑点杂交(Dot blot hybridization)原位杂交原位杂交(In situ hybridization)常用分子杂交技术Southern杂交(Southern b41Southern blot hybridizationSouthern blot hybridization42Southern blot hybridizationSouthern blot hybridization43Northern blot hybridizationNorthern blot hybridization44Northern blot hybridizationNorthern blot hybridization45Dot blot hybridizationDot blot hybridization46Dot blot hybridizationDot blot hybridization47In situ hybridizationIn situ hybridization48 端粒原位杂交端粒原位杂交 端粒原位杂交49In situ hybridizationIn situ hybridization50In situ hybridizationIn situ hybridization51In situ hybridizationIn situ hybridization52In situ hybridizationIn situ hybridization53分子病理学方法优质课件54荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in s55 细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。Fluorescence in situ hybridization（FISH）细胞遗传学技术Fluorescence in situ h56用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交原理用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中57FISH技术的特点技术的特点操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合，操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合，可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析方法敏感，能迅速得到结果，方法敏感，能迅速得到结果，2424小时就可以完成检测小时就可以完成检测标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测FISH技术的特点操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合58centromeretelomere subtelomerelocusspecificwhole chromosome paintCSPCSP探针：染色探针：染色体着丝粒探针体着丝粒探针GLPGLP探针：位点探针：位点特异性探针特异性探针 WPPWPP探针：全染探针：全染色体或染色体区色体或染色体区域特异性探针域特异性探针FISH探针的种类探针的种类centromeretelomere subtelomer59操作流程简图操作流程简图制片制片 预处理预处理 FISH结果分析结果分析 破坏细胞膜利于探针破坏细胞膜利于探针 杂交。杂交。蛋白酶消化、蛋白酶消化、HCl处理处理 变性变性 杂交杂交 洗涤洗涤 复染复染操作流程简图制片 预处理 FISH结果分析 破坏细胞膜利60A.无须计数的大簇无须计数的大簇团信号（高度扩增）团信号（高度扩增）B.颗粒状信号（颗粒状信号（R10，高，高度扩增）度扩增）C.须计数的颗粒须计数的颗粒状信号（状信号（R=3.5，低度扩增）低度扩增）ACBHer-2基因扩增状况基因扩增状况A.无须计数的大簇团信号（高度扩增）B.颗粒状信号（R61Her-2基因无扩增情况基因无扩增情况红信号数红信号数2，同时绿信号，同时绿信号非整倍体非整倍体R2，同时绿信号非整倍体R30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比图 40100住院号：177319浸润性导管癌级IHC：+FISH：呈：呈簇团状高度扩增簇团状高度扩增10030%的肿瘤细胞全部免疫组化（3+）与FISH对比图 463免疫组化（2+）与FISH对比图 1.30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色40住院号：175465浸润性导管癌级IHC：+FISH：Ratio5，中度，中度扩增扩增100免疫组化（2+）与FISH对比图 1.30%的肿瘤细胞全部64免疫组化（2+）与FISH对比图 2.30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色40100住院号：176921浸润性导管癌级IHC：+FISH：Ratio1.45，无扩增，无扩增免疫组化（2+）与FISH对比图 2.30%的肿瘤细胞全部6530%的肿瘤细胞弱的着色免疫组化（1+）与FISH对比图140100住院号：175689浸润性导管癌级IHC：+FISH：Ratio1.62，无扩增，无扩增30%的肿瘤细胞弱的着色免疫组化（1+）与FISH对比图166免疫组化（1+）与FISH对比图240100住院号：175895浸润性导管癌级IHC：+FISH：簇状扩：簇状扩增增30%的肿瘤细胞弱的着色免疫组化（1+）与FISH对比图240100住院号：17674.基因扩增技术基因扩增技术-PCR4.基因扩增技术-PCR68分子病理学方法优质课件695.原位原位PCR技术技术-In situ PCR5.原位PCR技术-In situ PCR70分子病理学方法优质课件716.蛋白质印迹技术蛋白质印迹技术-Western Blot6.蛋白质印迹技术-Western Blot72分子病理学方法优质课件73分子病理学方法优质课件74分子病理学方法优质课件75分子病理学方法优质课件76再再 见见 再 见 77