第18章-色谱法导论课件

色谱法导论色谱法导论第第18章章chapter 18Introduction for chromatography主要内容主要内容18.1 概论概论18.2 色谱法基础知识、基本概念和术语色谱法基础知识、基本概念和术语18.3 溶质分布谱带展宽溶质分布谱带展宽色谱动力学基础理论色谱动力学基础理论18.4 组分分离组分分离基本分离方程基本分离方程18.5 色谱方法的选择性和分离操作条件优化色谱方法的选择性和分离操作条件优化18.6 色谱定性分析色谱定性分析18.7 色谱定量分析色谱定量分析18-1 概论概论“色谱法色谱法”名称的由来名称的由来石油醚石油醚(流动相流动相)碳酸钙碳酸钙(固定相固定相)色色谱谱带带 利用混合物不同组分在利用混合物不同组分在固定相固定相和和流流动相动相中中分配系数分配系数（或（或吸附系数吸附系数、渗透性渗透性等）的差异，使不同组分在作相对运动等）的差异，使不同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，实现分离的分的两相中进行反复分配，实现分离的分析方法。析方法。色谱法色谱法 色谱法的色谱法的分类分类根据流动相的根据流动相的物态物态分为分为气相色谱气相色谱(GC)液相色谱液相色谱(LC)超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)根据固定相的根据固定相的外形外形分分柱色谱柱色谱平板色谱平板色谱平平 板板 色色 谱谱根据分离根据分离机理机理分为分为吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子交换色谱离子交换色谱排阻色谱排阻色谱亲和色谱亲和色谱18.2 色谱法基础知识、基本概念和术语色谱法基础知识、基本概念和术语色谱图色谱图(一）保留值一）保留值定性分析依据定性分析依据1、死时间死时间t0流动相流动相平均线速度平均线速度柱长柱长2、保留时间保留时间tr3、校正校正(调整调整)保保留时间留时间4、死体积死体积V05、保留体积保留体积Vr6、校正校正(调整调整)保留体积保留体积F为柱出口处的载气流量，单位：为柱出口处的载气流量，单位：m L/min7、相对保留值相对保留值ri,s8、分离因子分离因子 （选择性因子）（选择性因子）(二）峰高与峰面积二）峰高与峰面积定量分析依据定量分析依据（三）区域宽度（三）区域宽度柱效柱效峰底宽度峰底宽度W：半峰宽半峰宽W1/2：标准偏差标准偏差：峰高峰高0.607倍处峰宽度的一半倍处峰宽度的一半(四）色谱流出曲线上的信息四）色谱流出曲线上的信息1.根据色谱峰的根据色谱峰的个数个数，可判断样品所含的最少组份数。，可判断样品所含的最少组份数。2.根据色谱峰的根据色谱峰的保留值保留值，可以进行定性分析。，可以进行定性分析。3.根据色谱峰的根据色谱峰的面积面积或峰或峰高高,可以进行定量分析可以进行定量分析4.色谱峰的保留值及其色谱峰的保留值及其区域宽度区域宽度是评价色谱柱分离效是评价色谱柱分离效 能的依据能的依据5.色谱峰两峰间的色谱峰两峰间的距离距离，是评价固定相，是评价固定相(或流动相或流动相)选选 择是否合适的依据。择是否合适的依据。组分保留时间为何不同？组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？色谱峰为何变宽？18.3 溶质分布谱带展宽溶质分布谱带展宽 色谱动力学基础理论色谱动力学基础理论(一）分配系数一）分配系数K和分配比和分配比k组分在组分在固定相固定相中的中的浓度浓度组分在组分在流动相流动相中的中的浓度浓度1.分配系数分配系数 组分一定组分一定时，时，K主要取决于固定相性质主要取决于固定相性质 （选择适宜的固定相可改善分离效果）（选择适宜的固定相可改善分离效果）试样中的试样中的各组分各组分具有具有不同的不同的K值值是分离的基础是分离的基础 组分及固定相一定时，温度增加，组分及固定相一定时，温度增加，K减小减小影响影响K的因素的因素 固定相固定相温度温度2.分配比分配比(容量因子容量因子)k组分在固定相中的组分在固定相中的质量质量 组分在流动相中的组分在流动相中的质量质量 K与与k都是与组分及固定相的都是与组分及固定相的热力学热力学性质有关的性质有关的 常数常数。（。（K、k与温度、压力有关，与浓度无关与温度、压力有关，与浓度无关）K与与k k都是衡量色谱柱对组分都是衡量色谱柱对组分保留能力保留能力的参数，的参数，数值越大，该组分的保留时间越长数值越大，该组分的保留时间越长。k k可直接从色谱图上获得可直接从色谱图上获得。3.分配系数分配系数K与分配比与分配比k的关系的关系4.分离因子分离因子与与分配系数分配系数K及及分配比分配比k的关系的关系(二）色谱理论二）色谱理论1.塔板理论塔板理论柱分离效能指标评价柱分离效能指标评价:热力学理论热力学理论*k=1 塔板号塔板号载气体气体积数数01234柱出口柱出口01234567891011121314151610.50.250.1250.0630.0320.0160.0080.0040.0020.00100000000.50.50.3750.250.1570.0950.0560.0320.0180.0100.0050.0020.001000000.250.3750.3750.3130.2350.1650.1110.0720.0450.0280.0160.0100.0050.0020.0010.000.1250.250.3130.3130.2740.2200.1660.0940.0700.0490.0330.0220.0140.00800000.0630.1570.2350.2740.2740.2470.2070.1510.1100.080.0570.0400.027000000.0320.0790.1180.1380.1380.1240.1040.0760.0560.0400.0280.020随着流动相前进，组随着流动相前进，组分前进，但进度和组分前进，但进度和组分的分的k k有关有关理论塔板数理论塔板数理理论论塔塔板板高高度度色谱柱长度色谱柱长度柱效能柱效能指标指标色色谱谱柱柱长长度度L一一定定时时，塔塔板板数数n越越大大（塔塔板板高高度度 H 越越小小），被被测测组组分分在在柱柱内内被被分分配配的的次次数数越越多多，柱柱效效能能越越高，所得色谱峰越窄（高，所得色谱峰越窄（W）。）。不不同同物物质质在在同同一一色色谱谱柱柱上上的的分分配配系系数数不不同同，用用有有效效塔塔板板数数和和有有效效塔塔板板高高度度作作为为衡衡量量柱柱效效能能的的指指标时，应标时，应指明测定物质指明测定物质。一般用。一般用苯苯评价柱效能。评价柱效能。有效塔板数有效塔板数有效板高有效板高有时理论计算的有时理论计算的n很大，而实际分离效果并不好，因为很大，而实际分离效果并不好，因为t0并没有并没有参加分配参加分配2.速率理论速率理论影响柱效的因素影响柱效的因素:动力学理论动力学理论流动相流动相线速度线速度范弟姆特（范弟姆特（Van Deemter）方程）方程塔板理论可以定量描述柱效能，以塔板理论可以定量描述柱效能，以热力学热力学讨论了色讨论了色谱分离本质，但无法说明谱分离本质，但无法说明影响影响H的因素及峰扩宽的因素及峰扩宽W1)涡流扩散项涡流扩散项A（多径扩散多径扩散）固定相颗粒越小，填充的越均匀固定相颗粒越小，填充的越均匀A越小，越小，H越小，柱效越高，色谱峰越窄越小，柱效越高，色谱峰越窄：填充不：填充不均匀均匀因子因子dp：固定相：固定相颗粒粒直径直径试样随载气在固定相颗试样随载气在固定相颗粒间形成粒间形成涡流涡流，分子以，分子以不同长度路径流出。不同长度路径流出。2)分子扩散项分子扩散项 B/u(纵向扩散项纵向扩散项)流动相流动相柱内谱带构型柱内谱带构型相应的响应信号相应的响应信号产生原因：产生原因：浓度梯度浓度梯度影响因素：影响因素：流动相流速；流动相流速；气体扩散系数气体扩散系数：扩散路径散路径弯曲弯曲因子因子Dg：组分分扩散系数散系数进样后试样在载气进样后试样在载气中产生浓度差，引中产生浓度差，引起起浓差扩散浓差扩散3)传质阻力项传质阻力项Cu 气相传质阻力：气相传质阻力：固定相颗粒越小，载气分子量越小固定相颗粒越小，载气分子量越小气相传质阻力越小气相传质阻力越小1.分子从分子从气相迁移至固定相气相迁移至固定相表面受表面受到的气相到的气相传质阻力传质阻力2.2.固定相固定相（液相）扩散回气相（液相）扩散回气相界界面受到的面受到的传质阻力传质阻力 液相传质阻力液相传质阻力固定液粘度及液膜厚度越小固定液粘度及液膜厚度越小液相传质阻力越小液相传质阻力越小df：固定相：固定相液膜厚度液膜厚度Dl：组分在固定液中：组分在固定液中的的扩散系数扩散系数4)流动相流动相线速度线速度u对板高的影响对板高的影响实际操作时，常采用实际操作时，常采用略高于略高于u uoptopt的流速，的流速，而缩短分析时间而缩短分析时间例例：已已知知一一色色谱谱柱柱在在某某温温度度下下的的速速率率方方程程的的A=0.08 cm;B=0.65 cm2/s;C=0.003 s,求求最最佳佳线线速速度度u和和最最小小塔板高塔板高H.解解:H=A+B/u+Cu 欲求欲求 u最佳和最佳和H最小，要对速率方程微分，即最小，要对速率方程微分，即 dH/dud(A+B/u+Cu)/du-B/u2+C0 最佳线速最佳线速:u最佳最佳(B/C)1/2 (0.65/0.003)1/214.7 cm/s 最小板高最小板高:H最小最小A+B/u+Cu 0.17 cm分离度（分辨率）分离度（分辨率）：tr2,tr1:组分组分2和组分和组分1的保留时间的保留时间W2,W1:组分组分2和组分和组分1的峰底宽度的峰底宽度18.4 组分分离组分分离基本分离方程基本分离方程R=1.5完全分离完全分离基本色谱分离方程式基本色谱分离方程式对于难分离相邻两组分：对于难分离相邻两组分：W1W2W分离因子分离因子=tr2/tr1分配比分配比k=tr2/t0综合了热力学和动综合了热力学和动力学因素，定量描力学因素，定量描述柱总分离效能述柱总分离效能分离度与分离度与k、n及及 的关系的关系 k从从1增加到增加到3，R增加到原来的增加到原来的1.5倍倍 (k:2-7)n增加到原来的增加到原来的3倍倍，R增加到原来的增加到原来的1.7倍倍 从从1.01增加到增加到1.1，增加约增加约9，R增加到增加到 原来的原来的9倍倍结论结论选择合适的固定相选择合适的固定相(流动相流动相)以增加以增加 是改善分离度最有效的方法是改善分离度最有效的方法例例：有有一一根根 l m长长的的柱柱子子，分分离离组组分分1和和2得得到到如如下下色色谱谱图图。图图中中横横坐坐标标l为为记记录录笔笔走走纸纸距距离离。若若欲欲得得到到 R=1.2的的分分离离度度，有有效效塔塔板板数数应应为为多多少？色谱柱要加到多长？少？色谱柱要加到多长？解：解：R=1.2,1)柱材料一定，柱材料一定，一定一定2)1)各组分的各组分的分配系数必须不同分配系数必须不同。这一条件通过选择合适的固定相来实现。这一条件通过选择合适的固定相来实现。2)区域扩宽的速度应小于区域分离的速度，区域扩宽的速度应小于区域分离的速度，即色谱柱的柱效要高。即色谱柱的柱效要高。n3)在保证快速分离的前提条件下，色谱柱应在保证快速分离的前提条件下，色谱柱应足够长。足够长。n使试样中的使试样中的不同组分分离不同组分分离需要满足的条件需要满足的条件18.5 色谱方法的选择性和分离操作色谱方法的选择性和分离操作 条件优化条件优化1、用已知纯物质用已知纯物质 对照定性对照定性 保留值保留值定性定性 峰高增加法峰高增加法定性定性 不同色谱柱不同色谱柱定性定性 18.6 色谱定性分析色谱定性分析2、用经验规律和文献值定性用经验规律和文献值定性(1)经验规律经验规律碳数规律碳数规律一定温度下，一定温度下，同系物同系物同系物同系物调整保留时间对数与分调整保留时间对数与分子中碳数呈线性关系子中碳数呈线性关系测定两种或更多同系物的调整保留时间，则测定两种或更多同系物的调整保留时间，则可求出常数可求出常数A和和C。从色谱图查出未知物的。从色谱图查出未知物的 后，由上式求出未知物的碳数。后，由上式求出未知物的碳数。(2)相对保留值相对保留值相对保留相对保留值值ri,s只与只与固定液、柱温固定液、柱温有关：有关：测定分析物测定分析物 i 和基准物和基准物s相对保留值，查表相对保留值，查表对照对照定性定性(3)保留指数保留指数Z,Z+1:相邻相邻正构烷烃的碳原子数正构烷烃的碳原子数进样进样计算值和文献对照定性计算值和文献对照定性例：例：乙酸正丁酯在阿皮松乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲线如下图柱上的流出曲线如下图所示。由图中测得调整保留距离为：乙酸正丁酯所示。由图中测得调整保留距离为：乙酸正丁酯310.0 mm，正庚烷，正庚烷174.0 mm，正辛烷，正辛烷373.4 mm。求乙酸正定酯的保留指数。求乙酸正定酯的保留指数。在与文献值对照时，一定要重在与文献值对照时，一定要重视文献值的视文献值的实验条件实验条件，如固定，如固定液、柱温等。而且要用几个已液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。知组分进行验证。3、联机定性联机定性 GC/MS(气相色谱气相色谱-质谱质谱)例：例：川桂皮挥发油的化学成分分析川桂皮挥发油的化学成分分析色谱柱色谱柱：SE54(30 m0.25 mm0.25m)色谱操作条件色谱操作条件载气载气：氦气，流速：氦气，流速1.0 mL/min柱温柱温：初温初温60保持保持1min，8/min升温至升温至 150，6/min升温至升温至190，8 /min升温至升温至250，保持，保持1min总离子流色谱图总离子流色谱图6号峰的质谱图号峰的质谱图 GC/AES(气相色谱原子发射光谱气相色谱原子发射光谱)二二甲甲基基硒硒烯烯丙丙基基甲甲基基硒硒甲甲基基亚亚磺磺基基硒硒酸酸甲甲酯酯二二甲甲基基二二硒硒2丙丙稀稀硫硫硒硒酸酸甲甲酯酯 1丙丙稀稀硫硫硒硒酸酸甲甲酯酯 双双(甲甲硫硫)硒硒烯烯丙丙基基甲甲基基硫硫二二甲甲基基二二硫硫二二烯烯丙丙基基硫硫烯烯丙丙基基甲甲基基二二硫硫二二甲甲基基三三硫硫二二烯烯丙丙基基二二硫硫烯烯丙丙基基甲甲基基三三硫硫二二烯烯丙丙基基三三硫硫GC-AES同时检测大蒜中碳、硫、硒化合物同时检测大蒜中碳、硫、硒化合物Se(196.1 nm)C(193.1 nm)S(180.7 nm)结论：结论：色谱定性分析和其他分析方法结合，才能准确色谱定性分析和其他分析方法结合，才能准确判断某组分的存在。判断某组分的存在。多种方法多种方法联合定性联合定性可大大提高鉴定的可靠性可大大提高鉴定的可靠性18.7 色谱定量分析色谱定量分析1、定量基础、定量基础或或f为定量校正因子为定量校正因子单位峰面积单位峰面积(或单位峰高或单位峰高)的组分的量的组分的量定量校正因子定量校正因子f相对校正因子相对校正因子因进样量因进样量m不易不易准确控制，故准确控制，故f值不易测准值不易测准测定：准确称量待测物纯品测定：准确称量待测物纯品mi和基准物和基准物ms，色谱测，色谱测定的峰面积定的峰面积Ai及及As，求得，求得2、常用的几种定量分析方法、常用的几种定量分析方法(1)归一化法归一化法试样中所有组分试样中所有组分均须出峰均须出峰要求要求操作条件如进样量、载气流速等操作条件如进样量、载气流速等变化时对结果的影响较小。变化时对结果的影响较小。优点优点质量百分比质量百分比(2)外标法外标法(校准曲线法校准曲线法)或或 不使用校正因子不使用校正因子 需准确控制进样量、需准确控制进样量、载气流速等载气流速等操作条件操作条件 适合测定大批量样品适合测定大批量样品(3)内标法内标法 对内标物的要求：对内标物的要求：（a）试样中不含有该物质；试样中不含有该物质；（b）与被测组分性质比较接近；与被测组分性质比较接近；（c）不与试样发生化学反应；不与试样发生化学反应；（d）出峰位置应位于被测组分附近，且无出峰位置应位于被测组分附近，且无 组分峰影响。组分峰影响。准确度高准确度高优点优点组分不全部出峰或只分析一或几种组分时组分不全部出峰或只分析一或几种组分时直接定量直接定量工作曲线法工作曲线法例例:测定二甲苯氧化母液中乙苯和二甲苯含量，测定二甲苯氧化母液中乙苯和二甲苯含量，采用内标法。称取试样采用内标法。称取试样1500 mg，加入内标物壬烷，加入内标物壬烷150 mg，混合均匀后进样，测得如下数据：，混合均匀后进样，测得如下数据：组分组分壬烷壬烷 乙苯乙苯 对二对二甲苯甲苯间二间二甲苯甲苯邻二邻二甲苯甲苯峰面积峰面积校正因子校正因子981.02700.97951.001200.95800.98计算样品中乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯计算样品中乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的含量。的含量。解：解：其他省略其他省略本章基本要求本章基本要求1.色谱法基本概念色谱法基本概念2.塔板理论和速率理论基本原理和计算塔板理论和速率理论基本原理和计算3.色谱法定性和定量分析的依据和基本方法色谱法定性和定量分析的依据和基本方法作 业p509-511 7，9，10，14，18，20