生物制药技术课件

资料仅供参考,不当之处，请联系改正。细胞工程细胞工程(cell engineering)(cell engineering)是指是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，并通过细胞融合、传操作，并通过细胞融合、核质移植、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。的新物种的生物工程技术。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1665 1665年英国物理学家胡克年英国物理学家胡克用自制的显微镜发现了细胞用自制的显微镜发现了细胞.胡胡胡胡克克克克所所所所用用用用的的的的显显显显微微微微镜镜镜镜及及及及观观观观察察察察的的的的栎栎栎栎树树树树细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1674167416741674年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞 细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第一节第一节 细胞融合细胞融合资料仅供参考,不当之处，请联系改正。细胞融合细胞融合（cell fusion)cell fusion)，又称体细，又称体细胞杂交（胞杂交（somatichybridiazationsomatichybridiazation），是），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义一、细胞融合的定义广义：广义：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。细胞融合细胞融合是指用人工方法使两种或是指用人工方法使两种或两种以上的体细胞合并形成一个细两种以上的体细胞合并形成一个细胞，胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。方法。狭义：狭义：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究进展二、细胞融合研究进展资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物融合细胞成长状态对比植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。动物细胞融合实验使用的小白鼠 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。三、细胞融合的意义三、细胞融合的意义u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离 机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，从而产生新的核外遗传系统。核外遗传系统，从而产生新的核外遗传系统。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。四、细胞融合的方法四、细胞融合的方法诱导细胞融合的方法有诱导细胞融合的方法有3 3种种:生物方法生物方法(常用仙台病毒常用仙台病毒)化学方法化学方法(常用聚乙二醇常用聚乙二醇)物理方法物理方法(电激和激光电激和激光)资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1 1、仙台病毒法、仙台病毒法 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；此靠近；此靠近；此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细两个原生质体的细胞核互相融合，两个细两个原生质体的细胞核互相融合，两个细两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；胞融为一体；胞融为一体；胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。种染色体的杂种细胞。种染色体的杂种细胞。种染色体的杂种细胞。仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。病毒促使细胞融合的主要步骤如下：病毒促使细胞融合的主要步骤如下：两种细胞在一起培养，加入病毒，在两种细胞在一起培养，加入病毒，在两种细胞在一起培养，加入病毒，在两种细胞在一起培养，加入病毒，在4444条件下病条件下病条件下病条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；在在在在37373737中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要环，此时需要环，此时需要环，此时需要CaCaCaCa2+2+2+2+和和和和MgMgMgMg2+2+2+2+，最适，最适，最适，最适PHPHPHPH为为为为8.08.08.08.0一一一一8.28.28.28.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+和和和和ATPATPATPATP；融合成巨大细胞，仍需融合成巨大细胞，仍需融合成巨大细胞，仍需融合成巨大细胞，仍需ATP ATP ATP ATP。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。u聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEG）法）法资料仅供参考,不当之处，请联系改正。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程资料仅供参考,不当之处，请联系改正。PEG的作用机理的作用机理：由于由于PEG分子具有轻微的负极性，分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。成为可能。PEG诱导融合的特点诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法细胞融合步骤细胞融合步骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3、电融合法、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：电融合法的优点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。电融合的基本过程：电融合的基本过程：细胞膜的接触：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图资料仅供参考,不当之处，请联系改正。五、影响细胞融合的因素五、影响细胞融合的因素1 1、亲本细胞表面性质、亲本细胞表面性质2 2、亲本细胞种类、亲本细胞种类3 3、细胞融合时的温度和运动状态、细胞融合时的温度和运动状态4 4、通氧状态、通氧状态5 5、PEGPEG6 6、离子浓度及种类、离子浓度及种类7 7、PHPH值值 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。六、细胞融合的基本操作过程六、细胞融合的基本操作过程 制备原生质体制备原生质体 由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。诱导细胞融合诱导细胞融合 两亲本细胞两亲本细胞两亲本细胞两亲本细胞(原生质体原生质体原生质体原生质体)的悬浮液调至一定细胞的悬浮液调至一定细胞的悬浮液调至一定细胞的悬浮液调至一定细胞密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙二醇二醇二醇二醇(PEC)(PEC)(PEC)(PEC)等诱导融合，或用电激的方法促进融合。等诱导融合，或用电激的方法促进融合。等诱导融合，或用电激的方法促进融合。等诱导融合，或用电激的方法促进融合。筛选杂合细胞筛选杂合细胞 将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。有双亲遗传特性的杂合细胞。有双亲遗传特性的杂合细胞。有双亲遗传特性的杂合细胞。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物细胞融合过程植物细胞融合过程植物细胞融合过程植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图资料仅供参考,不当之处，请联系改正。七、七、杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选 根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：可将其分为以下几种类型：u异核细胞：非同源细胞的融合体。异核细胞：非同源细胞的融合体。u同核细胞：两个相同细胞的融合体。同核细胞：两个相同细胞的融合体。u多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。常用的杂种细胞筛选方法：常用的杂种细胞筛选方法：u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第二节第二节 动物细胞培养技术及其应用动物细胞培养技术及其应用资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一、通过动物细胞培养可生产的生物制品一、通过动物细胞培养可生产的生物制品1 1 1 1、病毒疫苗、病毒疫苗、病毒疫苗、病毒疫苗2 2 2 2、非抗体免疫调节剂、非抗体免疫调节剂、非抗体免疫调节剂、非抗体免疫调节剂3 3 3 3、多肽生长因子、多肽生长因子、多肽生长因子、多肽生长因子4、激素、激素5、酶、酶6、病毒杀虫剂、病毒杀虫剂7、肿瘤特异性抗原、肿瘤特异性抗原8、单克隆抗体、单克隆抗体9、细胞本身、细胞本身资料仅供参考,不当之处，请联系改正。二、二、动物细胞的形态和生理特点动物细胞的形态和生理特点 1 1、动物细胞的形态、动物细胞的形态 动物细胞属于真核细胞，结构复杂，动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，具分化精确，不同细胞执行不同的功能，具有不同的形态。有不同的形态。但细胞在离体培养时形态会发生变化，但细胞在离体培养时形态会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为：根据不同的需要将离体培养的细胞分为：贴壁细胞贴壁细胞、悬浮细胞悬浮细胞和和兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞 。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（1 1）、）、贴壁细胞贴壁细胞（anchoraged-dependent cellanchoraged-dependent cell）生长时必须要有给以贴附的支持物表面，生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。子才能在该表面上生长和繁殖。大多数动物细胞都属于此类。大多数动物细胞都属于此类。大多数动物细胞都属于此类。大多数动物细胞都属于此类。贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞在表面上生长时有两种形态在表面上生长时有两种形态在表面上生长时有两种形态在表面上生长时有两种形态:成纤维样细胞型和上皮样细胞型。成纤维样细胞型和上皮样细胞型。成纤维样细胞型和上皮样细胞型。成纤维样细胞型和上皮样细胞型。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（2 2 2 2）、）、）、）、非非贴壁细胞贴壁细胞（anchoraged-independent cell）生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转 化细胞，化细胞，化细胞，化细胞，NamalwaNamalwa细胞。细胞。细胞。细胞。（3 3）兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞 对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。也可悬浮生长。如：如：如：如：CHOCHOCHOCHO细胞、细胞、细胞、细胞、BHKBHKBHKBHK细胞、细胞、细胞、细胞、L929L929L929L929细胞。细胞。细胞。细胞。理想的药物生产细胞系理想的药物生产细胞系理想的药物生产细胞系理想的药物生产细胞系资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2 2、动物细胞生理特点、动物细胞生理特点 （1 1 1 1）分裂期长）分裂期长）分裂期长）分裂期长 ，细胞生长缓慢，易受微生物污，细胞生长缓慢，易受微生物污，细胞生长缓慢，易受微生物污，细胞生长缓慢，易受微生物污 染，培养时需要抗生素。染，培养时需要抗生素。染，培养时需要抗生素。染，培养时需要抗生素。（2 2 2 2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。（6 6 6 6）动物细胞蛋白质的合成在内质网上进行，）动物细胞蛋白质的合成在内质网上进行，）动物细胞蛋白质的合成在内质网上进行，）动物细胞蛋白质的合成在内质网上进行，多数为糖蛋白，需要糖基化。多数为糖蛋白，需要糖基化。多数为糖蛋白，需要糖基化。多数为糖蛋白，需要糖基化。（3 3 3 3）正常二倍体细胞的寿命是有限的，正常二倍体）正常二倍体细胞的寿命是有限的，正常二倍体）正常二倍体细胞的寿命是有限的，正常二倍体）正常二倍体细胞的寿命是有限的，正常二倍体细胞传代培养都是有限的。细胞传代培养都是有限的。细胞传代培养都是有限的。细胞传代培养都是有限的。（4 4 4 4）动物细胞对周围环境十分敏感。）动物细胞对周围环境十分敏感。）动物细胞对周围环境十分敏感。）动物细胞对周围环境十分敏感。（5 5 5 5）动物细胞对培养基要求很高。）动物细胞对培养基要求很高。）动物细胞对培养基要求很高。）动物细胞对培养基要求很高。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。动物细胞能精确地转译和加工较大或更复动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质杂的克隆蛋白质;多半可分泌到细胞外，提取纯多半可分泌到细胞外，提取纯化方便化方便;蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。致，适合于临床应用。动物细胞作为宿主细胞生产药物优点：动物细胞作为宿主细胞生产药物优点：缺点：缺点：培养条件要求高、成本高、产量低。培养条件要求高、成本高、产量低。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。三、生产用动物细胞的获得三、生产用动物细胞的获得 直接取自动物组织、器官，经直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。过粉碎、消化后获得的细胞悬液。1 1、原代细胞、原代细胞资料仅供参考,不当之处，请联系改正。原代细胞经过传代、筛选和克原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。细胞株。2 2、二倍体细胞、二倍体细胞资料仅供参考,不当之处，请联系改正。通过转化形成，变成了异倍体，有通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，在传代过无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。动物的肿瘤组织中建立的细胞系。3、转化细胞系、转化细胞系资料仅供参考,不当之处，请联系改正。常用的生产用动物细胞：常用的生产用动物细胞：WI-38WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为倍增时间为倍增时间为倍增时间为2424小时，有限寿命小时，有限寿命小时，有限寿命小时，有限寿命5050代，用于制代，用于制代，用于制代，用于制 备疫苗。备疫苗。备疫苗。备疫苗。MRC-5MRC-5：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42-42-46 46代，用于制备疫苗。代，用于制备疫苗。代，用于制备疫苗。代，用于制备疫苗。CHO-K1CHO-K1：从中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于：从中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于：从中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于：从中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于 构建工程菌。构建工程菌。构建工程菌。构建工程菌。BHK-21BHK-21：从仓鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，：从仓鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，：从仓鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，：从仓鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。用于构建工程菌，可生产疫苗。用于构建工程菌，可生产疫苗。用于构建工程菌，可生产疫苗。VeroVero：从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细 胞，用于制备疫苗。胞，用于制备疫苗。胞，用于制备疫苗。胞，用于制备疫苗。NamalwaNamalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓 瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。四、四、动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基 1 1、动物细胞在体外培养所需条件、动物细胞在体外培养所需条件 （1 1 1 1）水质要求：）水质要求：）水质要求：）水质要求：培养时常采用经活性炭、微滤、超滤、反渗透四培养时常采用经活性炭、微滤、超滤、反渗透四培养时常采用经活性炭、微滤、超滤、反渗透四培养时常采用经活性炭、微滤、超滤、反渗透四级净化处理制得的达到国家标准的纯级净化处理制得的达到国家标准的纯级净化处理制得的达到国家标准的纯级净化处理制得的达到国家标准的纯 净水。净水。净水。净水。（2 2 2 2）pHpHpHpH：影响细胞的存活力，生长及代谢，细胞生长的最适影响细胞的存活力，生长及代谢，细胞生长的最适影响细胞的存活力，生长及代谢，细胞生长的最适影响细胞的存活力，生长及代谢，细胞生长的最适pHpH因细胞因细胞因细胞因细胞类型不同而异，范围为类型不同而异，范围为类型不同而异，范围为类型不同而异，范围为7.0-7.57.0-7.5。（3 3）渗透压：）渗透压：）渗透压：）渗透压：在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持较合适的渗透压液体都保持较合适的渗透压液体都保持较合适的渗透压液体都保持较合适的渗透压和和和和pH,pH,pH,pH,都必须采用等渗的溶液。都必须采用等渗的溶液。都必须采用等渗的溶液。都必须采用等渗的溶液。（4 4）温度：）温度：）温度：）温度：动物细胞对温度特别敏感，一般动物细胞特别是哺乳动物动物细胞对温度特别敏感，一般动物细胞特别是哺乳动物动物细胞对温度特别敏感，一般动物细胞特别是哺乳动物动物细胞对温度特别敏感，一般动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为细胞的最佳培养温度为细胞的最佳培养温度为细胞的最佳培养温度为(37(37士士士士0.50.5)。（5 5 5 5）溶氧：溶氧：溶氧：溶氧：保证有适量的氧气供应。保证有适量的氧气供应。保证有适量的氧气供应。保证有适量的氧气供应。（6 6 6 6）灭菌：）灭菌：）灭菌：）灭菌：所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染。保持绝对无菌，避免污染。保持绝对无菌，避免污染。保持绝对无菌，避免污染。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2 2、动物培养基的种类和组成、动物培养基的种类和组成 （1 1 1 1）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。（2 2 2 2）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供应，成分为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血应，成分为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血应，成分为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血应，成分为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血清等。清等。清等。清等。（3 3 3 3）、无血清培养基：在天然或合成培养基）、无血清培养基：在天然或合成培养基）、无血清培养基：在天然或合成培养基）、无血清培养基：在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。伸展因子及其他元素。伸展因子及其他元素。伸展因子及其他元素。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（1）提供激素及低分子量营养物。）提供激素及低分子量营养物。（2）提供结合蛋白质，能识别维生素、脂类、）提供结合蛋白质，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等。金属和其他激素等。（3）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热 原结合，起到解毒作用原结合，起到解毒作用（4）起酸碱度缓冲剂作用。）起酸碱度缓冲剂作用。（5）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的 胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。血清主要功能：血清主要功能：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（1 1）在在在在进进进进行行行行激激激激素素素素和和和和药药药药物物物物研研研研究究究究时时时时，血血血血清清清清成成成成分分分分与与与与激激激激素素素素或或或或药药药药物物物物结合的结果，干扰了其对细胞的作用。结合的结果，干扰了其对细胞的作用。结合的结果，干扰了其对细胞的作用。结合的结果，干扰了其对细胞的作用。（2 2）在在在在进进进进行行行行细细细细胞胞胞胞营营营营养养养养研研研研究究究究时时时时，由由由由于于于于血血血血清清清清组组组组成成成成的的的的复复复复杂杂杂杂和和和和不不不不稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解。稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解。稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解。稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解。血清对实验的负面影响：血清对实验的负面影响：（3 3 3 3）干扰对培养细胞释放产物的分析）干扰对培养细胞释放产物的分析）干扰对培养细胞释放产物的分析）干扰对培养细胞释放产物的分析 （4 4 4 4）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支原体。除去血清中可能含有的病毒和支原体。除去血清中可能含有的病毒和支原体。除去血清中可能含有的病毒和支原体。（5 5 5 5）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。五、动物细胞五、动物细胞大规模大规模培养技术培养技术1 1、动物细胞的大规模培养方法、动物细胞的大规模培养方法 (1)(1)悬浮培养悬浮培养（2）贴壁培养）贴壁培养（3）贴壁）贴壁-悬浮培养悬浮培养 微载体培养微载体培养微载体培养微载体培养 包埋培养包埋培养包埋培养包埋培养 微曩培养微曩培养微曩培养微曩培养 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(1)(1)悬浮培养悬浮培养 所谓悬浮培养，是指细胞在生物反应器中所谓悬浮培养，是指细胞在生物反应器中自由地悬浮于培养基中生长增殖的过程。自由地悬浮于培养基中生长增殖的过程。优点：优点：操作简便，培养条件较均一，传质操作简便，培养条件较均一，传质和传氧较好，放大效应小，设备相对简单，可和传氧较好，放大效应小，设备相对简单，可以借鉴微以借鉴微生物工程的经验。生物工程的经验。缺点：缺点：细胞密度较低。细胞密度较低。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（2 2）贴壁培养）贴壁培养 贴壁培养是让细胞贴附于某种固体表面贴壁培养是让细胞贴附于某种固体表面生长繁殖的培养方法。生长繁殖的培养方法。优点：优点：适用的细胞种类广，较容易使细适用的细胞种类广，较容易使细胞达到较胞达到较高密度。生产上一般采用转瓶培高密度。生产上一般采用转瓶培养，具有投资少、设备简单、技术成熟、重养，具有投资少、设备简单、技术成熟、重现性高、放大只是简单地增加转瓶数的优点现性高、放大只是简单地增加转瓶数的优点 缺点：缺点：劳动强度大、操作手续繁琐、占劳动强度大、操作手续繁琐、占用空间大、按体积用空间大、按体积计算产率低、监测和控计算产率低、监测和控制环境条件受到限制等。制环境条件受到限制等。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（3 3）贴壁）贴壁-悬浮培养悬浮培养 微载体培养微载体培养 微载体培养即微载体培养即是指将贴附着贴壁细胞的是指将贴附着贴壁细胞的微载体悬浮于培养基中，使细胞在微珠表面微载体悬浮于培养基中，使细胞在微珠表面生长繁殖的培养方式。生长繁殖的培养方式。优点优点优点优点:a.a.a.a.比表面积大，它的单位体积培养基的细胞产率高比表面积大，它的单位体积培养基的细胞产率高比表面积大，它的单位体积培养基的细胞产率高比表面积大，它的单位体积培养基的细胞产率高;b.b.b.b.具有悬浮培养和贴壁培养两种培养的优点，简化了细胞生长各具有悬浮培养和贴壁培养两种培养的优点，简化了细胞生长各具有悬浮培养和贴壁培养两种培养的优点，简化了细胞生长各具有悬浮培养和贴壁培养两种培养的优点，简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，培养系统重现性好种环境因素的检测和控制，培养系统重现性好种环境因素的检测和控制，培养系统重现性好种环境因素的检测和控制，培养系统重现性好;c.;c.;c.;c.用简便的显微镜用简便的显微镜用简便的显微镜用简便的显微镜观察即能监测出细胞在微珠表面的生长情况观察即能监测出细胞在微珠表面的生长情况观察即能监测出细胞在微珠表面的生长情况观察即能监测出细胞在微珠表面的生长情况;d.;d.;d.;d.培养基利用率高培养基利用率高培养基利用率高培养基利用率高;e.;e.;e.;e.收获细胞过程简单收获细胞过程简单收获细胞过程简单收获细胞过程简单;f.;f.;f.;f.放大容易放大容易放大容易放大容易；g.g.g.g.劳动强度小劳动强度小劳动强度小劳动强度小;h.h.h.h.培养系统占用空间小。培养系统占用空间小。培养系统占用空间小。培养系统占用空间小。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。包埋培养包埋培养 将动将动物细胞与海藻酸钠混匀物细胞与海藻酸钠混匀(此时呈液此时呈液态态)，然后将这种混合液滴入到，然后将这种混合液滴入到CaClCaCl2 2溶液中，溶液中，即形成海即形成海藻酸钙凝胶，此凝胶颗粒如上述藻酸钙凝胶，此凝胶颗粒如上述微载体一样可用于悬浮培养。微载体一样可用于悬浮培养。优点：优点：负荷量大、细胞泄负荷量大、细胞泄漏少、制备漏少、制备方法简单、细胞因被保护抗机械剪切力强、方法简单、细胞因被保护抗机械剪切力强、抗污染能力强。抗污染能力强。缺点：缺点：存在扩散存在扩散限制，如大分子基质限制，如大分子基质不能渗透进凝胶内，颗粒太大时细胞生长不不能渗透进凝胶内，颗粒太大时细胞生长不良良.资料仅供参考,不当之处，请联系改正。微曩培养微曩培养 把生物活性物质完整的活细胞或组织包在薄的半把生物活性物质完整的活细胞或组织包在薄的半把生物活性物质完整的活细胞或组织包在薄的半把生物活性物质完整的活细胞或组织包在薄的半透膜中，即称为微囊技术。营养物质和氧可通过膜孔透膜中，即称为微囊技术。营养物质和氧可通过膜孔透膜中，即称为微囊技术。营养物质和氧可通过膜孔透膜中，即称为微囊技术。营养物质和氧可通过膜孔进入囊内，细胞代谢的小分子产物可排出囊外，分泌进入囊内，细胞代谢的小分子产物可排出囊外，分泌进入囊内，细胞代谢的小分子产物可排出囊外，分泌进入囊内，细胞代谢的小分子产物可排出囊外，分泌的大分子产物，不能透过膜孔，积聚在囊内。的大分子产物，不能透过膜孔，积聚在囊内。的大分子产物，不能透过膜孔，积聚在囊内。的大分子产物，不能透过膜孔，积聚在囊内。优点：优点：优点：优点：a.a.细胞密度大细胞密度大细胞密度大细胞密度大；b.b.产物单位体积浓度高产物单位体积浓度高产物单位体积浓度高产物单位体积浓度高；c.c.分离纯化操作经济简便分离纯化操作经济简便分离纯化操作经济简便分离纯化操作经济简便,产品纯度高。产品纯度高。产品纯度高。产品纯度高。缺点：缺点：缺点：缺点：但微囊技术成功率一般只有百分之五十左但微囊技术成功率一般只有百分之五十左但微囊技术成功率一般只有百分之五十左但微囊技术成功率一般只有百分之五十左右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物污染。右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物污染。右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物污染。右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物污染。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2 2、动物细胞大规模培养操作方式、动物细胞大规模培养操作方式（1 1）、分批式培养）、分批式培养 分批式培养是指将细胞和培养基一次性装分批式培养是指将细胞和培养基一次性装人反应器内进行培养。细胞不断生长，营养不人反应器内进行培养。细胞不断生长，营养不断消耗，产物不断形成。经过一段时间培养后，断消耗，产物不断形成。经过一段时间培养后，将整个培养液将整个培养液(连同细胞连同细胞)取出，进行产物分离。取出，进行产物分离。COCOCOCO2 2 2 2培养箱培养箱培养箱培养箱资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（2 2）、半连续式培养）、半连续式培养 半连续式培养又称为反复分批式培养或换半连续式培养又称为反复分批式培养或换液培养，是指在分批式操作的基础上，取出部液培养，是指在分批式操作的基础上，取出部分反应液，剩余部分重新补充新的营养成分，分反应液，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养。再按分批式操作的方式进行培养。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3.3.灌流式培养灌流式培养 灌流式培养是指细胞接种后进行培养，一方灌流式培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加人反应器，另一方面又将反面新鲜培养基不断加人反应器，另一方面又将反应液不断地取出，但细胞停留在反应器内，使细应液不断地取出，但细胞停留在反应器内，使细胞处于一种恒定的营养状态。胞处于一种恒定的营养状态。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3 3、动物细胞大规模培养生物反应器、动物细胞大规模培养生物反应器 优良的传质、传热、混合性能，且对动物优良的传质、传热、混合性能，且对动物细胞剪切力小细胞剪切力小;理化参理化参数易于检测和调节控制数易于检测和调节控制;可用高压蒸汽灭菌可用高压蒸汽灭菌;结构简单、清洗操作方便结构简单、清洗操作方便;密封性能好。密封性能好。理想的反应器应具备的性能理想的反应器应具备的性能:资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（1 1）、通气搅拌反应器）、通气搅拌反应器资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（2 2）、气升式生物反应器：）、气升式生物反应器：空气提升式生物反应器两种构型：空气提升式生物反应器两种构型：内循环式、外循环式内循环式、外循环式资料仅供参考,不当之处，请联系改正。空气流速一般控制在空气流速一般控制在0.010.06m3/m3.min,反应器高径比一般为反应器高径比一般为(3:1)(12:1)资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（1）没有移动部件，产生的湍动温和而均匀，）没有移动部件，产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小，细胞损伤率比较低。剪切力相当小，细胞损伤率比较低。（2）完全密封，便于无菌操作，不易污染。）完全密封，便于无菌操作，不易污染。（3）设计简单，便于放大生产。）设计简单，便于放大生产。（4）直接喷射空气供氧，氧传递速率高，液体）直接喷射空气供氧，氧传递速率高，液体循环量大，使细胞和营养成分能均匀地分布于培养循环量大，使细胞和营养成分能均匀地分布于培养基中。基中。优点：优点：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（3 3）、中空纤维生物反应器）、中空纤维生物反应器资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第三节第三节 植物细胞培养技术及其应用植物细胞培养技术及其应用叶绿体线粒体细胞壁细胞膜液泡细胞质光面内质网细胞核粗面内质网高尔基体资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物植物细胞培养细胞培养技术就是为了某种目的技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。它包括体进行的一系列生物工艺学操作。它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。分离、培养、再生以及一系列相关的操作。一、概念一、概念资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物细胞全能性植物细胞全能性二、植物细胞培养的二、植物细胞培养的理论基础理论基础资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物细胞全能性植物细胞全能性（totipotencytotipotency）：指植）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信遗传信息息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。一个新个体。1958195819581958年，美国科学家斯年，美国科学家斯年，美国科学家斯年，美国科学家斯图尔德将胡萝卜韧皮部图尔德将胡萝卜韧皮部图尔德将胡萝卜韧皮部图尔德将胡萝卜韧皮部的一些细胞进行培养，的一些细胞进行培养，的一些细胞进行培养，的一些细胞进行培养，由于细胞分化而最终发由于细胞分化而最终发由于细胞分化而最终发由于细胞分化而最终发育成完整的新植株。育成完整的新植株。育成完整的新植株。育成完整的新植株。植物体细胞培养产生完整植物示意图植物体细胞培养产生完整植物示意图植物体细胞培养产生完整植物示意图植物体细胞培养产生完整植物示意图细胞培养形成的胡萝卜植株细胞培养形成的胡萝卜植株细胞培养形成的胡萝卜植株细胞培养形成的胡萝卜植株 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物细胞比微生物细胞大植物细胞比微生物细胞大植物细胞比微生物细胞大植物细胞比微生物细胞大5 50 0 0 0 100100100100倍。倍。倍。倍。在细胞培养过程中，其细胞形态有明显变化。在细胞培养过程中，其细胞形态有明显变化。在细胞培养过程中，其细胞形态有明显变化。在细胞培养过程中，其细胞形态有明显变化。三、植物细胞特性三、植物细胞特性1 1、细胞形态特征：、细胞形态特征：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。在间歇培养时，培养初期，多半是在间歇培养时，培养初期，多半是比较大的游离细胞，接着便开始分裂，比较大的游离细胞，接着便开始分裂，随着分裂，原来较大的细胞分裂成一个随着分裂，原来较大的细胞分裂成一个一个较小的细胞，同时，较小的细胞聚一个较小的细胞，同时，较小的细胞聚集成细胞块，在生长停止后，细胞伸长、集成细胞块，在生长停止后，细胞伸长、肥大，块状细胞游离分散。肥大，块状细胞游离分散。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植植物物细细胞胞分分批批培培养养时时，细细胞胞生生长长呈呈S S型型曲曲线线，植植物物细细胞胞生生长速度比较缓慢长速度比较缓慢。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。诱导期诱导期对数增殖对数增殖 转换转换 衰减期衰减期 静静 止止0 40 80 120 160 200 细细胞胞浓浓度度(g/L)培养时间培养时间(h)植物细胞生长曲线植物细胞生长曲线资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2 2、植植物物细细胞胞有有纤纤维维素素细细胞胞壁壁，细细胞胞耐耐拉拉不不耐耐扭扭，抵抵抗抗剪剪切切力力差差。不不能能耐耐受受强强力力通通风风搅搅拌拌。（一一般般为为5050 100100r/minr/min，通通 气气 为为：0.5 0.5 m m3 3/m m3 3minmin）植物细胞特性植物细胞特性资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3 3、培养过程生长速度缓慢，培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素。易受微生物污染，需用抗生素。植物细胞特性植物细胞特性资料仅供参考,不当之处，请联系改正。4 4、培养液粘度大，植物细胞体、培养液粘度大，植物细胞体积大，在培养液中所占的容积可高达积大，在培养液中所占的容积可高达40%40%50%50%，植物细胞培养液的粘度和，植物细胞培养液的粘度和微生物发酵液表现出明显不同，它随微生物发酵液表现出明显不同，它随细胞浓度的增加，粘度显著上升。细胞浓度的增加，粘度显著上升。植物细胞特性植物细胞特性资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物细胞特性植物细胞特性 5 5、植物细胞的二级代谢产物大、植物细胞的二级代谢产物大都送到液泡内堆积而非如微生物排出都送到液泡内堆积而非如微生物排出细胞外，目前产量较低。细胞外，目前产量较低。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。植物细胞培养与微生物培养的比较植物细胞培养与微生物培养的比较特性特性 微生物微生物 植物细胞植物细胞大小大小 2 mm3 3 10105 5 mm3 3 单一细胞单一细胞 经常经常 一般以群体发育一般以群体发育由单细胞生长成细胞群由单细胞生长成细胞群 是是 少有少有加成时间加成时间 大于大于1 1h 1d d接种浓度接种浓度 小小 细胞在培养液中浓度为细胞在培养液中浓度为5%5%20%20%染色体数目染色体数目 单或双倍体单或双倍体 单、双、多及不定倍体混合生长单、双、多及不定倍体混合生长切力切力 不敏感不敏感 敏感敏感单一培养的变异单一培养的变异 安定安定 变异很大变异很大发育发育 可形成孢子或假菌丝可形成孢子或假菌丝 形成器官或胚形成器官或胚通气需求通气需求 高，高，1 1 2 2m3/m3.min 低，低，0.2 0.30.3m3/m3.min 产物形成产物形成 进入菌丝进入菌丝 进入液泡进入液泡资料仅供参考,不当之处，请联系改正。四、植物细胞培养条件四、植物细胞培养条件（一（一)、外植体的制备、外植体的制备 所谓的外植体是指将外界生长的植物的所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。活性的无菌组织和细胞。制备外植体的原则是无菌和有活性，如制备外植体的原则是无菌和有活性，如果外植体被微生物污染则难以存活。果外植体被微生物污染则难以存活。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（二）、无菌操作（二）、无菌操作 无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。事实上外植体的制备过程就是无菌处理无菌。事实上外植体的制备过程就是无菌处理过程，而其后的一系列操作都是在无菌环境下过程，而其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的。进行的。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（三）、人工培养环境（三）、人工培养环境 能否把植物组织培养做到满意的人工能否把植物组织培养做到满意的人工调控，关键在于人工培养环境，包括光照、调控，关键在于人工培养环境，包括光照、温度、温度、湿度、培养基等。湿度、培养基等。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。培培养养基基包包括括植植物物生生长长必必需需的的1616种种营营养养元元素素和和某某些些生生理理活活性性物物质质。所所有有这些物质可概括为这些物质可概括为5 5大类：大类：1 1、植物细胞培养基的营养成分、植物细胞培养基的营养成分资料仅供参考,不当之处，请联系改正。有有13种植物必需的元素种植物必需的元素 N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl，前前6种为大量元素，后种为大量元素，后7种种属微量元素。属微量元素。I虽不是植物生长所必需的，但几虽不是植物生长所必需的，但几乎所有组织培养基中都有，有些培养基还加入乎所有组织培养基中都有，有些培养基还加入Co、Ni、Ti、Be，、，、Al等元素。等元素。（1 1）无机营养物：）无机营养物：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一一一一类类类类是是是是有有有有机机机机营营营营养养养养物物物物质质质质，为为为为植植植植物物物物细细细细胞胞胞胞提提提提供供供供C C、HH、OO、N N等等等等必必必必须须须须元元元元素素素素，如如如如糖糖糖糖类类类类，AAAA等；等；等；等；另另另另一一一一类类类类是是是是一一一一些些些些生生生生理理理理活活活活性性性性物物物物质质质质，在在在在植植植植物物物物代代代代谢谢谢谢中中中中起起起起一一一一定定定定作作作作用用用用。如如如如：维维维维生生生生素素素素及及及及单单单单核核核核苷苷苷苷酸等。酸等。酸等。酸等。（2 2）有机物质：）有机物质：资料仅供参考,不当