生物切片技术课件

电子显微镜生物超薄切电子显微镜生物超薄切片的制备技术片的制备技术一、超薄切片技术理论超薄切片技术理论及操作实践及操作实践超薄切片的概念超薄切片的概念w由于电子显微镜电子束的穿透能力的限制由于电子显微镜电子束的穿透能力的限制,大多数标本在自然状态下太厚大多数标本在自然状态下太厚,而无法观察而无法观察,必须将各类材料如必须将各类材料如;生物样品生物样品,合成材料合成材料,塑塑料料,纤维纤维,骨骼骨骼,矿石矿石.金属等切成厚度金属等切成厚度10-100 10-100 nm nm 的超薄片的超薄片.才可进行观察才可进行观察.w超薄切片术超薄切片术(The Techniques of(The Techniques of UltrathinUltrathin Section)Section)是最基本的透射电镜样品制备技术是最基本的透射电镜样品制备技术,需要借助超薄切片机制备样品，切片的厚度需要借助超薄切片机制备样品，切片的厚度小于小于100nm(100nm(一般一般303070nm).70nm).超薄切片的应用超薄切片的应用w超薄切片术超薄切片术被广泛用于揭示样品的超微被广泛用于揭示样品的超微结构。结构。w超薄切片术也是超薄切片术也是电镜细胞化学、免疫电电镜细胞化学、免疫电镜镜,电镜放射自显影、电镜放射自显影、X-X-射线微区元素射线微区元素分析分析等技术的基础，是研究生物医学样等技术的基础，是研究生物医学样品的超微结构及其功能的有力工具。它品的超微结构及其功能的有力工具。它分为普通超薄切片术和冷冻超薄切片术分为普通超薄切片术和冷冻超薄切片术两大类。两大类。超薄切片的分类w普通超薄切片:不需要特殊不需要特殊的冷冻条件和装置的常规的冷冻条件和装置的常规包埋切片技术。包埋切片技术。w冷冻超薄切片:样品迅速冷冻,用冷冻超薄切片机进行切片.而不需要常规的繁琐的固定与包埋的程序.普通超薄切片术普通超薄切片术w取材取材-固定固定-脱水脱水-渗透渗透-包埋包埋-聚合聚合-切片切片-染色等几大部分。染色等几大部分。w其中每一部分都是重要的环节，都直接其中每一部分都是重要的环节，都直接与样品的质量相关，而样品质量的优劣与样品的质量相关，而样品质量的优劣又与观察结果密切相关，所以为了得到又与观察结果密切相关，所以为了得到可靠和满意的结果，需要步步谨慎认真。可靠和满意的结果，需要步步谨慎认真。取材和固定的原则w取材应遵循取材应遵循准确准确;迅速迅速;体积小体积小;低温低温;防防损伤损伤，的操作原则，的操作原则.w优质的固定是关键环节之一优质的固定是关键环节之一;材料的体材料的体积大于积大于1立方毫米时立方毫米时,由于固定液的渗透由于固定液的渗透速率的限制速率的限制,样本的中心部位的固定效样本的中心部位的固定效果会受到影响果会受到影响.w超薄切片的样品块比石蜡切片小得多，一般超薄切片的样品块比石蜡切片小得多，一般约为约为1mm1mm立方毫米；这就要求取材的部位一定立方毫米；这就要求取材的部位一定要准确：以免花费大量的劳作，却观察不到要准确：以免花费大量的劳作，却观察不到所需的结构。所需的结构。w动物被处死之后：机体内的组织细胞就脱离动物被处死之后：机体内的组织细胞就脱离了正常的生存环境，细胞的自溶作用会导致了正常的生存环境，细胞的自溶作用会导致其坏死，致使超微结构发生改变而影响研究其坏死，致使超微结构发生改变而影响研究的结果；为了把这种损伤减到最小，处死动的结果；为了把这种损伤减到最小，处死动物后，要争取在物后，要争取在1-21-2分钟内完成取材用分钟内完成取材用)，并，并立即把样品浸入固定液中立即把样品浸入固定液中.w样品超微结构极脆弱，为防止各种人为的损样品超微结构极脆弱，为防止各种人为的损伤，在操作过程中要格外小心，最好选用新伤，在操作过程中要格外小心，最好选用新的锋利的解剖工具的锋利的解剖工具,操作尽量轻巧，以避免挤操作尽量轻巧，以避免挤压。压。取材操作的方法w(1)动物组织：用乙醚使动物轻微麻醉，迅动物组织：用乙醚使动物轻微麻醉，迅速解剖，准确地取下材料；立即浸入速解剖，准确地取下材料；立即浸入2 2一一5 5戊二醛进行戊二醛进行前固定前固定，并用锋利的双面刀片：，并用锋利的双面刀片：将样品切成将样品切成1mm1mm的碎块的碎块,于于44固定固定1 1小时以上。小时以上。(如果需要更长时间的前固定，需适时更换新如果需要更长时间的前固定，需适时更换新鲜的固定液鲜的固定液,并尽可能在；并尽可能在；44冰箱中保存。冰箱中保存。)w用缓冲液处理用缓冲液处理1010一一3030分钟，以洗去前固定液，分钟，以洗去前固定液，然后在然后在44下，用下，用1-21-2四氧化锇四氧化锇(即锇酸即锇酸)进进行行后固定后固定1212小时小时 .(2)细菌、单细胞：琼脂包埋法细菌、单细胞：琼脂包埋法w培养的细胞：培养的细胞：(包括悬浮或贴壁生长包括悬浮或贴壁生长)，对贴，对贴壁生长的细胞需要先用壁生长的细胞需要先用0 05 5胰酶处理若干胰酶处理若干分钟，或用薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落，分钟，或用薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落，先离心，先离心，510510培养液中的有机成分，提高样培养液中的有机成分，提高样品质量。品质量。)立即立即2 25 5戊二醛，在戊二醛，在44下固下固定定10106060分钟，离心分钟，离心(条件同前条件同前)，弃上清液。，弃上清液。先用先用40405050恒温水浴使恒温水浴使2 2琼脂熔化，并向琼脂熔化，并向离心管中注入适量埋没细胞团，离心管中注入适量埋没细胞团，(离心套管中离心套管中亦加入温水亦加入温水),),离心离心(3 000g(3 000g，1 1分钟分钟)，使其凝，使其凝固成含有细胞团的小块，冷却后取出，用锋固成含有细胞团的小块，冷却后取出，用锋利的双面刀片切成约利的双面刀片切成约lmmlmm立方毫米碎块即可立方毫米碎块即可.(3)植物材料w植物材料比其他材料稳定,离体后变化稍慢;植物叶片切取宽X长=1X3-4毫米的细条,茎和根可切成细条或1毫米立方小块;w表面有毛刺的材料,需用酶处理进行软化;w表面有蜡质的材料,可在50%的乙醇在浸泡数秒钟进行脱蜡.固定目的及良好固定的标准固定目的及良好固定的标准w由于在电镜下一般不可能观察活细胞，由于在电镜下一般不可能观察活细胞，所以，在电镜观察之前，必须先把细胞所以，在电镜观察之前，必须先把细胞固定固定(杀死杀死)。固定的目的，首先是把细。固定的目的，首先是把细胞可动的动态系统转变成不可动的、稳胞可动的动态系统转变成不可动的、稳固的胶体，固的胶体，固定的概念w用化学法和物理法迅速杀死细胞的过程固定的目的和要求w固定的目的是在分子水平上真实的保存细胞超微结构的每一细节.固定液的作用固定液的作用w破坏细胞的酶系统破坏细胞的酶系统,阻止细胞的自溶阻止细胞的自溶;w稳定细胞物质成分稳定细胞物质成分,核酸核酸,核蛋白核蛋白,糖类糖类,脂类脂类,使它们发生交联使它们发生交联,保存组织成分保存组织成分;w在一些组分的分子间以化学和物理反应建立在一些组分的分子间以化学和物理反应建立交联交联,提供骨架结构来稳定各种细胞器的空间提供骨架结构来稳定各种细胞器的空间构型构型;w提供一定的电子反差提供一定的电子反差.固定剂固定剂w化学固定剂化学固定剂w凝聚固定剂：凝聚固定剂：w此种固定剂能使蛋白质发生不可逆转的、永久的变性，此种固定剂能使蛋白质发生不可逆转的、永久的变性，凝聚成大块的沉淀。凝聚成大块的沉淀。w这类固定剂包括乙醇、丙酮、醋酸、苦味酸及某些重这类固定剂包括乙醇、丙酮、醋酸、苦味酸及某些重金属，它们不适合固定电镜样品，而只适合用于光学金属，它们不适合固定电镜样品，而只适合用于光学显微镜样品的固定。显微镜样品的固定。w非凝聚固定剂非凝聚固定剂:w此种固定剂使蛋白质交联成稳定的凝胶，而蛋白质分此种固定剂使蛋白质交联成稳定的凝胶，而蛋白质分子结构不发生明显的变化子结构不发生明显的变化,.w此类固定剂包括四氧化锇醛类、高锰酸钾、重铬酸此类固定剂包括四氧化锇醛类、高锰酸钾、重铬酸钾等。钾等。固定的种类固定的种类w按固定液的成分划分，可分为单固定、双固定和多重固定等。w单固定是只用戊二醛或四氧化饿固定，一般用于单细胞样品或易渗透的样品。w双固定指先用戊二醛或多聚甲醛作前固定，再用四氧化锇作后固定，这种方法效果好，应用广泛。w多重固定指联合使用三种以上的固定剂以达到取长补短的目的。四氧化锇四氧化锇w能能与与各各种种氨氨基基酸酸、肽肽及及蛋蛋白白质质反反应应，在在蛋蛋白白质分子之间形成交联，使蛋白质固定；质分子之间形成交联，使蛋白质固定；w能与不饱和脂肪酸反应能与不饱和脂肪酸反应,使脂肪得以固定；使脂肪得以固定；w可可以以固固定定脂脂蛋蛋白白，使使生生物物膜膜结结构构的的主主要要成成份份磷脂蛋白稳定；磷脂蛋白稳定；w可以与变性可以与变性DNA及核蛋白反应及核蛋白反应;w但不能固定天然但不能固定天然DNA,RNA及糖元；及糖元；w具有电子染色效应。具有电子染色效应。醛类固定剂醛类固定剂w此此类类固固定定剂剂的的优优点点是是穿穿透透力力强强，不不容容易易使使酶酶失活失活;w能能够够固固定定糖糖元元及及保保存存微微管管结结构构,长长时时间间的的固固定定不会使组织变脆。不会使组织变脆。缺点缺点w不能保存脂肪，无电子染色作用不能保存脂肪，无电子染色作用w对细胞膜的染色较差。对细胞膜的染色较差。w本本组组染染色色剂剂主主要要有有；戊戊二二醛醛、甲甲醛醛、多多聚聚甲甲醛、丙稀醛。醛、丙稀醛。高锰酸钾高锰酸钾w可固定脂蛋白；可固定脂蛋白；w神经髓鞘神经髓鞘;w叶绿体叶绿体;w各种膜结构。各种膜结构。固定的方法固定的方法w浸泡固定法浸泡固定法;w血管灌注固定法血管灌注固定法;w植物材料固定法植物材料固定法;w培养细胞及细菌的固定培养细胞及细菌的固定 由于各种固定剂的穿透能力不同由于各种固定剂的穿透能力不同,材料材料的材质的不同的材质的不同,固定的时间亦不同固定的时间亦不同,一般一般是用是用2-5%2-5%的醛类前固定的醛类前固定1-31-3小时小时,再用再用1%1%的四氧化锇后固定的四氧化锇后固定1-21-2小时小时.固定注意点固定注意点w固定剂的种类固定剂的种类;固定剂的浓度固定剂的浓度;w固定液的固定液的PH,PH,渗透压渗透压,离子强度等离子强度等1.1.固定温度固定温度,渗透效率渗透效率;2.2.样品的种类样品的种类,特点特点,块的大小块的大小;3.3.固定之后的缓冲液的充分清洗固定之后的缓冲液的充分清洗,避免固定液之避免固定液之间、固定液与脱水剂之间的反应或产生沉淀间、固定液与脱水剂之间的反应或产生沉淀;4.4.特殊材料的预处理特殊材料的预处理,植物有气泡而漂浮植物有气泡而漂浮,真菌真菌孢子的与水溶液不亲和性孢子的与水溶液不亲和性.利用抽真空利用抽真空,加辅加辅助剂以帮助固定液的渗透助剂以帮助固定液的渗透.良好固定的细胞成分的超微结构形态良好固定的细胞成分的超微结构形态细胞壁和细胞膜细胞质基质内质网(粗糙型)膜内质网(光滑型)膜致密并基本分层,无断裂微细的颗粒沉淀微细的颗粒沉淀,无空白空间无空白空间扁平腔扁平腔,两侧均匀的排列核糖蛋白体颗粒两侧均匀的排列核糖蛋白体颗粒完整的分叉管完整的分叉管,无核糖蛋白体颗粒无核糖蛋白体颗粒高尔基体高尔基体线粒体线粒体核膜核膜核内容物核内容物质膜质膜完整的膜完整的膜,扁平曩池成叠排列扁平曩池成叠排列无膨胀无膨胀,无收缩无收缩,双层膜与内膜完整双层膜与内膜完整,基质致密基质致密双层膜平行双层膜平行,无损伤无损伤密度均匀密度均匀,染色质团分散在核膜附近染色质团分散在核膜附近完整完整,低倍时为单层低倍时为单层,高倍为三层结构高倍为三层结构质体质体外层双层结构外层双层结构,片层结构互相联接片层结构互相联接,基质致密基质致密脱脱 水水w脱水是用适当的有机溶剂取代细胞中的游离脱水是用适当的有机溶剂取代细胞中的游离水水,组织结构中的水分在电镜的高真空状态下组织结构中的水分在电镜的高真空状态下急聚收缩而遭到破坏急聚收缩而遭到破坏;同时常用的包埋剂是非同时常用的包埋剂是非水溶性的水溶性的,细胞中的游离水影响包埋剂的浸透细胞中的游离水影响包埋剂的浸透,因此必须用一种和水及渗透均能互溶的惰性因此必须用一种和水及渗透均能互溶的惰性液体完全取代之。液体完全取代之。w常用的脱水剂常用的脱水剂:乙醇乙醇,丙酮丙酮,环氧丙烷环氧丙烷.聚乙二聚乙二醇及环氧丙烷等醇及环氧丙烷等w选用脱水剂与包埋剂相关选用脱水剂与包埋剂相关,彼此应是互溶彼此应是互溶.组织块脱水步骤组织块脱水步骤30%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,450%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,470%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,4,可延长或过夜可延长或过夜90%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,室温进行室温进行100%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟X X2次次浸透与包埋浸透与包埋w浸透：用某种液体介质（包埋剂）渗入浸透：用某种液体介质（包埋剂）渗入组织块取代脱水剂，这种液体介质能聚组织块取代脱水剂，这种液体介质能聚合、硬化成固体，并提供足够的弹性以合、硬化成固体，并提供足够的弹性以便进行超薄切片。便进行超薄切片。浸透与包埋浸透与包埋w浸透与包埋的目的是使包埋剂逐步渗透入组浸透与包埋的目的是使包埋剂逐步渗透入组织内部织内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合以便与细胞外的包埋剂同时聚合,保保证样品有均匀的硬度证样品有均匀的硬度,利于切片操作利于切片操作.w浸透浸透：用脱水剂与包埋剂按一定比例混合：用脱水剂与包埋剂按一定比例混合.将将样品在样品在25-3725-37时与样品反应时与样品反应1-51-5小时小时.w包埋包埋：在浸透后使用纯包埋剂：在浸透后使用纯包埋剂.将温度逐渐升将温度逐渐升高至高至60,60,使包埋剂发生聚合反应使包埋剂发生聚合反应,聚合不少聚合不少于于4848小时小时.浸透剂的配制及浸透时间浸透剂的配制及浸透时间脱水剂脱水剂:包埋剂包埋剂动物材料动物材料植物材料植物材料体外培养体外培养细胞细胞3:11小时10.51:1141120.511:3122120.5包埋剂的性质包埋剂的性质w包埋剂的要求包埋剂的要求;1.1.有适当的硬度和良好的切割性能有适当的硬度和良好的切割性能;2.2.较低的粘度较低的粘度,利于自由渗透入样品利于自由渗透入样品;3.3.能溶于脱水剂能溶于脱水剂;4.4.透明度好透明度好,有一定的反差有一定的反差;5.5.聚合前后体积不发生大的变化聚合前后体积不发生大的变化,能经受电子速能经受电子速的轰击的轰击;6.6.高倍镜下不显示本身的任何细微结构高倍镜下不显示本身的任何细微结构.7 7 来源丰富，无毒无害。来源丰富，无毒无害。常用包埋剂及配方常用包埋剂及配方w环氧树脂是通常用的包埋剂环氧树脂是通常用的包埋剂,其具有对其具有对细胞细微结构有较好的保存性能细胞细微结构有较好的保存性能,聚合聚合后体积收缩变化不大后体积收缩变化不大(2-5%),(2-5%),在真空中在真空中能经受较长时间的轰击能经受较长时间的轰击.w缺点缺点:操作不太方便操作不太方便;电子反差较弱电子反差较弱.环氧树脂聚合的原理环氧树脂聚合的原理w环氧树脂为热朔性树脂环氧树脂为热朔性树脂,呈淡黄色半液体呈淡黄色半液体,与与一定比例的硬化剂、加速剂在一定温度下形一定比例的硬化剂、加速剂在一定温度下形成不可朔的交联的黄色固体成不可朔的交联的黄色固体.其反应实质其反应实质:它它有两种化学反应基团有两种化学反应基团,结构链的两端是还氧基结构链的两端是还氧基,中间有羟基中间有羟基,还氧末端打开后与胺类结合还氧末端打开后与胺类结合,因因此此,一但胺基结合上去一但胺基结合上去,头尾相接头尾相接.聚会成长链聚会成长链;同时中间的羟基易与酸酐联合同时中间的羟基易与酸酐联合,形成树脂分形成树脂分子间横桥子间横桥,故将树脂、胺、酸酐混合加热故将树脂、胺、酸酐混合加热,便便发生三维聚合发生三维聚合,形成稳定的含聚酯、聚醚、抗形成稳定的含聚酯、聚醚、抗热溶的惰性物质热溶的惰性物质.wEpon812Epon812包埋剂包埋剂:组成组成:Epon812-环氧树脂环氧树脂DDSA-十二烷基琥珀酸酐十二烷基琥珀酸酐(软性固化剂软性固化剂)MNA-六甲酸酐六甲酸酐(硬性固化剂硬性固化剂)DMP-30-2,4,6-三三(二甲基氨基甲基苯酚二甲基氨基甲基苯酚)(加速剂加速剂)w甲基丙稀酸脂甲基丙稀酸脂组成组成:甲基丙稀甲脂甲基丙稀甲脂(硬性固化剂硬性固化剂)甲基丙稀丁脂甲基丙稀丁脂(软性固化剂软性固化剂)氧化苯甲脂氧化苯甲脂(催化剂催化剂)w聚酯树脂聚酯树脂w水溶性包埋剂水溶性包埋剂)包埋方式包埋方式w常规包埋法常规包埋法;w定向包埋法定向包埋法;w倒扣胶囊包埋法倒扣胶囊包埋法;w细胞原位包埋法细胞原位包埋法徕卡超薄徕卡超薄切片机切片机超超薄薄切切片片机机模模式式图图修修块块方方法法示示意意图图LKB 7800 B LKB 7800 B 型型 制制 刀刀 机机优质刀和劣质刀模式图优质刀和劣质刀模式图玻璃刀水槽的制作过程玻璃刀水槽的制作过程载网和支持膜载网和支持膜载网载网w（一）（一）.载网的选择载网的选择 w 1 1）材质）材质w 2 2）载网的直径尺寸）载网的直径尺寸w 3 3）孔形）孔形载网的清洗载网的清洗w新网的清洗新网的清洗-去油污去油污 无水乙醇无水乙醇(3(3次次)-)-丙酮丙酮-无尘烘干无尘烘干w旧网的清洗旧网的清洗 1 1）酸碱法酸碱法H H2 2SOSO443 3分钟分钟H H2 2O 3O 3次次-NH-NH3 3OH3OH3分钟分钟CC2 2H H5 5OHOH烘干烘干1:1=1:1=蒸馏水蒸馏水:冰醋酸冰醋酸数次数次-蒸馏水蒸馏水100%100%乙醇乙醇2 2次次烘干烘干10%10%NaOHNaOH煮数煮数分钟分钟-100%-100%乙醇乙醇2 2次次烘干烘干 2 2）超声波清洗法超声波清洗法样品支持膜的制备样品支持膜的制备w（一）（一）福尔莫瓦膜福尔莫瓦膜w（二）（二）火棉胶膜火棉胶膜w（三）（三）帕罗丁支持膜帕罗丁支持膜w（四）（四）碳膜碳膜w（五（五）微筛膜微筛膜w1）哈气法）哈气法2）甘油法）甘油法3）气压法）气压法样品支持膜的特点样品支持膜的特点w支持膜本身没有结构，薄而透明，易被电子支持膜本身没有结构，薄而透明，易被电子穿透，有足够的机械强度，经得住电子束的穿透，有足够的机械强度，经得住电子束的轰击；不与样品发生化学反应。其厚度在轰击；不与样品发生化学反应。其厚度在150A150A左右为宜，太厚会增加电子散射，降低左右为宜，太厚会增加电子散射，降低分辨率和反差。分辨率和反差。w常用的支持膜有福尔艾瓦常用的支持膜有福尔艾瓦(Formvar)膜、火棉膜、火棉胶膜、帕罗丁胶膜、帕罗丁(Parlodion)膜、碳膜。膜、碳膜。前几种是有机膜，能满足一般分辨率的要求，对于高分辨率的研究，需用纯碳膜。有时为了增强有机膜的强度，可再喷度一层碳作为加固膜。制备膜的条件及要求制备膜的条件及要求w1）膜的厚度；）膜的厚度；150Aw2)膜的强度；膜的强度；w3）制制作作时时的的环环境境如如温温度度，湿湿度度，空气含尘度空气含尘度等等样品支持膜的制备w1 1福尔瓦膜：福尔莫瓦的化学名称是福尔瓦膜：福尔莫瓦的化学名称是聚乙烯醇缩甲醛，特点是机械强度高。聚乙烯醇缩甲醛，特点是机械强度高。w常配成常配成0.2-0.50.2-0.5的氯仿的氯仿(或二氯乙烯或二氯乙烯)溶液，用干净的玻片浸入溶液后取出，溶液，用干净的玻片浸入溶液后取出，表而形成一层薄膜，然后利用水的表面表而形成一层薄膜，然后利用水的表面张力作用，将膜剥离到水面上。张力作用，将膜剥离到水面上。w 1.1.沾取膜溶液沾取膜溶液 2.2.膜形成膜形成 3.3.膜的剥离膜的剥离 4.4.漂膜浮漂膜浮 5.5.放置铜网放置铜网 6.6.捞膜捞膜w2火棉胶膜：火棉胶的机械强度比火棉胶膜：火棉胶的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作较容易。福尔莫瓦膜弱，但制作较容易。w常配成常配成12的醋酸异戊酯的醋酸异戊酯(或醋酸或醋酸戊酯戊酯)溶液，采用漏斗法或贴附法制溶液，采用漏斗法或贴附法制膜。火棉胶溶液滴在水面上后，能膜。火棉胶溶液滴在水面上后，能自行散开形成薄膜，然后排除或吸自行散开形成薄膜，然后排除或吸去水溶液，膜自然降到铜网上去水溶液，膜自然降到铜网上。a.漏斗法漏斗法b.平皿法平皿法1.火棉胶火棉胶2.蒸馏水蒸馏水3.漏斗漏斗4.铜网铜网5.吸吸管管6.水阀水阀7.滤纸滤纸8.平皿平皿w3帕罗丁支持膜：帕罗丁支持膜：目前国外较多用目前国外较多用帕罗丁支持膜。帕罗丁支持膜。w一般配制一般配制3030左右的帕罗丁醋酸戊酯溶左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法和火棉胶膜制法相同，其液制膜，方法和火棉胶膜制法相同，其强度优于火棉胶膜。强度优于火棉胶膜。w4.碳膜碳膜:碳膜的机械性能及化学稳定性好，碳膜的机械性能及化学稳定性好，适合高分辨率样品的观察。通常是利用适合高分辨率样品的观察。通常是利用真空喷镀仪，采用碳升华喷镀法制备真空喷镀仪，采用碳升华喷镀法制备.w复合支持膜复合支持膜:为增强有机膜的机强度为增强有机膜的机强度,在有机膜上再喷度有层在有机膜上再喷度有层50100A的碳膜的碳膜.使之有良好的透明度使之有良好的透明度.1.真空罩2.碳棒3.对照白磁板4.铜网w5 5微孔支持膜微孔支持膜(微筛微筛)：采用特殊方：采用特殊方法在有机膜上形成大量微筛孔法在有机膜上形成大量微筛孔,由于由于穿孔处无支持膜背景影响，切片样穿孔处无支持膜背景影响，切片样品反差和分辨率更好。适合高分辨品反差和分辨率更好。适合高分辨率样品的观察率样品的观察.其制备方法有哈气法、其制备方法有哈气法、甘油法及气压法。甘油法及气压法。w (1)(1)哈气法：哈气法：w (2)(2)甘油法：甘油法：w (3)(3)气压法气压法w(1)哈气法：当玻片从福尔莫瓦溶液中哈气法：当玻片从福尔莫瓦溶液中慢慢提出后，在溶剂慢慢提出后，在溶剂(氯仿等氯仿等)，尚未挥，尚未挥发发之前，对着玻片上的薄膜轻轻哈气，便之前，对着玻片上的薄膜轻轻哈气，便会形成大量微筛孔，待干后剥落在水面会形成大量微筛孔，待干后剥落在水面即成微孔支持膜。即成微孔支持膜。w(2)甘油法：仅在福尔艾瓦膜溶液中甘油法：仅在福尔艾瓦膜溶液中加入少量甘油加入少量甘油，按常规福尔莫瓦膜按常规福尔莫瓦膜的制备方即可制得微筛孔约的制备方即可制得微筛孔约0.0525um之间的支持膜。之间的支持膜。w(3)(3)气压法：将一干净新玻片浸入福气压法：将一干净新玻片浸入福尔莫瓦溶液，取出后放到另一个充尔莫瓦溶液，取出后放到另一个充痛二氯乙烯饱和的蒸汽密闭器皿内痛二氯乙烯饱和的蒸汽密闭器皿内10102020分钟，待多余的溶液流掉后，分钟，待多余的溶液流掉后，将盖打开立即向玻片上喷温湿空气将盖打开立即向玻片上喷温湿空气,未干的玻片上凝集了湿气后未干的玻片上凝集了湿气后,大量的大量的水滴将薄的福尔莫瓦破开成很多的水滴将薄的福尔莫瓦破开成很多的微孔微孔.修修块块w修块是成功切出完美切片带的关键。修块是成功切出完美切片带的关键。通常通过手工或机器将包埋块修成金字通常通过手工或机器将包埋块修成金字塔形塔形(四面锥体形四面锥体形)，块面为梯形或长方，块面为梯形或长方形，其上下底边一定要平行。块面不宜形，其上下底边一定要平行。块面不宜太宽，否则会导致切片过程阻力增大，太宽，否则会导致切片过程阻力增大，在切片上形成波纹材的颤痕。在切片上形成波纹材的颤痕。对刀w切片对刀过程是按一定要求逐渐缩短标切片对刀过程是按一定要求逐渐缩短标本块顶面与刀口间的距离使之尽可能靠本块顶面与刀口间的距离使之尽可能靠近，但绝不触挨着。这一步非常重要，近，但绝不触挨着。这一步非常重要，操作时应格外小心和耐心。很多钻石刀操作时应格外小心和耐心。很多钻石刀是因对刀操作不慎而遭损伤的。尽管钻是因对刀操作不慎而遭损伤的。尽管钻石刀可切很硬的标本，但从刀口侧面来石刀可切很硬的标本，但从刀口侧面来的力极易损坏刀口的力极易损坏刀口w对于对于REICHERT，RMC，LKB的的NOVA以后的各型切片机，对刀时一定以后的各型切片机，对刀时一定要使用其暗视野光源要使用其暗视野光源(刀座下的光源刀座下的光源)，这时经修整的包埋的顶面会有良好的干这时经修整的包埋的顶面会有良好的干涉反光，利用它可清楚、准确地判断刀涉反光，利用它可清楚、准确地判断刀口与它口与它埋块之间的距离，实现快速、安埋块之间的距离，实现快速、安全对刀，有效地降低损坏刀口全对刀，有效地降低损坏刀口的危险性。的危险性。w对于对于LKB、N、V型等无这种光型等无这种光源的切片机，可通过在刀座上粘源的切片机，可通过在刀座上粘一铝箔纸或自己加装一简单的光一铝箔纸或自己加装一简单的光源源(可用手电光源改装可用手电光源改装)，以方便，以方便对刀操作。对刀操作。w对刀时务必锁住切片机的标本臂。特别对刀时务必锁住切片机的标本臂。特别是对于是对于REICHERT的各种切片机，一定的各种切片机，一定要将右边的手轮锁住后再对刀，否则极要将右边的手轮锁住后再对刀，否则极易发生损坏钻石刀的意外事故。易发生损坏钻石刀的意外事故。注意w为了切片顺利、保证钻石刀的经久耐用，请为了切片顺利、保证钻石刀的经久耐用，请一定：一定：w 不要将有机溶剂不要将有机溶剂(如丙酮等如丙酮等)加到槽液里，因加到槽液里，因为它们：为它们：w 可能会软化或侵蚀刀口两旁的封槽树脂，可能会软化或侵蚀刀口两旁的封槽树脂，造成漏水；造成漏水；w 会降低水的表面张力，造成切片展开不匀；会降低水的表面张力，造成切片展开不匀；w 会损伤标本的细微结构。会损伤标本的细微结构。切片w正确对刀：包埋块顶面的各边应与刀口平行正确对刀：包埋块顶面的各边应与刀口平行显微镜调至高倍操作。显微镜调至高倍操作。w旋紧刀台、标本夹头、标本臂上的有关螺旋紧刀台、标本夹头、标本臂上的有关螺w将双筒显微镜仔细核对随刀质控检测卡，按将双筒显微镜仔细核对随刀质控检测卡，按要求调整好各项参数要求调整好各项参数(切片速度、切片速度、间隙角、切间隙角、切片厚度片厚度)。w调整刀槽里的水平面，直至浸湿刀口、又有调整刀槽里的水平面，直至浸湿刀口、又有良好的反光面。良好的反光面。钉。钉。w切片厚度应控制在各种钻石刀所限范围切片厚度应控制在各种钻石刀所限范围内：超薄内：超薄200nm200nm，半薄片半薄片1um1um，冷冻超薄冷冻超薄1um1um，光镜切片光镜切片5um5um。w包埋块应聚合完全，切片不宜过宽；包埋块应聚合完全，切片不宜过宽；w捞片时应避免手指、镊子、载网、白金捞片时应避免手指、镊子、载网、白金耳环等硬物碰触刀口；耳环等硬物碰触刀口；w通常切片过程中，在即将切到标本时，通常切片过程中，在即将切到标本时，标本会带水，此时可适当降低液面，用标本会带水，此时可适当降低液面，用滤纸条吸干标本上的水，待切到标本时滤纸条吸干标本上的水，待切到标本时再提高液面至既浸湿刀口又有良好的反再提高液面至既浸湿刀口又有良好的反光。光。w若刀口背面脏若刀口背面脏(如粘有残片如粘有残片)，也会导，也会导致标本带水。致标本带水。问题：问题：颤痕颤痕w原因：切片出现波纹状的颤痕原因：切片出现波纹状的颤痕,可能是：可能是：w 外界震动外界震动(人员走动、建筑工地、人员走动、建筑工地、机器等机器等)，w 切片机未放稳或机器本身有问题；切片机未放稳或机器本身有问题；切片震颤切片震颤w相关部件相关部件(标本夹、刀子、刀架等标本夹、刀子、刀架等)固定固定不紧：不紧：w切片太宽、切片过程阻力太大；切片太宽、切片过程阻力太大；w对刀时标本相对刀口的高低位置不当；对刀时标本相对刀口的高低位置不当；w包埋块聚合不好或块太软；包埋块聚合不好或块太软；w间隙角太小、导致标本面与钻石刀面摩间隙角太小、导致标本面与钻石刀面摩擦。擦。w将切片机移位，避开震源；将切片机移位，避开震源；切片不能连成带切片不能连成带w包埋块太软；包埋块太软；w刀角太大；刀角太大；w刀口变钝；刀口变钝；w间隙角太大；间隙角太大；w切片速度太快切片速度太快w用烘烤用烘烤冷冻法使标本变硬冷冻法使标本变硬切片缺痕切片缺痕w因刀口有缺口造成切片上有缺痕外，尚有：因刀口有缺口造成切片上有缺痕外，尚有：w标本聚合不好；或软硬度不均匀标本聚合不好；或软硬度不均匀;w树脂对标本的渗透不佳；树脂对标本的渗透不佳；w换另一包埋块。换另一包埋块。捞捞片片w捞片前请先用滤纸条蘸三氯甲烷或二甲捞片前请先用滤纸条蘸三氯甲烷或二甲苯置切片上方熏片，这样得到的切片更苯置切片上方熏片，这样得到的切片更薄、更平整。薄、更平整。w用睫毛笔将切片带轻轻拨开，使切片带用睫毛笔将切片带轻轻拨开，使切片带34个为宜。个为宜。w选用铜网，以膜面朝下，轻轻粘取切片，选用铜网，以膜面朝下，轻轻粘取切片，一个铜网上可粘取一个铜网上可粘取12排切片带。排切片带。切片厚度的判断切片厚度的判断w理想状态下，水槽液面上漂浮的一条厚度均理想状态下，水槽液面上漂浮的一条厚度均匀的连续切片带，在实际操作中的干扰因素匀的连续切片带，在实际操作中的干扰因素造成片的厚薄相差较大。通过切片机上的干造成片的厚薄相差较大。通过切片机上的干涉光判断切片的厚薄。涉光判断切片的厚薄。干涉颜色干涉颜色暗灰色暗灰色灰色灰色银白色银白色金黄色金黄色紫色紫色切片厚度切片厚度A400以下 400500500700700900900以上切片的染色切片的染色w染色的意义：组成生物样品的原子序数较低，散射电染色的意义：组成生物样品的原子序数较低，散射电子的能力都较弱，互相无明显的电子散射差异，切片子的能力都较弱，互相无明显的电子散射差异，切片需要染色后方可提高样品的电子反差需要染色后方可提高样品的电子反差,利于观察。利于观察。w电子染色：即用铀、铅、锇、钨等重金属盐类中的重电子染色：即用铀、铅、锇、钨等重金属盐类中的重金属与样品中某些成分的结合或被吸附，不同结构上金属与样品中某些成分的结合或被吸附，不同结构上吸附不等数量的重金属原子吸附不等数量的重金属原子,结合较多的区域（结构结合较多的区域（结构致密，原子序数较高），具有强的电子散射能力，在致密，原子序数较高），具有强的电子散射能力，在电镜下为致密的黑色，结合较少的区域为浅灰色、灰电镜下为致密的黑色，结合较少的区域为浅灰色、灰黑色，没有结合的区域为电子透明；因此通过染色提黑色，没有结合的区域为电子透明；因此通过染色提高样品的电子反差，增加图像的清晰度。高样品的电子反差，增加图像的清晰度。电子染色剂w醋酸双氧铀醋酸双氧铀：提高核酸，蛋白质，组织纤维的反：提高核酸，蛋白质，组织纤维的反差，对膜结构染色效果不理想。配制差，对膜结构染色效果不理想。配制13的的5070乙醇溶液或水饱和溶液。乙醇溶液或水饱和溶液。缺点：对光不稳定，具有放射性和化学毒性缺点：对光不稳定，具有放射性和化学毒性w铅盐染色剂：铅盐染色剂：密度大，对各种细胞结构有亲和作密度大，对各种细胞结构有亲和作用，提高细胞膜系统及脂类物质的反差。在高用，提高细胞膜系统及脂类物质的反差。在高PH（1112）条件适用。条件适用。缺点：毒性较大，易与空气中的缺点：毒性较大，易与空气中的CO2结合在样品上结合在样品上产生沉淀产生沉淀染色方法w单单染色：醋酸铀单染样品染色：醋酸铀单染样品w双染色：醋酸铀双染色：醋酸铀柠檬酸铅柠檬酸铅w块染色块染色：双固定后，脱水前用含醋酸铀：双固定后，脱水前用含醋酸铀5070乙醇溶液染色乙醇溶液染色2030分钟分钟冷冻超薄切片技术w冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切片和电镜超薄切片的基础上发展的技术。片和电镜超薄切片的基础上发展的技术。w冷冻超薄切片技术不需常规超薄切片的冷冻超薄切片技术不需常规超薄切片的固定、脱水、渗透、包埋等程序。固定、脱水、渗透、包埋等程序。分类（一）（一）w样品样品不经任何处理不经任何处理直接进行冷冻固定直接进行冷冻固定，再进行冷冻切片再进行冷冻切片。适用橡胶，朔料等弹性材料及高分子材适用橡胶，朔料等弹性材料及高分子材料。以及生物材料中进行放射自显影和料。以及生物材料中进行放射自显影和X X射线微区分析的新鲜样品，利于保存射线微区分析的新鲜样品，利于保存材料中可溶性物质及生物大分子的活性材料中可溶性物质及生物大分子的活性和天然和天然分布。分布。（二）（二）w用醛固定和冷冻保护剂处理，再进行冷用醛固定和冷冻保护剂处理，再进行冷冻固定和超薄切片。冻固定和超薄切片。适合进行形态学、细胞化学、免疫化学适合进行形态学、细胞化学、免疫化学研究研究冷冻超薄切片的程序冷冻超薄切片的程序1.1.醛固定醛固定 2.2.冷冻保护处理冷冻保护处理 3.3.快速冷冻固定快速冷冻固定 4.4.冷冻差别切片冷冻差别切片 醛固定w戊二戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛等用醛，多聚甲醛，丙烯醛等用0.1M0.1M的二甲砷酸钠配成的二甲砷酸钠配成2.52.5的溶液，的溶液，对样品固定对样品固定15156060分钟。分钟。冷冻保护处理冷冻保护处理w其其作用是提高细胞内溶液的浓度。降作用是提高细胞内溶液的浓度。降低冷冻点，缩小冷冻点与再晶点的温低冷冻点，缩小冷冻点与再晶点的温差，避免冰晶的形成，保护样品的超差，避免冰晶的形成，保护样品的超微结构。微结构。w常用的冷冻保护剂：常用的冷冻保护剂：1.2030甘油溶液，甘油溶液，2.0.62.3M蔗糖溶液蔗糖溶液3.20的二甲基亚碸，的二甲基亚碸，4.5的聚乙稀醇。的聚乙稀醇。冷冻固定原理（94）w富含水分的新鲜生物材料，在降温冷冻过程中，常规富含水分的新鲜生物材料，在降温冷冻过程中，常规发生如图发生如图A A，B B，C C的变化。结果在细胞内外产生大量的变化。结果在细胞内外产生大量大小不一的冰晶，导致超微结构的改变，这就是常见大小不一的冰晶，导致超微结构的改变，这就是常见的冰晶损伤。的冰晶损伤。w冰晶的形成是由于生物体大都含有丰富的水分冰晶的形成是由于生物体大都含有丰富的水分(约占约占其重量的其重量的7070一一9090)，在冷冻过程中，水分子结合生，在冷冻过程中，水分子结合生成一定大小的晶核，晶核逐渐长大形成冰晶。成一定大小的晶核，晶核逐渐长大形成冰晶。w冷冻固定的冷冻固定的目的是使样品在冷冻处理过程中迅速冻结、目的是使样品在冷冻处理过程中迅速冻结、硬化，保持样品原有超微结构和化学成分，改善某些硬化，保持样品原有超微结构和化学成分，改善某些物理特性，利于断裂、蚀刻、切片、干燥等进一步的物理特性，利于断裂、蚀刻、切片、干燥等进一步的处理处理。细胞冷冻过程中产生的冰晶损伤细胞冷冻过程中产生的冰晶损伤冷冻速度的影响冷冻速度的影响w样品以慢速度冷冻时，细胞外部的水分首先形样品以慢速度冷冻时，细胞外部的水分首先形成冰晶，导致细胞脱水收缩，随着温度降低，成冰晶，导致细胞脱水收缩，随着温度降低，细胞内的水分也形成冰晶，影响细胞器的分布细胞内的水分也形成冰晶，影响细胞器的分布并造成超微结构的破坏。冷冻速度不同，形成并造成超微结构的破坏。冷冻速度不同，形成的冰晶大小也不同。从观察角度讲，考虑到电的冰晶大小也不同。从观察角度讲，考虑到电镜的分辨率高，应尽量防止产生大于镜的分辨率高，应尽量防止产生大于100A100A的冰的冰晶，从细胞结构角度看，冰晶颗粒只要小于晶，从细胞结构角度看，冰晶颗粒只要小于20nm20nm就不会对细胞造成严重影响。就不会对细胞造成严重影响。300秒秒500秒秒800秒秒0.1um0.05um0.03um冷冻温度的影响冷冻温度的影响w水分结冰时，温度与形成的冰形的关系。水分结冰时，温度与形成的冰形的关系。样品在进行冷冻处理过程中，若使样品迅样品在进行冷冻处理过程中，若使样品迅速降低到速降低到-160-160以下，细胞内的水分来不以下，细胞内的水分来不及逸出，而细胞外的水分几乎在同时冻结及逸出，而细胞外的水分几乎在同时冻结成成玻璃态的冰玻璃态的冰，较好地保存了细胞生活时，较好地保存了细胞生活时的状态和超微结构，这就是理想的冷冻固的状态和超微结构，这就是理想的冷冻固定过程。定过程。-70-70-70-70-130-130-130-130-120-120-120-120-140-140-140-140 -160-160-160-160六角形六角形立方形立方形立方形立方形玻璃态玻璃态六角形六角形立方形立方形无定形无定形有序有序有序有序无序无序冷冻点与再结晶点的温差的关系冷冻点与再结晶点的温差的关系w在冷冻情况下，当细胞内液开始凝固时的温度称为冷冻在冷冻情况下，当细胞内液开始凝固时的温度称为冷冻点，此时冰晶开始形成，但极微小而且固、液共存，对点，此时冰晶开始形成，但极微小而且固、液共存，对细胞结构不会造成损。进一步冷冻即发展到再结晶点，细胞结构不会造成损。进一步冷冻即发展到再结晶点，此时细胞全部冻结为固态。此时细胞全部冻结为固态。w纯水的冷冻点为纯水的冷冻点为 00，再结晶点为，再结晶点为 -130-130。在冷冻点。在冷冻点与再结晶点之间的过程，就是冰晶形成和长大时期，并与再结晶点之间的过程，就是冰晶形成和长大时期，并对细胞结构造成损伤的过程。对细胞结构造成损伤的过程。w在含液泡较多的植物细胞内，液泡中水分的冷冻点为在含液泡较多的植物细胞内，液泡中水分的冷冻点为 -2-2 -5-5，再结晶点为，再结晶点为-55-55，二者相差较大，冷冻过，二者相差较大，冷冻过程形成冰晶的机会增多。程形成冰晶的机会增多。w含糖原较多的细胞，二者相差较小，冷冻点含糖原较多的细胞，二者相差较小，冷冻点-15，再结晶点，再结晶点-25，冷冻过程中容易在极短时间内，冷冻过程中容易在极短时间内由冷冻点超越再结晶点而冻结固化，避免冰晶形由冷冻点超越再结晶点而冻结固化，避免冰晶形成。成。w降低细胞的含水量或提高细胞内液的浓度，都可降低细胞的含水量或提高细胞内液的浓度，都可以缩小冷冻与点再结晶点的温度差。以缩小冷冻与点再结晶点的温度差。w因此，样品在冷冻固定前，常需进行防冻处理。因此，样品在冷冻固定前，常需进行防冻处理。常用的防冻剂有甘油、葡萄糖、蔗糖、乙二醇、常用的防冻剂有甘油、葡萄糖、蔗糖、乙二醇、二甲基亚矾等。二甲基亚矾等。w例例;用用20甘油浸泡样品，可以使冷冻点降低甘油浸泡样品，可以使冷冻点降低4.8，样品二点差越大，所用防冻剂浓度也应加，样品二点差越大，所用防冻剂浓度也应加大，但因很多种生物膜不能耐受甘油浸泡或浸泡大，但因很多种生物膜不能耐受甘油浸泡或浸泡后产生假象，所以处理前应用戊二醛进行预固定后产生假象，所以处理前应用戊二醛进行预固定处理。处理。冷冻固定方法及仪器冷冻固定方法及仪器w液氮直接冷冻法液氮直接冷冻法，将小块样品用一小滴冷冻保护剂粘，将小块样品用一小滴冷冻保护剂粘在金属样品头上，迅速投入液氮中，样品即冷冻固定。在金属样品头上，迅速投入液氮中，样品即冷冻固定。w中间冷媒法中间冷媒法：为提高样品冷冻速率，选用丙烷、氟利昂，：为提高样品冷冻速率，选用丙烷、氟利昂，异戊烷等低熔点、高沸点的物质作为冷冻剂。将一金属异戊烷等低熔点、高沸点的物质作为冷冻剂。将一金属杯置于液氮中预冷到杯置于液氮中预冷到-190-190，再通入乙烷、丙烷等冷冻，再通入乙烷、丙烷等冷冻剂，丙烷立即冷凝成液体流入杯中，在保持低温的情况剂，丙烷立即冷凝成液体流入杯中，在保持低温的情况下，迅速将样品投入冷冻剂中，完成冷冻固定。下，迅速将样品投入冷冻剂中，完成冷冻固定。金属镜金属镜冷冻固定法冷冻固定法：将一端面光洁如镜的金属柱：将一端面光洁如镜的金属柱(银或铜银或铜)置液置液氮中冷冻，待温度平衡后，将修整好的样品迅速与金属氮中冷冻，待温度平衡后，将修整好的样品迅速与金属镜面接触冷冻镜面接触冷冻0.50.5秒左右，然后投入液氮中。适合于未秒左右，然后投入液氮中。适合于未经醛处理的新鲜生物样品。经醛处理的新鲜生物样品。冷冻固定装置冷冻固定装置金属镜冷冻固定装置金属镜冷冻固定装置金属镜冷冻固定装置金属镜冷冻固定装置FC4冷冻超薄切片机的基本结构冷冻超薄切片机的基本结构w冷冻超薄切片系冷冻超薄切片系统由安装在超薄切片统由安装在超薄切片机刀台上的冷冻室、机刀台上的冷冻室、带热交换器的冷冻样带热交换器的冷冻样品桥、液氮罐和自动品桥、液氮罐和自动加液氮泵，以及调节加液氮泵，以及调节控制箱五部分组成。控制箱五部分组成。冷冻室是一个三室铝冷冻室是一个三室铝箱，左右两侧是容积箱，左右两侧是容积为为0.5升的液氮室，升的液氮室，中央为冷冻刀中央为冷冻刀.1.外壳外壳2.蒸发的气氮蒸发的气氮3.内壁内壁4.导流板导流板5.样样品品6.样品桥样品桥7.冷刀冷刀8.刀架刀架9.液氮液氮bld5液液位器位器3 32 21 187879 9FC4冷冻超薄切片机工作原理工作时，左右双箱室充入液氮。（沸点工作时，左右双箱室充入液氮。（沸点-210)-210)对冷冻室的铝壁和底板直接冷冻，蒸发出的气对冷冻室的铝壁和底板直接冷冻，蒸发出的气态氮折流到中间工作室的底层，温度约态氮折流到中间工作室的底层，温度约-190-190左右。在此，低温液氮对刀座、刀，并通过样左右。在此，低温液氮对刀座、刀，并通过样品桥的热交换器对样品进行冷冻，温度逐步上品桥的热交换器对样品进行冷冻，温度逐步上升而逸出。为了调节控制冷冻室、样品和刀的升而逸出。为了调节控制冷冻室、样品和刀的温度，在刀架、底板和样品桥上各装有加热元温度，在刀架、底板和样品桥上各装有加热元件和测温传感器，在控制箱上显示温度并可以件和测温传感器，在控制箱上显示温度并可以调节工作温度在调节工作温度在-80-80-170-170之间。之间。切片温度的选择和控制w1.生物样品通常在生物样品通常在-35左右就完全冰冻左右就完全冰冻(即共晶的即共晶的冰点冰点)。低于。低于-35温度时，冰晶体的形成速度很慢，温度时，冰晶体的形成速度很慢，可以忽略。可以忽略。w2如果要求细胞内的小分子物质和元素都固定下来如果要求细胞内的小分子物质和元素都固定下来而不发生重新分布，冷冻样品必须保持在而不发生重新分布，冷冻样品必须保持在-80。w3.要保持用快速低温固定后得到的玻璃化无定形水要保持用快速低温固定后得到的玻璃化无定形水溶液混合相，则要求样品始终低于溶液混合相，则要求样品始终低于-140，如果温，如果温度高于度高于-140，样品中的无定形固体化水分就会发，样品中的无定形固体化水分就会发生变形，而且是不可逆的。生变形，而且是不可逆的。染色w冷冻超薄切片可采用正染色或负染色法冷冻超薄切片可采用正染色或负染色法染色。所用染料及染色方法都与常规超染色。所用染料及染色方法都与常规超薄切片相似。一般的形态学观察和超微薄切片相似。一般的形态学观察和超微结构研究，用负染色法为好。负染法简结构研究，用负染色法为好。负染法简单快速，有利于保存结构和分辨率高等单快速，有利于保存结构和分辨率高等优点。优点。