疟原虫镜检技术培训课件

疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术分子生物学、血清学技术发展迅猛分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是但是确诊确诊疟疾的疟疾的“金标准金标准”仍然是血液显微仍然是血液显微镜检查镜检查显微镜检查是唯一可鉴别显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方种疟原虫的方法法厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准疟疾诊断的金标准实验室技术实验室技术2疟原虫镜检技术厚薄血膜的制作厚薄血膜的制作 镜检技术镜检技术血片制作血片制作制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄3疟原虫镜检技术取血部位和血量取血部位和血量 取血方法取血方法 采血部位：采血部位：耳耳垂或无名指，通常在耳垂垂或无名指，通常在耳垂取血，先用取血，先用75%75%酒精棉球酒精棉球消毒取血部位，待酒精干消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米血。厚血膜血量约一粒米大小。大小。4疟原虫镜检技术厚血膜厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直圈，涂成直径径0.81厘米大小圆形厚血膜。厘米大小圆形厚血膜。薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方当远的地方.将采血玻片将采血玻片(推片推片)的边缘紧贴载玻片使的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开血液沿边缘散开(如图示如图示).5疟原虫镜检技术正确的推片姿势正确的推片姿势6疟原虫镜检技术标准的疟疾厚薄血膜片位置标准的疟疾厚薄血膜片位置7疟原虫镜检技术各种不同的疟疾血片涂制法：各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片标准血片门诊发热病人血片门诊发热病人血片居民普查血片居民普查血片8疟原虫镜检技术厚薄血膜的标准厚薄血膜的标准 厚血膜血量适宜，不宜过多或过少厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 薄薄血膜平整血膜平整,无皱折和空泡无皱折和空泡.红细胞单层排列红细胞单层排列9疟原虫镜检技术血片染色血片染色 两种染色方法两种染色方法:吉氏染色法吉氏染色法瑞氏染色法瑞氏染色法 常用吉氏染色法常用吉氏染色法10疟原虫镜检技术吉氏染液吉氏染液(原液原液)的配置的配置 吉氏染粉吉氏染粉 (Azure B type)5g 甘油甘油 (纯纯)250ml 甲醇甲醇(纯纯)250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，直然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤经过滤即可使用。保存即可使用。保存时间越长染色效果越好。时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于整个染色液配制时间不能少于5个小时个小时11疟原虫镜检技术稀释吉氏原液稀释吉氏原液原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。于厚薄血片染色。吸取母液时，不要晃动瓶子吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物以免沉淀物泛起影响染色效果泛起影响染色效果.12疟原虫镜检技术操作操作1（快染）（快染）量筒内量量筒内量2ml缓冲液或净水，直缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾，清水细缓冲洗，晾干镜检。干镜检。操作操作2 (慢染慢染)在量筒内量在量筒内量2ml蒸馏水或净水，蒸馏水或净水，再再滴加滴加吉氏原液吉氏原液4滴，混匀，滴，混匀，滴入待染标本上，滴入待染标本上，染色染色3040min。清水细缓冲洗，。清水细缓冲洗，晾干镜检。晾干镜检。吉氏染液浓度吉氏染液浓度门诊染色门诊染色13疟原虫镜检技术将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染吉氏染液稀释液（液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。成批血片染色成批血片染色14疟原虫镜检技术质量好的染色质量好的染色:显微镜下核呈红色显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色胞浆呈蓝色 如果血片偏红如果血片偏红,说明染液偏酸性说明染液偏酸性如果血片偏蓝如果血片偏蓝,说明染液偏硷性说明染液偏硷性外观吉氏染色血片外观吉氏染色血片偏偏 酸酸偏偏 碱碱标标 准准15疟原虫镜检技术染色过程染色过程血片平置于染色板上血片平置于染色板上用吸管吸取已稀释的吉氏液约用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血于厚薄血膜上，染色膜上，染色10 min清水细缓轻轻冲去染液清水细缓轻轻冲去染液置玻片于插板上，自然晾干置玻片于插板上，自然晾干血片干燥后血片干燥后,用甲醇固定薄血膜用甲醇固定薄血膜16疟原虫镜检技术血片制作注意事项血片制作注意事项 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果镜检结果 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 血片充分干燥后染色，血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚清水细缓冲洗。防止厚血膜脱落血膜脱落.配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量高镜检质量17疟原虫镜检技术疟原虫密度计算疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法：计算疟原虫密度的三种方法：白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法(厚血膜厚血膜 WHO)半定量计数法半定量计数法 (厚血膜厚血膜)红细胞感染密度计算法红细胞感染密度计算法(薄血膜薄血膜)18疟原虫镜检技术 在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，记录记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数500 1 000 个。个。白细胞疟原虫计算公式：白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数疟原虫数 计数的白细胞数计数的白细胞数 患者每微升血白细胞患者每微升血白细胞数数=疟原虫数疟原虫数/l血。血。如果不知患者的白细胞数，则每微升血以如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白个白细胞计数细胞计数(国际标准国际标准)。白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫密度计数法19疟原虫镜检技术白细胞疟原虫计数法举例白细胞疟原虫计数法举例假设计数假设计数200 WBC中有中有35个疟原虫，在不知患个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细个白细 胞计数胞计数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（疟原虫数）（疟原虫数）200（计数的白细胞）（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数）（每微升血白细胞数）=1400/l答：该患者的疟原虫密度为答：该患者的疟原虫密度为1400/l。20疟原虫镜检技术用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。量分析。国内常用。此方法将密度分为国内常用。此方法将密度分为6级：级：1.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数个以内，记录实际数字字2.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个个以上，但平均每个视野不到视野不到1个虫，记录个虫，记录“少少”3.平均每个视野平均每个视野15个虫，记录个虫，记录“”4.平均每个视野平均每个视野610个虫，记录个虫，记录“+”5.平均每个视野平均每个视野11100个虫，记录个虫，记录“+”6.平均每个视野平均每个视野100个虫以上，记录个虫以上，记录“+”。半定量计数法半定量计数法21疟原虫镜检技术薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野排列整齐密集，无重迭的视野镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为虫期，不要笼统地记录为Pv或或Pf。红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）22疟原虫镜检技术显微镜下（显微镜下（10目镜目镜100100油镜油镜）选择红细胞排列整齐密集，无重）选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（迭的视野（约约300红细胞红细胞/视野）视野）红细胞疟原虫密度按以下公式计算：红细胞疟原虫密度按以下公式计算：1.红细胞疟原虫感染率（红细胞疟原虫感染率（%）计算）计算 红细胞原虫感染率（红细胞原虫感染率（%）=疟原虫数疟原虫数 计数的红细胞数计数的红细胞数X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算红细胞疟原虫感染密度计算 红细胞疟原虫密度红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率红细胞原虫感染率X红细胞数红细胞数/每微升血每微升血 （男性男性500万个万个/l；女性；女性450万个万个/l）3.如果能见到疟原虫，但是记数如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为没有感染红细胞，那么设定感染率为 红细胞感染率计算法（薄血膜）红细胞感染率计算法（薄血膜）23疟原虫镜检技术如何确定疟原虫血片为阴性如何确定疟原虫血片为阴性 检查全部厚血膜未查见疟原虫检查全部厚血膜未查见疟原虫 最少检查最少检查100个厚血膜油镜视野未查见个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫疟原虫24疟原虫镜检技术人类四种疟原虫的人类四种疟原虫的 基基 本特征本特征25疟原虫镜检技术感染人的疟原虫有四种感染人的疟原虫有四种:恶性疟原虫恶性疟原虫 P.falciparum 间日疟原虫间日疟原虫 P.vivax三日疟原虫三日疟原虫 P.malariae 卵形疟原虫卵形疟原虫 P.ovale 26疟原虫镜检技术恶性疟恶性疟 P.falciparum 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 我国流行区域为云南省和海南省我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状感染后出现急性症状,不及时治疗可危及不及时治疗可危及生命生命27疟原虫镜检技术间日疟间日疟 P.vivax 间日疟原虫分布于我国大部分地区间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中主要是中部地区部地区 病程良性病程良性,有复发有复发 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见带非洲，特别是西非则很少见28疟原虫镜检技术三日疟三日疟 P.malariae 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布及印度部分地区，呈片状、块状分布三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告无复发无复发卵形疟卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫又称蛋形疟原虫,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告南亚有散在报告在我国已基本消灭在我国已基本消灭症状与间日疟相似症状与间日疟相似,有复发有复发29疟原虫镜检技术 四种疟原虫的四种疟原虫的 形态特征形态特征 30疟原虫镜检技术1.红细胞不涨大红细胞不涨大2.环状体钎细环状体钎细,一个红一个红细胞内可有几个环细胞内可有几个环状体状体,环状体内可有环状体内可有2个核个核 3.环状体可贴在红细环状体可贴在红细胞边缘胞边缘 4.血片中没有其他发血片中没有其他发育期滋养体育期滋养体 5.配子体呈新月形或配子体呈新月形或腊肠形腊肠形6.成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含6-32个裂殖子个裂殖子7.可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（P.falciparum）鉴定）鉴定 要点要点31疟原虫镜检技术1.红细胞通常涨红细胞通常涨大大 2.薛氏点明显薛氏点明显 3.成熟环状体粗成熟环状体粗大大4.滋养体胞浆有滋养体胞浆有阿米巴样伪足阿米巴样伪足5.血片中可见各血片中可见各期的原虫形态期的原虫形态6.成熟裂殖体约成熟裂殖体约含含12-24个裂殖个裂殖子子 间日疟（间日疟（P.vivax）鉴定要点）鉴定要点32疟原虫镜检技术1.红细胞不红细胞不涨大或略涨大或略小小2.环状体可环状体可呈方形呈方形3.胞浆不活胞浆不活跃呈带状跃呈带状形形 4.成熟滋养成熟滋养体呈菊花体呈菊花状状,内含内含6-12个裂殖个裂殖子子 5.核可能出核可能出现在环状现在环状体边缘体边缘 三日疟（三日疟（P.malariae）诊断要点）诊断要点33疟原虫镜检技术卵形疟（卵形疟（P.ovale）诊断要点）诊断要点1.红细胞涨大红细胞涨大 2.常见慧星状常见慧星状(也称齿轮状也称齿轮状)3.环粗大环粗大 4.薛氏点明显薛氏点明显 5.成熟滋养体类成熟滋养体类似三日疟原虫似三日疟原虫但更粗大但更粗大6.成熟裂殖体约成熟裂殖体约含含4-12个裂殖个裂殖子子 34疟原虫镜检技术种种周周 围围 血血中中 发发 育育阶段阶段红细胞形态红细胞形态疟原虫形态疟原虫形态大小大小点彩点彩胞浆胞浆疟色素疟色素裂殖子数裂殖子数恶恶性性疟疟原原虫虫环状体环状体配子体配子体正常正常常常 见见茂茂 氏氏点点环环状状体体钎钎细细，常见个核常见个核粗粗黑黑，配配子子体中明显体中明显6-32平平均均=10-24间间日日疟疟原原虫虫各各 期期 滋滋养体养体裂裂 殖殖 体体和和配子体配子体涨涨大大,可可达达正正常常 的的 1.5-2 倍倍薛薛 氏氏点点 可可出现出现阿阿米米巴巴样样滋滋养养体体，浅浅蓝蓝色色，活泼活泼金棕色金棕色不明显不明显12-24平均平均=16卵卵形形疟疟原原虫虫各期滋各期滋养体养体裂殖体裂殖体涨涨大大,可可达达正正常常的的 1.25-1.5倍倍薛薛 氏氏点点 可可出现出现卵卵圆圆形形滋滋养养体体，蓝蓝色色较较深深，核核较大较大深棕色深棕色明显明显4-12平均平均=8三三日日疟疟原原虫虫各期滋各期滋养体养体裂殖体裂殖体和和配子体配子体正常正常西西 门门氏氏 点点少见少见圆圆形形，蓝蓝色色深深，核核紧紧缩缩，滋滋养养体带状体带状深棕色，粗深棕色，粗明显明显6-12平平 均均=8呈菊花状呈菊花状35疟原虫镜检技术镜检示教镜检示教以下血片采自现症病例以下血片采自现症病例36疟原虫镜检技术This is a thin film from a 27 year old female backpacker,with a recent history of trekking through Northern Thailand and high fever.A typical Plasmodium falciparum presentation.Numerous fine ring forms Double chromatin dots Marginal forms Red cells are not enlarged37疟原虫镜检技术A thin film from a 22 year old male holidaying in Lombok(Indonesia)one month previously.Intermittent fevers since returning.A typical Plasmodium vivax presentationSalient features are:Developing and thick(signet)ring forms Enlarged red cells 38疟原虫镜检技术Recent travel in Africa.Pyrexia of unknown origin.A typical Plasmodium ovale presentationDeveloping form of plasmodium Comet-like red cells Enlarged red cell 39疟原虫镜检技术Female patient,arrived from Brazil two weeks previously.Flu like symptoms since arrival.A typical Plasmodium malariae presentationBroad band form of plasmodium Red cells not enlarged40疟原虫镜检技术This is a thick film prepared from a 32 year old male recently returned from Vietnam.Numerous ring form of Plasmodium can be seen(as indicated by the arrows).Note size of neutrophils(for comparison).The only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present.Thin films would have to be examined for species identification.41疟原虫镜检技术读片练习读片练习42疟原虫镜检技术2.Intermittent fever;arrived from India 2 months ago.43疟原虫镜检技术3.History of round the world safari including S.America,Asia and Africa.General malaise.44疟原虫镜检技术4.Unspecified overseas travel.Presented with temperature 38.4C 45疟原虫镜检技术5.Male recently returned to Australia after backpacking through Asia.History of flu like symptoms.46疟原虫镜检技术7.Aches and pains,with fever.?Glandular Fever,?malaria.48疟原虫镜检技术12.Businessman;history of extensive overseas travel.Has had frequent bouts of virus infections.49疟原虫镜检技术14.50 year old male patient presented with fever after holidaying in Viet Nam.50疟原虫镜检技术18.Recent trip to Southern India-headaches and vaguely unwell.51疟原虫镜检技术19.Patient has been holidaying in the Dominican Republic,now feverish.52疟原虫镜检技术20.Unwell and feverish.53疟原虫镜检技术21.A member of the UN forces in East Timor.Presented with high temperature.54疟原虫镜检技术55疟原虫镜检技术56疟原虫镜检技术57疟原虫镜检技术58疟原虫镜检技术59疟原虫镜检技术60疟原虫镜检技术61疟原虫镜检技术62疟原虫镜检技术