环境生物技术课件

环境生物技术环境生物技术1、纪律是管理关系的形式。阿法纳西耶夫2、改革如果不讲纪律，就难以成功。3、道德行为训练，不是通过语言影响，而是让儿童练习良好道德行为，克服懒惰、轻率、不守纪律、颓废等不良行为。4、学校没有纪律便如磨房里没有水。夸美纽斯5、教导儿童服从真理、服从集体，养成儿童自觉的纪律性，这是儿童道德教育最重要的部分。陈鹤琴检测毒性的手段：动物检测、微生物检测检测毒性的手段：动物检测、微生物检测l动物检测急性毒性：研究化学物质大剂量一次染毒动物检测急性毒性：研究化学物质大剂量一次染毒或或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。急性毒性试验类型急性毒性试验类型l哺乳动物急性毒性试验哺乳动物急性毒性试验水生生物急性毒性试验水生生物急性毒性试验蚯蚓急性毒性试验蚯蚓急性毒性试验观察时间为观察时间为2周，以半数致死浓度周，以半数致死浓度LC50表示。表示。微生物检测选择一项或几项生理指标为指征，根据微生物检测选择一项或几项生理指标为指征，根据代谢物影响或抑制这些指征的程度来判断毒性的强代谢物影响或抑制这些指征的程度来判断毒性的强度。度。评价指标多为评价指标多为EC50或或IC50一、发光细菌一、发光细菌细菌生物发光抑制试验细菌生物发光抑制试验细菌生物发光的生物学机制：细菌生物发光的生物学机制：FMNH2+RCHO+O2 FMN+H2O+RCOOH+光光420-670nm的可见光的可见光细菌生物发光抑制试验是国际标准化组织认可，也列细菌生物发光抑制试验是国际标准化组织认可，也列为我国水质评价的国家标准方法。为我国水质评价的国家标准方法。第一节第一节 污染物生物毒性的微生物监测方法污染物生物毒性的微生物监测方法细菌荧光素酶细菌荧光素酶（一）试验原理（一）试验原理毒物毒物细细菌菌荧荧光素光素酶酶活性或活性或细细胞呼吸受到抑制胞呼吸受到抑制发发光能力减弱（比例关系）光能力减弱（比例关系）光光电测电测定装置定装置测测出出发发光光强强度的度的变变化化菌株：菌株：应应用最多的是明亮用最多的是明亮发发光杆菌光杆菌美国贝克曼美国贝克曼(Beckman)公司制造的微量毒性分析公司制造的微量毒性分析仪就是一种发光细菌检测仪，操作极为方便，测仪就是一种发光细菌检测仪，操作极为方便，测定一个样品不到半小时，所得结果与鱼类毒性试定一个样品不到半小时，所得结果与鱼类毒性试验一致。（验一致。（Microtox）,国际通用，使用最为广泛国际通用，使用最为广泛的微生物学检测方法。的微生物学检测方法。冻干菌种：筛选、培养的明亮发光杆菌，真空冷冻干菌种：筛选、培养的明亮发光杆菌，真空冷冻干燥（加保护剂，缓冲物质，冻干燥（加保护剂，缓冲物质，NaCl等），等），-2025C保存。保存。（二）试验方法（二）试验方法菌种复苏：菌种复苏：2%NaCl，悬液，悬液样品处理：系列稀释，调样品处理：系列稀释，调pH6-8，渗透压，渗透压2%NaCl毒性测定：测试管加入样品和菌液，以苯酚作阳毒性测定：测试管加入样品和菌液，以苯酚作阳性有机毒物对照，以性有机毒物对照，以ZnSO4.7H2O作阳性无机毒作阳性无机毒物对照，蒸馏水为阴性对照。物对照，蒸馏水为阴性对照。15oC培养培养5min或或15min。光量抑制百分率：。光量抑制百分率：（阴性对照组指标值（阴性对照组指标值-实验组指标值）实验组指标值）阴性对照组指标值阴性对照组指标值 通过回归方程计算通过回归方程计算IR为为50%时的样品剂量，时的样品剂量，IC50质量控制：同一剂量平行管间的发光强度差异值小于质量控制：同一剂量平行管间的发光强度差异值小于20%，苯酚和硫酸锌的，苯酚和硫酸锌的IC50有一定范围。有一定范围。x100%IR=（三）方法评价（三）方法评价与传统鱼类与传统鱼类96h毒性试验相比具有良好的一致性。毒性试验相比具有良好的一致性。1991年年Diane对对100种化学物质的毒性测试结果表种化学物质的毒性测试结果表明两者的相关系数达明两者的相关系数达0.85。可以根据细菌生物发光试验的发光抑制率进行毒可以根据细菌生物发光试验的发光抑制率进行毒性分级。性分级。各实验室间结果的重现性好各实验室间结果的重现性好可用于生物传感器分析可用于生物传感器分析国际标准化组织将该方法作为检测化合物或废水毒国际标准化组织将该方法作为检测化合物或废水毒性的标准方法之一（性的标准方法之一（ISO 9509）。）。（一）试验原理（一）试验原理毒性污染物抑制硝化作用的酶类，导致对底物的毒性污染物抑制硝化作用的酶类，导致对底物的利用能力或产物的生成量下降。通过测定底物或利用能力或产物的生成量下降。通过测定底物或产物的变化来检测毒性作用的程度。产物的变化来检测毒性作用的程度。利用亚硝化单胞菌或硝化杆菌属，或用活性污泥。利用亚硝化单胞菌或硝化杆菌属，或用活性污泥。二、硝化细菌二、硝化细菌硝化作用抑制试验硝化作用抑制试验（二）试验方法（以硝化杆菌属为例）（二）试验方法（以硝化杆菌属为例）增殖细菌至增殖细菌至108个个/ml。加入菌液、加入菌液、NaNO2溶液及样品（不同浓度），以溶液及样品（不同浓度），以蒸馏水为对照。蒸馏水为对照。培养（培养（30oC4h)、检测、检测NO2-比较样品组与对照组硝化作用强度，可得比较样品组与对照组硝化作用强度，可得IC50与与Microtox灵敏度相当，与鱼类毒性试验结果的相灵敏度相当，与鱼类毒性试验结果的相关性为关性为0.45。美国国家环保局认可的毒性测试方法。美国国家环保局认可的毒性测试方法。（一）实验原理（一）实验原理藻类对水体污染反应十分敏感。毒物抑制光合作用，藻类对水体污染反应十分敏感。毒物抑制光合作用，藻类生长量减少。常用硅藻、栅藻、小球藻。藻类生长量减少。常用硅藻、栅藻、小球藻。（二）试验方法（二）试验方法繁殖藻种繁殖藻种配制培养基，灭菌。加入待测物，接种。配制培养基，灭菌。加入待测物，接种。培养。恒温（培养。恒温（28-30C），光照。），光照。测定生长量（或其他指标），绘制生长曲线。测定生长量（或其他指标），绘制生长曲线。计算最大生长率。（计算最大生长率。（max）（三）结果与评价（三）结果与评价三、藻类三、藻类生长抑制试验生长抑制试验又称为微型生物群落监测法，广泛用于水环境的毒性又称为微型生物群落监测法，广泛用于水环境的毒性监测与评价。微生物包括细菌、真菌、原生动物、藻监测与评价。微生物包括细菌、真菌、原生动物、藻类及小型轮虫。国家标准：水质微型生物群落监测类及小型轮虫。国家标准：水质微型生物群落监测 PFU法法(GB/T 12990-91)（一）试验原理（一）试验原理正常条件下自然水环境的微型生物群落种类、分布、正常条件下自然水环境的微型生物群落种类、分布、构成有一定规律，外界环境因素的干扰下，群落的平构成有一定规律，外界环境因素的干扰下，群落的平衡被破坏，结构特征也随之变化。通过分析微型群落衡被破坏，结构特征也随之变化。通过分析微型群落结构和功能参数结构和功能参数，判断水环境的质量状况或污染物质，判断水环境的质量状况或污染物质的毒性特征。检测结果有很强的生态学意义。的毒性特征。检测结果有很强的生态学意义。PFU法法是在群落水平上的是在群落水平上的,是较物种水平、种群水平更高的是较物种水平、种群水平更高的,因此它能提供较大的环境真实性。因此它能提供较大的环境真实性。四、原生动物四、原生动物微尺度群落级毒性试验微尺度群落级毒性试验最常用的方法是最常用的方法是PFU（聚氨酯泡沫塑料块）法。（聚氨酯泡沫塑料块）法。聚氨酯泡沫塑料块的孔径聚氨酯泡沫塑料块的孔径100-150um，微型生物可，微型生物可以进入其内，能收集到以进入其内，能收集到85%的种类，具有环境真实的种类，具有环境真实性。一定时间内，原生动物种群构成会达到平衡，性。一定时间内，原生动物种群构成会达到平衡，而有害物会破坏这一平衡，比较试验组和对照组的而有害物会破坏这一平衡，比较试验组和对照组的群落结构和功能参数，即可评价水体质量与污染程群落结构和功能参数，即可评价水体质量与污染程度。度。（二）试验方法与评价（二）试验方法与评价把把PFU分别浸入对照水体和调查水体，不同时段后，分别浸入对照水体和调查水体，不同时段后，挤出液体，对原生动物鉴定和计数。挤出液体，对原生动物鉴定和计数。PFU中微型生物的结构与功能参数：中微型生物的结构与功能参数：异养性指数（异养性指数（HI）=微型生物灰份量微型生物灰份量/叶绿素叶绿素a量量原生动物群落多样性指数（原生动物群落多样性指数（d）=（S-1）/lnN(S为原生动物种类数，为原生动物种类数，N为为10ml挤出液中原生动挤出液中原生动物个数）物个数）T90：达到达到90%Seq所需的时间（所需的时间（Seq：平衡时原：平衡时原生动物种数）生动物种数）G:原生动物群集速度常数原生动物群集速度常数评价：污染程度高，评价：污染程度高，S、d降低降低严重污染的水域中，原生动物的群集速度亦很低，严重污染的水域中，原生动物的群集速度亦很低，随着水质的清洁程度提高，原生动物的群集速度随着水质的清洁程度提高，原生动物的群集速度亦迅速提高。溢流口亦迅速提高。溢流口24小时内仅群集了小时内仅群集了3种耐污鞭种耐污鞭毛虫。而通惠河沿岸的站点，如毛虫。而通惠河沿岸的站点，如24小时内，双桥小时内，双桥站点群集了站点群集了19种，东关站点群集了种，东关站点群集了33种，对照站种，对照站点温榆河群集了点温榆河群集了37种。种。检测待测物的毒性（种类损伤法）：检测待测物的毒性（种类损伤法）：清洁水体中浸泡的清洁水体中浸泡的PFU挤出液（接近平衡期的、挤出液（接近平衡期的、未成熟的群落。未成熟群落要比成熟群落对污染未成熟的群落。未成熟群落要比成熟群落对污染的毒性反应敏感得多）混合不同浓度的待测物，的毒性反应敏感得多）混合不同浓度的待测物，培养一定时间后镜检原生动物种数，计算待测物培养一定时间后镜检原生动物种数，计算待测物影响原生动物种数的影响原生动物种数的EC50（median effect concentration，半数效应浓度半数效应浓度）（一）脱氢酶活性试验（一）脱氢酶活性试验原理：原理：脱氢酶作用下，无色的氯化三苯基四氮唑脱氢酶作用下，无色的氯化三苯基四氮唑（TTC）受氢后变为红色的三苯甲基（）受氢后变为红色的三苯甲基（TF），分），分光光度计光光度计485nm处比色，通过标准曲线求的处比色，通过标准曲线求的TF产产生量，计算脱氢酶活性。可以得出待测物的生量，计算脱氢酶活性。可以得出待测物的EC50.五、活性污泥毒性检测法五、活性污泥毒性检测法（二）呼吸抑制试验（二）呼吸抑制试验有毒物抑制微生物呼吸作用，使耗氧量和有毒物抑制微生物呼吸作用，使耗氧量和CO2的的产生量下降。检测化合物和废水毒性。产生量下降。检测化合物和废水毒性。瓦勃氏呼吸仪测定消耗的氧量：瓦勃氏呼吸仪测定消耗的氧量：碱溶液吸收碱溶液吸收CO2，反应瓶中压力的降低完全是氧消反应瓶中压力的降低完全是氧消耗的结果。耗的结果。溶解氧电极测定耗氧量：溶解氧电极测定耗氧量：瓶塞上的溶解氧电极记录溶解氧；瓶塞上的溶解氧电极记录溶解氧；相对耗氧速率相对耗氧速率=污泥的呼吸好氧速率污泥的呼吸好氧速率/内源性呼吸内源性呼吸好氧速率好氧速率x100%优点：优点：简便简便灵敏灵敏快速快速经济经济缺点：缺点：检测结果有一定范围的变异性；检测结果有一定范围的变异性；不能完全代替哺乳动物毒性试验。不能完全代替哺乳动物毒性试验。适用：适用：快速筛选快速筛选大批量样品大批量样品用细菌生物发光抑制试验，用细菌生物发光抑制试验，废水处理影响效果用活性污泥毒性检测法，废水处理影响效果用活性污泥毒性检测法，评价水质的生态学特征用微尺度群落级毒性试验。评价水质的生态学特征用微尺度群落级毒性试验。微生物学检测方法的评价微生物学检测方法的评价一、基因突变试验一、基因突变试验（一）鼠伤寒沙门氏菌（一）鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验哺乳动物微粒体试验（Ames试验）试验）1、原理、原理野生型野生型his+营养缺陷性营养缺陷性his+致突变物可使该菌的基因发生回复突变。致突变物可使该菌的基因发生回复突变。美国美国Ames教授教授1975年正式建立的方法年正式建立的方法第二节第二节 污染物致突变性的微生物检测方法污染物致突变性的微生物检测方法正向突变正向突变回复突变回复突变试验菌株：试验菌株：曾推荐的曾推荐的5株：株：TA1535、TA1537、TA1538、TA98、TA10083年修订之后：年修订之后：TA97、TA98、TA100、TA102 赋予其他附加突变：赋予其他附加突变：uvrB突变：失去突变：失去DNA切割修复能力，敏感性增加；切割修复能力，敏感性增加；rfa突变：脂多糖屏障却失，大分子透入；突变：脂多糖屏障却失，大分子透入；组入某些质粒提高回变能力。组入某些质粒提高回变能力。后来一套后来一套6株组氨酸缺陷型菌株：株组氨酸缺陷型菌株：TA7001、TA7002、TA7003、TA7004、TA7005、TA7006.方便检出碱基的方便检出碱基的变异。变异。每次试验可使用一种或几种菌株，只要有任何一株发生大量每次试验可使用一种或几种菌株，只要有任何一株发生大量的回复突变，即为阳性结果。的回复突变，即为阳性结果。哺乳动物微粒体酶：哺乳动物微粒体酶：微粒体中含有混合功能的氧化酶系；微粒体中含有混合功能的氧化酶系；有降解作用：把化学物变成低毒或无毒物排出；有降解作用：把化学物变成低毒或无毒物排出；有激活作用：使化学物变成具有亲电子性质，导有激活作用：使化学物变成具有亲电子性质，导致毒性增强，成为致突变物或致癌物。致毒性增强，成为致突变物或致癌物。哺乳动物微粒体酶系统（简称哺乳动物微粒体酶系统（简称S9混合液）：从肝混合液）：从肝匀浆中制取；匀浆中制取；加入加入S9混合液使体外测试条件更接近于人体内代混合液使体外测试条件更接近于人体内代谢条件。谢条件。2、试验方法、试验方法纸片点试法：纸片点试法：基础培养基基础培养基+菌液菌液+S9+表层培养基表层培养基纸片蘸取待测物至于培养皿中间纸片蘸取待测物至于培养皿中间培养培养37oC,48h,观察结果。观察结果。长出密集菌落的为阳性，只长出少量散在菌落的为长出密集菌落的为阳性，只长出少量散在菌落的为阴性。阴性。平皿掺入法：最高的诱发回变菌落数为自发回变菌平皿掺入法：最高的诱发回变菌落数为自发回变菌落数的落数的2倍或以上属阳性结果。倍或以上属阳性结果。3、应用与评价、应用与评价175种已知致癌物进行试验，发现种已知致癌物进行试验，发现157种为阳性，种为阳性，阳性吻合率阳性吻合率90%；阴性吻合率；阴性吻合率87%。初筛报警手段。初筛报警手段。已被我国食品安全毒理学评价程序、农药登记毒已被我国食品安全毒理学评价程序、农药登记毒理学试验方法、新药毒理学研究指导原则、化妆理学试验方法、新药毒理学研究指导原则、化妆品安全性评价程序和方法等列为评价致突变性的品安全性评价程序和方法等列为评价致突变性的必做试验。必做试验。1、原理、原理致突变物使发光细菌致突变物使发光细菌暗变异菌株暗变异菌株突变，恢复一定突变，恢复一定的发光能力。的发光能力。菌株：蝠鱼发光杆菌的暗变异菌株菌株：蝠鱼发光杆菌的暗变异菌株SD-18和和RC93、费氏弧菌的暗变异株费氏弧菌的暗变异株Pf-13、明亮发光杆菌、明亮发光杆菌T3小种小种的暗变异株的暗变异株T9171。2、方法、方法细菌复苏、增殖、分装测试管培养（细菌复苏、增殖、分装测试管培养（20C、）、）、24h后开始测发光强度，以后每隔后开始测发光强度，以后每隔3-4天测定一次。天测定一次。发光强度为对照管发光强度的发光强度为对照管发光强度的3倍或以上即为阳性。倍或以上即为阳性。（二）发光细菌试验（一）（一）SOS显色试验显色试验SOS修复是指修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种状态时所诱导的一种DNA修复修复方式，修复结果只方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repair），使细胞有较高的突变率。），使细胞有较高的突变率。致突变物致突变物DNA损伤损伤 细细菌菌SOS修复修复测测定定SOS修复能力修复能力（通（通过过大大肠肠杆菌杆菌PQ37菌株的菌株的显显色反色反应应）二、DNA损伤修复试验PQ37菌株的特点：操菌株的特点：操纵纵子融合方法构建的，将子融合方法构建的，将SOS反反应应网网络络中的中的sfiA基因与基因与编码编码-半乳糖苷半乳糖苷酶酶的基因的基因lacZlacZ融合在一起（融合在一起（报报告基因），告基因），-半乳半乳糖苷糖苷酶酶通通过过XgalXgal培养基和培养基和 ONPG ONPG培养基来培养基来显显色，色，分分别产别产生生蓝蓝色和黄色。色和黄色。定性定性试验试验：Xgal Xgal培养基平板，培养基平板，纸纸片点片点试试,出出现蓝现蓝色色素即色色素即为为阳性。阳性。定量定量试验试验：液体培养基（含待：液体培养基（含待测样测样品）品）,37C,2h,37C,2h,加入加入ONPGONPG显显色一定程度，色一定程度，终终止反止反应应，420nm420nm处测处测吸光度。吸光度。R R大于大于2 2且具且具有有剂剂量关系，量关系，则为则为阳性阳性结结果。果。应应用用评评价：敏感性与准确性与价：敏感性与准确性与AmesAmes试验试验相相当，某些方面当，某些方面优优于后者，可以相互于后者，可以相互补补充。充。（二）聚合（二）聚合酶酶缺陷型菌株缺陷型菌株试验试验致癌物使致癌物使DNA受受损损，聚合，聚合酶酶缺陷型菌株在缺陷型菌株在DNA受受损损后无修复能力，不能生存，抑菌圈出后无修复能力，不能生存，抑菌圈出现现。E.coli P3478(polA-),对对照照为为野生型菌株野生型菌株E.coli W3110(polA+)。点点试试法、混菌法，分法、混菌法，分别别出出现现抑菌圈和有空白的生抑菌圈和有空白的生长线长线（抑菌（抑菌现现象）。象）。对对直接突直接突变变作用的作用的烷烷化化剂较为剂较为敏感，敏感，对对需要代需要代谢谢活化的化合物不敏感。活化的化合物不敏感。（三）重（三）重组组缺陷型菌株缺陷型菌株试验试验重重组组缺陷型菌株失去修复能力，缺陷型菌株失去修复能力，致癌性物致癌性物质质使使DNA受受损损，重，重组组缺陷型菌株不能生缺陷型菌株不能生长长，原理与聚合原理与聚合酶酶缺陷型菌株缺陷型菌株试验试验相似。相似。枯草芽枯草芽孢孢杆菌杆菌H17(recA+）对对照，全照，全线线生生长长枯草芽枯草芽孢孢杆菌杆菌M45(recA-）试验试验，抑菌，抑菌现现象象（四）溶源性（四）溶源性细细菌菌试验试验原理：原噬菌体原理：原噬菌体 诱变剂诱变剂 烈性噬菌体（噬菌体烈性噬菌体（噬菌体诱导诱导现现象）象）裂解非溶源性裂解非溶源性细细菌（作菌（作为为指示菌）指示菌）固体培养基固体培养基上出上出现现噬菌斑噬菌斑菌株：菌株：E.colik12(E.colik12()溶源性溶源性 E.colik12(S)E.colik12(S)指示菌指示菌方法：同方法：同时时将两菌株接种于一个培养基平板上，加将两菌株接种于一个培养基平板上，加入受入受试试物，物，经经一夜培养，一夜培养，观观察噬菌斑。察噬菌斑。三、三、DNA重组试验重组试验致突变物致突变物DNADNA损伤损伤 整个基因整个基因组组的有的有丝丝分裂重分裂重组组增增强强 酿酿酒酵母酒酵母D7D7的异点等位基因的异点等位基因(trp5-(trp5-12/trp5-27)12/trp5-27)突突变变体（体（trp-)trp-)转变为转变为野生型野生型四、微生物致突变试验与致癌物的确定四、微生物致突变试验与致癌物的确定大多数致癌物具有致突变作用，非致癌物不具有大多数致癌物具有致突变作用，非致癌物不具有致突变作用。致突变作用。致癌可能性致癌可能性需要一组试验配套进行检测，包含需要一组试验配套进行检测，包含5种遗传学终点种遗传学终点试验：完整性的改变，重排或交换，碱基试验：完整性的改变，重排或交换，碱基序列改变（突变），染色体畸变，染色体分离改序列改变（突变），染色体畸变，染色体分离改变。变。粗筛、报警，快速、灵敏、经济。粗筛、报警，快速、灵敏、经济。END16、业余生活要有意义，不要越轨。华盛顿17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。罗素贝克18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。马云19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。雷锋20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。布尔沃