生物化学教案【蛋白质】--课件

蛋白质蛋白质-英文为“Protein”第一重要.功能 蛋 白,大多为 球球 状状；w细胞膜载体蛋白（物质、信号）、酶w细胞质(包括细胞器)酶（物质代谢）、信号传递w细胞核酶（遗传）、结构蛋白（染色体骨架）w细胞质(包括细胞器)酶（物质代谢）、信号传递蛋白质分布广泛、功能多样1.催化功能-酶2.结构功能-皮、毛、骨、牙、细胞骨架3.载运功能-膜蛋白4.调控功能-激素5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.防御功能-免疫球蛋白7.神经传导基本功能基本功能辅助功能第四章第四章 蛋白质化学蛋白质化学第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成第二节第二节 蛋白质分子的结构蛋白质分子的结构第三节第三节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质第四节第四节 氨基酸、蛋白质的分氨基酸、蛋白质的分离与鉴定离与鉴定蛋白质化学蛋白质化学1 1(分类）分类）蛋蛋白白质质功能功能 形状形状球蛋白：球形、易溶解。球蛋白：球形、易溶解。组成组成溶解性溶解性 纤维蛋白纤维蛋白：形似纤维、不溶于水。形似纤维、不溶于水。单纯蛋白：只有单纯蛋白：只有氨基酸，多数蛋白。氨基酸，多数蛋白。清蛋白（白蛋白）：溶于水。清蛋白（白蛋白）：溶于水。球蛋白：微溶于水，溶于稀盐。球蛋白：微溶于水，溶于稀盐。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。缀合蛋白：与非蛋白质物质结合，如核、缀合蛋白：与非蛋白质物质结合，如核、糖、脂蛋白。糖、脂蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受体、膜蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受体、膜蛋白。非活性蛋白：胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白。非活性蛋白：胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白。一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成二二、组成蛋白质分子的基本单位、组成蛋白质分子的基本单位氨基酸氨基酸三、肽键与肽三、肽键与肽第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成多数蛋白质含多数蛋白质含:碳碳(C)50(C)5056%56%氢氢(H)6(H)68%8%氧氧(O)19(O)1924%24%氮氮(N)13(N)1319%19%硫硫(S)0(S)04%4%有些蛋白质含有磷有些蛋白质含有磷少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等个别还含有碘个别还含有碘一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成1 1凯氏凯氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法定氮法一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成2 2蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量 每克样品含氮的克数每克样品含氮的克数 6.25 6.25100100 =100=100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(克克%)%)（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类（二）不常见的氨基酸（二）不常见的氨基酸（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质二、氨基酸二、氨基酸（五）氨基酸的化学反应（五）氨基酸的化学反应 氨基酸是含有氨基的酸氨基酸是含有氨基的酸CHRCOOH3N+(甘油醛的甘油醛的D D型、型、L L型型)D-D-甘油醛甘油醛L-L-甘油醛甘油醛透视式透视式投影式投影式氨基酸的构型氨基酸的构型L氨基酸氨基酸D氨基酸氨基酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（三种分类法）（三种分类法）1 1根据其化学结构分为：根据其化学结构分为：（1）脂肪族氨基酸）脂肪族氨基酸 （2）芳香族氨基酸）芳香族氨基酸 （3）杂环氨基酸）杂环氨基酸2 2根据酸碱性质根据酸碱性质 （1）酸性氨基酸）酸性氨基酸 （2）碱性氨基酸）碱性氨基酸 （3）中性氨基酸）中性氨基酸3 3根据根据R R基团的极性基团的极性 （1）非极性）非极性R基氨基酸基氨基酸 （2）极性极性R基氨基酸基氨基酸 （不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的）（不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的）（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1 1一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号甘氨酸甘氨酸氨基乙酸氨基乙酸GlycineGly(G)甘甘（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸2 2一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号丙氨酸丙氨酸-氨基丙酸氨基丙酸AlanineAlanineAlaAla(A A)丙丙（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸3 3一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸3 3普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号缬氨酸缬氨酸-氨基异戊酸氨基异戊酸ValineValineValVal(V)(V)缬缬（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸4 4一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸4 4普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号亮氨酸亮氨酸-氨基异己酸氨基异己酸LeucineLeucineLeuLeu(L L)亮亮（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸5 5一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸5 5普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号异亮氨酸异亮氨酸-氨氨基基-甲甲基基戊戊酸酸IleucineIleucineIleIle(I I)异亮异亮（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸6 6一氨基二羧基氨基酸一氨基二羧基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号天冬氨酸天冬氨酸 -氨基丁二酸氨基丁二酸 AspartateAspartateAspAsp(D)D)天天（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸7 7一氨基二羧基氨基酸一氨基二羧基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号谷氨酸谷氨酸 -氨基戊二酸氨基戊二酸 GlutamateGlutamateGluGlu(E)(E)谷谷（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸7 7含酰胺基氨基酸含酰胺基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号天冬酰胺天冬酰胺AsparagineAsnAsn(N)N)（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸9 9含酰胺基氨基酸含酰胺基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号谷氨酰胺谷氨酰胺GlutamineGlutamineGlnGln(Q)(Q)（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1010二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号精氨酸精氨酸 -氨氨基基-胍胍基基戊戊酸酸ArginineArginineArgArg(R)(R)精精（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1111二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号鸟氨酸鸟氨酸 -二氨基戊二氨基戊酸酸OrnithineOrn鸟鸟（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1212二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸3 3普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号赖氨酸赖氨酸，-二氨基己二氨基己酸酸LysineLysineLysLys(K)(K)赖赖（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1313羟基氨基酸羟基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号丝氨酸丝氨酸 -氨基氨基-羟基丙羟基丙酸酸 SerineSerineSerSer(S)(S)丝丝（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1414羟基氨基酸羟基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号苏氨酸苏氨酸 -氨氨基基-羟羟基基丁丁酸酸ThreonineThreonineThrThr(T)(T)苏苏（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1515含巯基氨基酸含巯基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号半胱氨酸半胱氨酸 -氨氨基基-巯巯基基丙丙酸酸CysteineCysteineCysCys(C)(C)半胱半胱（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1616含巯基氨基酸含巯基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号胱氨酸胱氨酸二二(-氨氨基基-巯巯基基丙丙酸酸)CysteineCysteineCysCys-Cys-Cys胱胱（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1717含硫基氨基酸含硫基氨基酸3 3普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号甲甲硫硫氨氨酸酸(蛋蛋氨氨酸酸)-氨氨基基-甲甲硫硫基基丁丁酸酸MethionineMethionineMet Met(M M)甲硫甲硫（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构2 2）芳芳香香族族氨氨基基酸酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号苯丙氨酸苯丙氨酸 -氨基氨基-苯基丙苯基丙酸酸PhenylalaninePhenylalaninePhePhe(F)(F)苯丙苯丙（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构2 2）芳芳香香族族氨氨基基酸酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号酪氨酸酪氨酸 -氨氨基基-对对羟羟苯苯基基丙丙酸酸TyrosineTyrosineTyrTyr(Y)(Y)酪酪（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号组氨酸组氨酸 -氨氨基基-咪咪唑唑基基丙丙酸酸HistidineHistidineHisHis(H)(H)组组（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号色氨酸色氨酸 -氨氨基基-吲吲哚哚基基丙丙酸酸TryptophanTryptophanTrpTrp(W)(W)色色（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸3 3普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号脯氨酸脯氨酸四氢四氢吡咯吡咯-2-2-羧酸羧酸ProlineProlineProPro(P)(P)脯脯亚氨基酸亚氨基酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸4 4普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号羟脯氨酸羟脯氨酸4 4-羟基吡咯烷羟基吡咯烷-2 2-羧酸羧酸HydroxprolineHydroxprolineHypHyp羟羟（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类2 2（据酸碱性质）（据酸碱性质）酸酸性性氨氨基基酸酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类2 2（据酸碱性质）（据酸碱性质）碱碱性性氨氨基基酸酸赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类2 2（据酸碱性质）（据酸碱性质）中中性性氨氨基基酸酸 含一氨基一羧基的氨含一氨基一羧基的氨基酸，包括两种酸性氨基基酸，包括两种酸性氨基酸产生的酰胺（谷氨酰胺酸产生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。和天冬酰胺）。（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基因极性）基因极性）非非极极性性氨氨基基酸酸1 1苯丙氨酸苯丙氨酸胱氨酸胱氨酸蛋氨酸蛋氨酸甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸脯氨酸脯氨酸色氨酸色氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）非非极极性性氨氨基基酸酸2 2 甘氨酸按理属于极性甘氨酸按理属于极性的，但因其的，但因其-碳上的氢碳上的氢受到易解离的受到易解离的-氨基和氨基和-羧基的影响，因此不羧基的影响，因此不体现极性。体现极性。（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）极极性性氨氨基基酸酸1 1不带电荷的不带电荷的酪氨酸酪氨酸半胱氨酸半胱氨酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰胺天冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）极极性性氨氨基基酸酸2 2带正电荷的带正电荷的(碱性氨基酸碱性氨基酸)赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）极极性性氨氨基基酸酸3 3带负电荷的带负电荷的(酸性氨基酸酸性氨基酸)天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸（三）不常见的氨基酸（三）不常见的氨基酸-丙氨酸丙氨酸-氨基丁酸氨基丁酸H H2 2N-CHN-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOHH H2 2N-CHN-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH1 1酸水解酸水解2 2碱水解碱水解3 3酶水解酶水解（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酸水解）（酸水解）常用方法：常用方法：硫酸或盐酸处理硫酸或盐酸处理 浓度浓度:盐酸为盐酸为6mol/L 硫酸为硫酸为4mol/L 条件条件:回流煮沸回流煮沸20小时左右小时左右 优点优点:不引起消旋作用，得到不引起消旋作用，得到L-氨基酸氨基酸 缺点缺点:色氨酸完全被沸酸所破坏色氨酸完全被沸酸所破坏 羟基氨基酸（丝羟基氨基酸（丝,苏）部分被水解苏）部分被水解 天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被 水解下来。水解下来。（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（碱水解）（碱水解）常用方法：常用方法：用氢氧化钠处理用氢氧化钠处理浓度浓度:5mol/L条件条件:共煮共煮1020h优点优点:色氨酸稳定色氨酸稳定缺点缺点:多数氨基酸遭到不同程度的破坏，多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象；所得为并且产生消旋现象；所得为D型和型和 L型混合氨基酸；碱水解引起精氨型混合氨基酸；碱水解引起精氨 酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解1 1）优点优点:不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。缺点缺点:需要几种酶协同作用，酶水解所需时需要几种酶协同作用，酶水解所需时 间较长。间较长。（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解2 2）（牛胰蛋白酶）（牛胰蛋白酶）胰胰蛋蛋白白酶酶1 1（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解2 2）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点R1R1：赖氨酸（赖氨酸（Lys）精氨酸（精氨酸（Arg）特点：特点：专一性较强，水解速度快专一性较强，水解速度快胰胰蛋蛋白白酶酶2 2（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解3 3）糜糜蛋蛋白白酶酶1 1（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解3 3）糜糜蛋蛋白白酶酶2 2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点R1R1：苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)色氨酸（色氨酸（Trp）苏氨酸苏氨酸(Thr)亮氨酸亮氨酸(Leu)特点：特点：水解稍慢水解稍慢（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解4 4）胃胃蛋蛋白白酶酶1 1（三）蛋白质的水解（三）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解4 4）胃胃蛋蛋白白酶酶2 2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点R1R1、R2R2：苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)色氨酸色氨酸（Trp）苏氨酸）苏氨酸(Thr)亮氨酸亮氨酸(Leu)特点：特点：水解速度较快水解速度较快（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质1 1物物理理性性质质物理性状物理性状：无色结晶物。：无色结晶物。熔点熔点：熔点高，一般在：熔点高，一般在200200以上。以上。溶解性溶解性：通常能溶于极性溶剂：通常能溶于极性溶剂,而而不溶于非极性溶剂不溶于非极性溶剂;各种氨基酸在水各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中。稀酸或稀碱中。旋光性旋光性：风味风味：（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点1 1 氨基酸在溶液中主要以兼性氨基酸在溶液中主要以兼性离子形式存在离子形式存在CHRCOOH3N+（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点2 2加酸时加酸时CHRCOOHH3N+H+H+总电荷总电荷“+”（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点3 3加碱时加碱时CHRCOO-H2N总电荷总电荷“”OHOH（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点5 5等电点（等电点（pIpI）：）：当溶液为某一当溶液为某一pHpH值，值，氨基酸分子中所含的氨基酸分子中所含的-NH-NH3 3+和和-COO-COO-数数目正好相等时目正好相等时(净电荷为净电荷为0),0),这一这一pHpH值值即为氨基酸的即为氨基酸的等电点等电点。在等电点时，氨基酸既不向正极在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。离子状态。（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点4 4COOCHH3N+R+OH+H+COOCHH2NR+OH+H+在酸性溶在酸性溶液中液中（pH pI）在晶体状态或在晶体状态或水溶液中水溶液中（pH=pI）在碱性溶在碱性溶液中液中（pHpI）（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点7 7丙氨酸丙氨酸pIpI的计算的计算COOCH+H+H3N+CH3 K1COOHCHH3N+CH3COOCHH2NCH3 K2Ala+Ala AlaK1=AlaH+/Ala+Ala+=Ala H+/K1K2=AlaH+/Ala Ala=Ala K2/H+到达到达等电点等电点时，时，Ala+=AlaAla H+/K1=Ala K2/H+，即：，即：K1 K2=H+2两边取负对数：两边取负对数：lg H+2=lg K1lg K2 lg H+=pH lg K1=pK1 lg K1=pK2 2pH=pK1 pK2 令令pI为等电点时的为等电点时的pH，则则：pI（pK1 pK2）/2（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点8 8天冬氨酸天冬氨酸pIpI的计算的计算Asp+Asp Asp COOHC HH3N+CH2COOHCOOCHH3N+CH2COOHCOOCHH3NCH2CO K1 KR K2Asp=COOCHH2NCH2COO等电点时为等电点时为Asp pI（pK1 pKR）/2O+（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点9 9赖氨酸赖氨酸pIpI的计算的计算Lys+Lys+Lys COOHC HH3N+(CH2)4NH3+COOCHH3N+(CH2)4NH3+COOCHH2N(CH2)4NH3+K1 K2 KRLys COOCHH2NCH2NH2等电点时为等电点时为Lys pI（pK2 pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点6 6l侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的点是它的pKpK1 1和和pKpK2 2的算术平均值：的算术平均值：pI=pI=(pK(pK1 1+pK+pK2 2)/2)/2 l同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其其pIpI值也决定于值也决定于两性离子两边的两性离子两边的pKpK值的算值的算术平均值术平均值。l酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI=(pKpI=(pK1 1+pK+pKR R)/2)/2 l碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI=(pKpI=(pK2 2+pK+pKR R)/2)/2 （四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质3 3芳芳香香族族氨氨基基酸酸的的紫紫外外吸吸收收光光谱谱1 1构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)(97%97%以上）。以上）。2.2.知道蛋白质的分子量。知道蛋白质的分子量。3.3.知道蛋白质由几个亚基组成。知道蛋白质由几个亚基组成。4.4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。计算每种氨基酸的个数。5.5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求二、一级结构的研究方法二、一级结构的研究方法2 2（一）测定氨基酸的组成（一）测定氨基酸的组成（二）蛋白质的（二）蛋白质的N-N-末端和末端和C-C-末端的测定末端的测定（三）二硫键的拆开和肽链的分离（三）二硫键的拆开和肽链的分离（四）肽链的部分水解和肽段的分离（四）肽链的部分水解和肽段的分离（五）肽段的氨基酸顺序的测定（五）肽段的氨基酸顺序的测定（六）二硫键位置的确定（六）二硫键位置的确定（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析1 1二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法（）法（-氨基反应）氨基反应）SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的游离端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析2 2二甲基氨基萘磺酰氯（称丹磺酰氯）法二甲基氨基萘磺酰氯（称丹磺酰氯）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析3 3异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PITCPITC）法）法 此法最大优点是除去此法最大优点是除去N N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链因此，可以用来一步步地测定多肽链N N末端的氨基酸顺序。氨基酸分析末端的氨基酸顺序。氨基酸分析仪就是根据此原理制成的。仪就是根据此原理制成的。NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCH COR1HNNH CH COR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析4 4氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶是从胰腺中提取是一种肽链外切酶，它氨肽酶是从胰腺中提取是一种肽链外切酶，它能从多肽链的能从多肽链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端末端残基顺序。残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析1 1硼氢化锂还原法硼氢化锂还原法(-(-羧基反应羧基反应)RCHCOOHNH2LiBH4 还原还原RCHCH2OHNH2-氨基醇氨基醇可以用层析法加以鉴定可以用层析法加以鉴定（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析2 2肼解法肼解法(-(-羧基反应羧基反应)多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端端氨基酸分离。氨基酸分离。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析3 3羧肽酶法羧肽酶法1 1羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y。A A和和B B来自来自胰脏；胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端末端氨基酸残基；氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的末端残基的肽键。肽键。但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结果不好分析。果不好分析。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析3 3羧肽酶法羧肽酶法2 2氨氨基基酸酸的的释释放放量量（摩摩尔尔数数）反应时间反应时间GlySerVal判断序列判断序列-Val-Ser-Gly-COOH（三）二硫键的拆开和肽链的分离（三）二硫键的拆开和肽链的分离1 1如果肽链之间是以二硫键交连的，或者虽如果肽链之间是以二硫键交连的，或者虽然蛋白质分子由一条肽链构成，有链内的二然蛋白质分子由一条肽链构成，有链内的二硫键，则必须采取一些方法将二硫键拆开。硫键，则必须采取一些方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯基，以防它重新被氧化。基，以防它重新被氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电泳等方法进行分离。泳等方法进行分离。（三）二硫键的拆开和肽链的分离（三）二硫键的拆开和肽链的分离2 2SH+SHS SHOCH2CH2SHICH2COOH 涉及反应涉及反应pH8.09.0,室温室温S CH2COO（四）肽链部分水解和肽段分离（四）肽链部分水解和肽段分离此步骤是测定氨基酸顺序工作中的一个关键步骤。此步骤是测定氨基酸顺序工作中的一个关键步骤。通通常常是是选选择择了了专专一一性性很很强强的的蛋蛋白白酶酶来来完完成成的的。最最理理想想的的酶酶是是胰胰蛋蛋白白酶酶，它它很很容容易易得得到到结结晶晶纯纯品品。胰胰蛋蛋白白酶酶专专门门水水解解由由碱碱性性氨氨基基酸酸（赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸）的的羧羧基基参参加加形形成成肽肽键键。所所以以水水解解后后的的产产物物C-C-端端为为赖赖氨酸或精氨酸。氨酸或精氨酸。经经常常使使用用的的还还有有糜糜蛋蛋白白酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶及及专专一一性性较较差差的的嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶、溴溴化化氰氰等等。各各种种酶酶的的作作用用位位点点参见参见北大北大P122P122。多多肽肽链链经经部部分分水水解解后后，即即降降解解成成长长短短不不一一的的较较小小肽肽段段，这这些些肽肽段段可可以以应应用用层层析析和和电电泳泳加加以以分分离离和和提提纯。纯。（五）肽段的氨基酸顺序的测定（五）肽段的氨基酸顺序的测定1 1 测定多肽链中分离出来的各个小测定多肽链中分离出来的各个小肽段，可以应用化学方法或酶学方法肽段，可以应用化学方法或酶学方法测出其中的氨基酸顺序。然后比较用测出其中的氨基酸顺序。然后比较用不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此有重叠的部分，确序，根据它们彼此有重叠的部分，确定每个肽段的适当位置。拼凑出整个定每个肽段的适当位置。拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。肽链的氨基酸顺序。（五）肽段的氨基酸顺序的测定（五）肽段的氨基酸顺序的测定2 2 肽肽顺序顺序A A1 1 B B1 1A A2 2B B2 2 A A3 3B B3 3 A A4 4Ala.Phe(Ala.Phe(丙丙-苯丙苯丙)Ala.Phe.Gly.Lys(Ala.Phe.Gly.Lys(甘甘-赖赖)Gly.Lys.Asn.Tyr(-Gly.Lys.Asn.Tyr(-天冬酰天冬酰-酪酪)Asn.Tyr.Arg(-Asn.Tyr.Arg(-精精)Arg.Tyr(-Arg.Tyr(-酪酪)Tyr.His(-Tyr.His(-组组)His.Val(-His.Val(-缬缬)十十肽肽顺顺序序Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val（六）二硫键位置的确定（六）二硫键位置的确定1 1 一一般般可可用用蛋蛋白白酶酶或或酸酸直直接接水水解解原原来来的的蛋蛋白白质质，从从部部分分水水解解产产物物中中分分离离出出含含有有二二硫硫键键的的肽肽段段，所所得得到到的的肽肽段段混混合合物物可可用用BrownBrown及及HarltayHarltay的的对对角角线线电电泳泳技技术进行分离，确定二硫键位置。术进行分离，确定二硫键位置。确确定定二二硫硫键键位位置置一一般般用用胃胃蛋蛋白白酶酶水水解解原原来来的的含含二二硫硫链链的的蛋蛋白白质质。因因为为胃胃蛋蛋白白酶酶专专一一性性较较低低，切切点点多多，这这样样生生成成的的肽肽段段（包包括括含含有有二二硫硫桥桥的的肽肽段段）都都比比较较小小，后后面面的的分分离离、鉴鉴定定工工作作均均比比较较容容易易进进行行。其其次次是是胃胃蛋蛋白白酶酶的的pHpH在在酸酸性性范范围围（2 2），有有利利于于防防止止二二硫键发生交换反应而造成麻烦。硫键发生交换反应而造成麻烦。（六）二硫键位置的确定（六）二硫键位置的确定2 2 BrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解+-+-第第二二向向第一向第一向a ab bpH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂产由一个二硫键断裂产生的肽段生的肽段三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理1 1（总合成步骤）（总合成步骤）1 1加加保保护护基基Y Y，保保护护氨氨基基酸酸甲甲的的自自由由氨氨基基（-NH-NH2 2）。）。2 2加加保保护护基基Z Z，保保护护氨氨基基酸酸乙乙的的自自由由羧羧基基(-(-COOH)(COOH)(此反应同时活化了氨基）。此反应同时活化了氨基）。3 3加加活活化化基基X X，使使加加保保护护基基Y Y的的氨氨基基酸酸甲甲的的羧基活化。羧基活化。4 4使使-NH-NH2 2被被保保护护羧羧基基被被活活化化的的氨氨基基酸酸甲甲，同同羧羧基基被被保保护护氨氨基基被被活活化化的的氨氨基基酸酸乙乙结结合合成成肽。肽。5 5脱保护基脱保护基Y Y和和Z Z。三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤）1 1加加保保护护基基Y Y来来保保护护氨氨基基酸酸甲甲的的自自由由氨基（氨基（-NH-NH2 2）。）。R1CHCOOYNH3R1CHCOO Y.NH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤）2 2加加保保护护基基Z Z来来保保护护氨氨基基酸酸乙乙的的自自由由羧羧基基(-COOH)(-COOH)(此反应同时活化了氨基）。此反应同时活化了氨基）。R1CHCOOZNH3R1CHCOOZNH2三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤）3 3加加活活化化基基X X使使加加保保护护基基Y Y的的氨氨基基酸酸甲甲的羧基活化。的羧基活化。R2CHCOO+X Y.NHR2CHCOX Y.NH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤）4 4使使-NH-NH2 2被被保保护护羧羧基基被被活活化化了了的的氨氨基基酸酸甲甲,同同羧羧基基被被保保护护氨氨基基被被活活化化了了的的氨氨基酸乙结合成肽。基酸乙结合成肽。R2CHCOOZNH2R1CHCOX Y.NHR1CHCO Y.NHR2CHCOOZ HXNH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤）5 5脱保护基脱保护基Y Y和和Z Z。R1CHCO Y.NHR2CHCOOZ HXNH 脱保护基剂脱保护基剂R1CHCO NH3+R2CHCOONH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理3 3（肽链的延长（肽链的延长)如如果果欲欲再再延延长长肽肽链链，可可将将保保护护基基Y Y或或Z Z去去掉掉一一个个，所所得得含含自自由由氨氨基基或或自自由由羧羧基基的的肽肽，按按照照上上述述3,43,4步进行即可。步进行即可。三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理4 4（常用（常用X,Y,Z)X,Y,Z)常常见见的的氨氨基基保保护护基基Y Y：对对甲甲苯苯磺磺酰酰基基（tosyltosyl或或TosTos基基）、苄苄氧氧羰羰基基(C(C6 6H H5 5CHCH2 2O OCO-CO-，CbZCbZ基基)。叔叔丁丁氧氧羰羰基基(CCH(CCH3 3)3CO-CO-)3CO-CO-，BocBoc基基）或或三三苯苯甲甲基基（C C6 6H H5 5）3-C3-C即即lrityllrityl基。基。羧羧基基活活化化基基X X：可可用用PClPCl5 5使使氨氨基基酸酸酰酰氯氯化化，即即将将羧羧基基变变为为COClCOCl基基。也也可可用用联联氨氨和和HNOHNO2 2使使羧羧基基叠叠氮化成氮化成-CON-CON3 3。羧羧基基保保护护基基Z Z：可可用用酯酯化化或或皂皂化化使使羧羧基基变变为为-COOCCOOC2 2H H5 5或或-COONa-COONa，此反应同时亦活化了氨基。，此反应同时亦活化了氨基。三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理5 5（合成方法（合成方法)液液相相合合成成法法：合合成成在在溶溶液液中中进进行行，这这种种方法费力，目前不被采用。方法费力，目前不被采用。固固相相合合成成法法：采采用用固固相相支支持持物物，反反应应在在支支持持物物上上进进行行。常常用用的的支支持持物物如如：苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯基基苯苯的的共共聚聚物物，再再经经氯氯甲甲基基化化而而成，简称氯甲基聚乙烯树脂。成，简称氯甲基聚乙烯树脂。多肽的合成多肽的合成1 1多肽的合成多肽的合成2 2