生物制药生物工程与生物制药培训课件

生物制药生物工程与生物制药现代生物工程简介 一、基一、基 因因 工工 程程 二、酶二、酶 工工 程程 三、细三、细 胞胞 工工 程程 四、发四、发 酵酵 工工 程程1.基因工程的诞生 20世纪70年代中期，两项关键技术的问世，使得基因工程成功诞生：nDNA分子的体外切割与连接技术分子的体外切割与连接技术nDNA分子的核酸序列分析技术分子的核酸序列分析技术2.基因工程的定义和研究内容定义：基因工程（基因工程（Gene engineering）是指在体外将）是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类合，并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能稳定地分子的寄主细胞内，而能稳定地繁殖，并通过工程化为人类提供繁殖，并通过工程化为人类提供有用的产品和服务的技术。有用的产品和服务的技术。2.基因工程的定义和研究内容n除了少数除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是都是DNA分子，因此基因工程也称为重组分子，因此基因工程也称为重组DNA技技术术(DNA Recombination)。nDNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为基因克隆还可将基因工程表征为基因克隆(Gene cloning)或分子克隆或分子克隆(Molecular cloning)。2.基因工程的定义和研究内容步骤：n切切从供体细胞中分离出从供体细胞中分离出基因组基因组DNA，用限制，用限制性核酸内切酶分别将性核酸内切酶分别将外源外源DNA（包括外源包括外源基因或目的基因）和基因或目的基因）和载体分子切开。载体分子切开。2.基因工程的定义和研究内容步骤：n接接用用DNA连接酶将含连接酶将含有外源基因的有外源基因的DNA片断接到载体上，片断接到载体上，形成形成DNA重组分子。重组分子。2.基因工程的定义和研究内容步骤：n转转借助于细胞转化手借助于细胞转化手段将段将DNA重组分子重组分子导入受体细胞中。导入受体细胞中。2.基因工程的定义和研究内容步骤：n增增短时间培养转化短时间培养转化后细胞，以扩增后细胞，以扩增DNA重组分子或重组分子或使其整合到受体使其整合到受体细胞的基因组中。细胞的基因组中。2.基因工程的定义和研究内容步骤：n检检筛选和鉴定转化筛选和鉴定转化细胞，获得使外细胞，获得使外源基因高效表达源基因高效表达的基因工程菌或的基因工程菌或细胞。细胞。3.基因操作的工具和技术工具酶核酸内切限制酶1978 Nobel Prize3.基因操作的工具和技术工具酶核酸内切限制酶“分子剪刀”3.基因操作的工具和技术工具酶核酸内切限制酶“分子剪刀”3.基因操作的工具和技术工具酶DNA连接酶T4 ligase：19673.基因操作的工具和技术DNA的提取物理分离法n平衡等密度离心法平衡等密度离心法n凝胶电泳分离凝胶电泳分离nDNA印迹（印迹（Southern blotting）3.基因操作的工具和技术DNA的提取基因组文库和cDNA文库分离目的基因3.基因操作的工具和技术DNA的提取PCRn变性(9095)n复性(3760)n延伸(7075)3.基因操作的工具和技术目的基因和载体的连接nDNA连接酶连接酶3.基因操作的工具和技术重组DNA向宿主细胞的转移、鉴别和表达目的基因导入受体细胞n合适的受体细胞合适的受体细胞n合适的克隆载体合适的克隆载体n合适的基因转移方法合适的基因转移方法n转化、转导、杂交转化、转导、杂交n细胞融合、显微注射细胞融合、显微注射human Arabidopsis 拟南芥拟南芥Thermotoga maritima Escherichia coliBuchnerasp.APS Rickettsia prowazekii Ureaplasma urealyticum Bacillus subtilisDrosophila melanogaster Thermoplasma acidophilum Plasmodium falciparum Helicobacter pylori mouse Caenorhabitis elegans rat Borrelia burgorferi Borrelia burgorferi Aquifex aeolicus Neisseria meningitidis Z2491 Mycobacterium tuberculosis 3.基因操作的工具和技术阳性克隆的筛选和鉴定n遗传检测法遗传检测法n双酶切片断重组法双酶切片断重组法n报告基因法报告基因法3.基因操作的工具和技术克隆的进一步鉴定n限制性内切酶分析法限制性内切酶分析法n分子杂交法分子杂交法nPCR法法nDNA测序法测序法n目的基因转录产物检测目的基因转录产物检测Northern blottingn目的基因翻译产物检测目的基因翻译产物检测Western blotting3.基因操作的工具和技术目的基因在受体细胞中的表达4.基因工程药物n多肽多肽n蛋白质蛋白质n酶酶n激素激素n疫苗疫苗n单克隆抗体单克隆抗体n细胞因子细胞因子 定义：又称生物技术药物，是利用重组DNA技术生产的rh IFN、rh IL、rh CSF、bFGF、EGFInsulin、GH、EPO、胰高血糖素、降钙素胰高血糖素、降钙素rSK、rSAK、rUK、SOD血清白蛋白血清白蛋白水蛭素水蛭素流感、疟疾、艾滋病、狂犬病、结核病流感、疟疾、艾滋病、狂犬病、结核病狂犬病毒、抗肝癌、胃癌、白血病狂犬病毒、抗肝癌、胃癌、白血病4.基因工程药物n基因工程药物的优势n产率产率4.基因工程药物n基因工程药物的优势n经济效益经济效益生物技术产品的销售额年份美国（亿美元）中国（亿人民币）1986 2.61988 6.551992 49.21997 1302000 500 2004.基因工程药物n胰岛素n1977年年，首次将人胰岛素基因通过大肠杆菌表，首次将人胰岛素基因通过大肠杆菌表达成为人胰岛素，基因工程学诞生。达成为人胰岛素，基因工程学诞生。4.基因工程药物n人体生长激素4.基因工程药物n干扰素n抗病毒（流感病毒、抗病毒（流感病毒、HBV、HIV等），防治癌症等），防治癌症 罗荛愫罗荛愫（IFN-2a）（IFN-1b）（IFN-2b）4.基因工程药物(疫苗)4.基因工程药物(疫苗)1.酶工程概述(1)酶的认识过程(2)酶工程发展概况2.酶工程的内容(1)酶的来源n化学合成法化学合成法n提取法提取法n发酵法发酵法(2)酶的生产菌n对菌种的要求对菌种的要求n生产菌的来源生产菌的来源n常用的产酶菌常用的产酶菌2.酶工程的内容(3)酶的分离纯化n细胞破碎细胞破碎n酶的提取酶的提取n离心分离离心分离n过滤与膜分离过滤与膜分离n浓缩和干燥浓缩和干燥n酶的纯度与酶活力测定酶的纯度与酶活力测定2.酶工程的内容(4)酶分子的改造n酶分子修饰酶分子修饰n生物酶工程生物酶工程(5)酶与细胞固定化细胞工程细胞工程（cell engineering）应用细胞生物学和分子生物学的方法，在体外条件下进行细胞的培养、繁殖，或人为地改变细胞的生物学特性，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用物质的过程。1.细胞工程的基本内容(1)细胞工程的操作对象n原核细胞原核细胞n细菌、放线菌细菌、放线菌n真核细胞真核细胞n酵母菌、动物细胞、酵母菌、动物细胞、植物细胞植物细胞1.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作无菌操作无菌操作n杀菌和消毒杀菌和消毒n物理法物理法n化学试剂化学试剂n抗生素抗生素n超净工作台超净工作台1.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作细胞培养技术细胞培养技术n培养基培养基n培养板培养板/瓶瓶/皿皿n培养箱培养箱1.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作细胞培养技术细胞培养技术1.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作细胞融合技术细胞融合技术n制备原生质体制备原生质体n诱导细胞融合诱导细胞融合n化学法化学法n物理法物理法n生物法生物法n筛选杂合细胞筛选杂合细胞2.植物细胞工程(1)植物组织培养n1920年，德国著名植物年，德国著名植物学家学家Haberlandt首次提首次提出出“植物细胞全能性植物细胞全能性”的概念，并用叶肉细胞的概念，并用叶肉细胞进行离体培养。由于取进行离体培养。由于取材及技术上的原因，并材及技术上的原因，并未成功。未成功。2.植物细胞工程(1)植物组织培养n1934年，美国人年，美国人White用番茄根为材料，建立了用番茄根为材料，建立了第一个能无限生长第一个能无限生长的植物组织。的植物组织。2.植物细胞工程(1)植物组织培养n1951年，年，Skoog等人进行腺嘌呤诱导离体烟草茎等人进行腺嘌呤诱导离体烟草茎段上根、芽等器官的形成，获得成功。段上根、芽等器官的形成，获得成功。n1958年，美国年，美国Steward等和德国等和德国Reinert 等分别由培养的胡萝卜等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，并形根细胞诱导形成了胚状体，并形成新植株，用实验证明了植物细成新植株，用实验证明了植物细胞的全能性。胞的全能性。2.植物细胞工程(2)植物细胞融合n去细胞壁去细胞壁n机械法机械法n酶法：真菌纤维素酶酶法：真菌纤维素酶n原生质体融合（细胞杂交）原生质体融合（细胞杂交）n物理法：物理法：离心、振动、电刺激离心、振动、电刺激 n化学法：化学法：PEG2.植物细胞工程(3)转基因植物技术2.植物细胞工程(3)转基因植物技术生物药品生物药品n药用蛋白：疫苗、抗体、细胞因子等药用蛋白：疫苗、抗体、细胞因子等n优点：产量高、成本低、优点：产量高、成本低、可作食品直接服用可作食品直接服用2.植物细胞工程(3)转基因植物技术转基因转基因食品食品n1994年年5月月18日，美国日，美国FDA正式正式批准了第一种转基因食品批准了第一种转基因食品西西红柿上市。红柿上市。2.植物细胞工程(3)转基因植物技术转基因转基因食品食品2.植物细胞工程(3)转基因植物技术转基因转基因食品食品2.植物细胞工程(3)转基因植物技术工业用酶工业用酶n消化酶消化酶n乙醇分解酶乙醇分解酶n-淀粉酶淀粉酶2.植物细胞工程(3)转基因植物技术转基因农作物转基因农作物（GMC）n19962001年全球年全球GMC种植面积增加了种植面积增加了30倍。倍。n2001年，全球年，全球GMC的种植面积达的种植面积达4420万公顷：万公顷：大豆大豆46%，棉花，棉花20%，油菜，油菜11%，玉米，玉米7%。n我国我国GMC种植面积在种植面积在13个国家中居第四位，其个国家中居第四位，其中，国产转基因抗虫棉在中，国产转基因抗虫棉在2001年就种植了年就种植了60万公万公顷，可以减少农药使用量顷，可以减少农药使用量70%80%。2.植物细胞工程(3)转基因植物技术转基因农作物转基因农作物（GMC）n第一代第一代GMC：抗虫、抗病、抗除草剂等；：抗虫、抗病、抗除草剂等；n第二代第二代GMC：改良作物品质，如：改良作物品质，如“金稻米金稻米”。2.植物细胞工程(4)植物次生代谢物的生产n紫草素紫草素3.动物细胞工程(1)动物细胞/组织培养n动物细胞培养动物细胞培养n原代培养和继代培养原代培养和继代培养n贴壁培养和悬浮培养贴壁培养和悬浮培养n干细胞和定向分化干细胞和定向分化n动物组织培养动物组织培养n组织工程和人工器官组织工程和人工器官3.动物细胞工程(2)动物细胞融合n1958年，冈田善雄用灭活年，冈田善雄用灭活的仙台病毒诱导艾氏腹水的仙台病毒诱导艾氏腹水瘤细胞融合瘤细胞融合n化学诱导融合化学诱导融合n电刺激诱导融合电刺激诱导融合3.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体n抗原抗原 n抗体抗体抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇3.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体MCAb3.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体n德国的柯勒德国的柯勒(G.Khler，1946)n阿根廷的米尔斯坦阿根廷的米尔斯坦(C.Milstein，1926)3.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体3.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体n疾病诊断疾病诊断n检测疾病相关抗原检测疾病相关抗原n放射性核素标记肿瘤显像放射性核素标记肿瘤显像n疾病治疗疾病治疗n针对针对T细胞抗原的细胞抗原的MCAb免疫抑制剂免疫抑制剂n药物连接药物连接MCAb “生物导弹生物导弹”3.动物细胞工程(4)细胞拆合细胞核移植细胞核移植n胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植1981，Illmenses克隆小鼠克隆小鼠3.动物细胞工程(4)细胞拆合细胞核移植细胞核移植n体细胞克隆：体细胞克隆：“多莉多莉”1996.7.5 出生出生 1997.2.27Nature3.动物细胞工程n1998年年2月，英国月，英国PPL医疗公医疗公司克隆牛，名为司克隆牛，名为“杰弗逊杰弗逊”；n1998年年7月，日本的若山昭彦月，日本的若山昭彦等人成功地用克隆小鼠进行了等人成功地用克隆小鼠进行了克隆试验；克隆试验；n2001年年1月，美国克隆月，美国克隆恒河恒河猴猴 成功，名为成功，名为“泰特拉泰特拉”；3.动物细胞工程n2001年年3月，月，PPL医疗公司克隆医疗公司克隆猪成功；猪成功；n2002年年1月，中科院研究所陈大月，中科院研究所陈大元研究员领导的研究小组获得国元研究员领导的研究小组获得国内第一头克隆牛；内第一头克隆牛；n2002年年3月，美国成功克隆猫；月，美国成功克隆猫；n2002年年4月，中国的李宁教授月，中国的李宁教授领导的研究小组克隆红系冀南领导的研究小组克隆红系冀南牛牛“波娃波娃”。3.动物细胞工程染色体移植染色体移植(4)细胞拆合4.转基因动物n2000年，法国科学家利用转基年，法国科学家利用转基因技术因技术“制造制造”出了一只可以出了一只可以发出绿色荧光的兔子发出绿色荧光的兔子“Alba”。4.转基因动物n美国弗吉尼亚技术制药工程研美国弗吉尼亚技术制药工程研究院培育转基因猪，其体内含究院培育转基因猪，其体内含有人类的基因，产乳后其乳汁有人类的基因，产乳后其乳汁含有人体蛋白含有人体蛋白fator。n转基因牛转基因牛Herman及她的及她的后代，可生产人乳铁传递后代，可生产人乳铁传递蛋白）蛋白）。发酵工程发酵 利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。发酵工程（fermentation engineering）利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。发酵工程n青霉素（青霉素（penicillin）n1929年年Alexander Fleming1.发酵工程的内容(1)发酵工程的主要内容n生产菌种的选育生产菌种的选育n发酵条件的优化发酵条件的优化n反应器的设计反应器的设计n产物的分离、提取与精制产物的分离、提取与精制1.发酵工程的内容(2)发酵工程的类型n微生物菌体发酵微生物菌体发酵n微生物酶发酵微生物酶发酵n微生物代谢产物发酵微生物代谢产物发酵n微生物转化发酵微生物转化发酵n生物工程细胞发酵生物工程细胞发酵2.发酵工程的特点(1)(1)发酵过程以生物体的自动调节方式进行；发酵过程以生物体的自动调节方式进行；(2)(2)反应条件温和，能耗少，设备简单；反应条件温和，能耗少，设备简单；(3)(3)原料来源广泛，绿色环保；原料来源广泛，绿色环保；(4)(4)易生产复杂的高分子化合物，选择性强；易生产复杂的高分子化合物，选择性强；(5)(5)需要防止杂菌污染，灭菌要求高。需要防止杂菌污染，灭菌要求高。3.发酵工程的应用(1)(1)合成化工原料合成化工原料n溶剂、润滑剂、软化剂等溶剂、润滑剂、软化剂等n有机酸有机酸(2)(2)冶金工业冶金工业n重金属的浸提重金属的浸提(3)(3)酿造工业酿造工业n酒类、酱油等酒类、酱油等肺炎克氏杆菌对镉的吸附肺炎克氏杆菌对镉的吸附3.发酵工程的应用(4)(4)农、牧业农、牧业n生物固氮生物固氮n生物杀虫剂生物杀虫剂n微生物饲料微生物饲料(5)(5)环境保护环境保护n净化有毒高分子化合物净化有毒高分子化合物n降解海上浮油降解海上浮油n工业工业“三废三废”处理处理一、生物药物的概念 利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的一类预防、诊断、治疗疾病的药物制品。n生化药品生化药品n生物制品生物制品n生物医药产品生物医药产品二、生物药物的历史与发展n第一代：远古20世纪中叶 生物体某些天然活性物质加工制成的制剂。生物体某些天然活性物质加工制成的制剂。n第二代：20世纪中后期 利用近代生化技术从生物材料中分离、纯化获利用近代生化技术从生物材料中分离、纯化获得的具有针对性治疗作用的生物活性物质。得的具有针对性治疗作用的生物活性物质。n第三代：20世纪末迄今 利用生物技术生产的天然生化物质及经过生物利用生物技术生产的天然生化物质及经过生物工程手段改造的具有比天然物质更高药理活性的新工程手段改造的具有比天然物质更高药理活性的新物质。物质。三、生物药物的分类与用途1.按来源和制造方法分：动物来源动物来源微生物来源微生物来源植物来源植物来源现代生物技术产品现代生物技术产品化学合成化学合成三、生物药物的分类与用途2.按化学本质、生理功能或临床用途分：生化药物；生化药物；生物制品；生物制品；生物医药相关产品生物医药相关产品n氨基酸类药物氨基酸类药物n多肽和蛋白质类药物多肽和蛋白质类药物n酶与辅酶类药物酶与辅酶类药物n核酸及其降解物和衍生物核酸及其降解物和衍生物n多糖类药物多糖类药物n脂类药物脂类药物n细胞生长因子与组织制剂细胞生长因子与组织制剂四、生物药物的发展趋势1.资源的综合利用与扩大开发2.利用现代生物技术大力发展生物药物3.从天然存在的生理活性物质中寻找新的生物药物4.利用化学合成和蛋白质工程技术创制新的生物药物5.利用中西医结合技术创制新的生物药物