环境微生物学教学课件-环境微生物实验

实验一实验一 显微镜使用及微生物观察显微镜使用及微生物观察一、实验目的1.掌握显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作和保养方法2.观察细菌的形态并绘图3.培养通过实验发现问题、分析问题、解决问题的能力二、仪器和材料光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯、细菌标本三、实验步骤1.显微镜的取送：右手握镜臂；左手托镜座；置于胸前。2.显微镜的旋转：镜筒朝前，镜臂朝后；置于观察者座位前的桌子上，偏向身体左侧，便于左眼向目镜内观察；置于桌子内侧，距桌沿5cm左右。3.对光：转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，然后转动转换器，使低倍物镜对准通光孔；用手指转动遮光器（或片状光圈），使最大光圈对准通光孔，左眼向目镜内注视，同时转动反光镜，使其朝向光源，使视野内亮度均匀合适。4.低倍物镜的使用：用手转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐下降，同时两眼从侧面注视物镜镜头，当物镜镜头与载物台的玻片相距23mm时停止。用左眼向目镜内注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止。如果不清楚，可调节细准焦螺旋，至清楚为止。5.高低倍物镜的使用6.油镜的使用：A、将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至接物镜下。先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴香柏油一滴，再换油镜观察。B、转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。C、然后双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。D、观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落。7.镜头的擦拭：用专门的擦镜纸；擦镜头时，先将擦镜纸折叠几次，然后朝一个方向擦，不可来回擦或转动擦；如果镜头被油污污染，则可在擦镜纸上滴几滴二甲苯，然后按上述方法擦拭。8.显微镜的放大对象：是物体的长和宽，不是面积，更不是体积。9.显微镜的焦距问题：物镜离装片的远近，准焦螺旋的使用。10.显微镜使用时物象移动方向：相反，即物象在视野何方，则装片即向该方向移动。11.显微镜使用时异物的判断：目镜、物镜或装片上，通常通过移动玻片（是否在玻片上），转动转换器（是否在物镜上）来判断，剩下在目镜上。12.实验后显微镜的安置：显微镜使用完毕后，应将玻片取下，将其机械部分用白纱布擦拭干净；转动转换器，让两个物镜偏于两旁；转动粗准焦螺旋，使镜筒下降至最低点，将反光镜竖起，蒙上红绸布，然后将显微镜锁入箱内 13.显微镜的保养避免直接在阳光下曝晒避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放透镜要用擦镜纸擦拭或醮二甲苯擦拭不能随意拆卸显微镜，尤其是物镜、目镜、镜筒不能随意拆卸避免用手指沾抺镜面显微镜放在干燥处四、实验结果名称 形态 大小大肠杆菌 杆状 （0.51.0）m（15）m五、注意事项1.用显微镜观察微生物不清楚时，可对光圈（强大、弱小）、滤光片、聚光器进行调节。2.细调时可先微微向一个方向调节，如果物像越变越清晰则继续朝原方向调节，反之逆向调节六、思考题使用油镜时，为什么先要用低倍镜观察？实验二实验二 培养基的制备培养基的制备 培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度pH值、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。二、实验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10NaOH溶液、l0盐酸溶液、琼脂。(2)器材：小烧杯、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、pH试纸、试管、棉花、三角烧瓶。一、实验目的一、实验目的学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤 三、方法与步骤1、乳糖蛋白胨培养基的配制(1)培养基配方：牛肉膏3.0g 蛋白胨10.0g、乳糖5g,NaCl5.0g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、自来水1000mL、pH7.27.4。(2)操作步骤：1）称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2）加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3）调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴10NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用10 HCl进行调节。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4）过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。5）分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染(见图41)。6）加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法如图43。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约35塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。7）包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37温室培养24h，无菌生长者方可使用。图 例 图41培养基分装 图42斜面制作图43棉塞制作方法四、注意事项称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调，不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。五、问题和思考1培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？2.已灭菌的培养基如何进行无菌检查？3牛肉膏蛋白胨培养基属何种培养基？采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。实验三实验三 消毒和灭菌消毒和灭菌 一、实验目的和内容目的：了解消毒和灭菌的原理并掌握各种灭 菌方法的操作步骤。内容：1高压蒸汽灭菌法。2干热灭菌法。二、实验材料和用具待灭菌的培养基、移液管、蒸馏水、培养皿、试管、高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱三、操作步骤()高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。1加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。2装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3加盖将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；4排气加热待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。5升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。6保保压压 当当压压力力表表指指针针达达到到所所需需压压力力刻刻度度时时，控控制制热热源源。开开始始计计时时并并维维持持压压力力至至所所需需时时间。本实验用间。本实验用121，20min灭菌。灭菌。7降降压压 达达到到所所需需灭灭菌菌时时间间后后，关关闭闭热热源源，让让压压力力自自然然下下降降到到零零后后，打打开开排排气气阀阀。放放净净余余下下的的蒸蒸汽汽后后，再再打打开开锅锅盖盖，取取出出灭灭菌菌物品，倒掉锅内剩水。物品，倒掉锅内剩水。8无无菌菌检检查查 将将已已灭灭菌菌培培养养基基于于37培培养养24h，无杂菌生长，即可待用。，无杂菌生长，即可待用。(二)干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；1装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。2升温关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度(实验所需为160170)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。3恒恒温温 当当温温度度升升到到所所需需温温度度后后，维维持持此此温温度度2h。4降温降温 切断电源，自然降温。切断电源，自然降温。5.取取出出灭灭菌菌物物品品 待待电电烘烘箱箱内内温温度度降降到到70以以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。四、注意事项1使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。2干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触以免包装纸烤焦起火。五、问题和思考1比较各种灭菌方法的原理及适用范围。2高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。平板浇注、平板划线、斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如平板划线和固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。实验四实验四 微生物的接种技术微生物的接种技术 一、实验目的：了解各种微生物接种方法。掌握无菌操作和平板分离划线法接种技术二、实验材料和用具：酒精灯、标签、无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养基、灭菌培养皿、灭菌试管三、方法和步骤（一)品红亚硫酸钠培养基1.成分蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂20-30g、蒸馏水1000mL、无水亚硫酸钠5g左右、5%碱性品红乙醇溶液20mL.2.储备培养基的制备1）先将琼脂加至900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使溶解，再以蒸馏水补足至1000mL,调整PH为7.2-7.4.2）趁热再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形内，置高压蒸汽灭菌器中以121灭菌20min,贮存于冷暗处备用。3.3.平板的制平板的制备1）将上法制备的储备培养基加热融化。2）根据锥形瓶内培养基的量，用无菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液置于无菌空试管中。3）根据锥形瓶内培养基的量，按比例称取所所需的无水亚硫酸钠置于无菌空试管内，加无菌水少许使其溶解，再置于沸水中煮沸10min以灭菌。4）用无菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液中至深红色褪色成淡红色为止。5）将此亚硫酸钠与碱性品红混合液全部加于已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。6）立即将此种培养基适量倾入已灭菌的培养皿内（90mm直径的培养皿约需培养基10-15mL),待其冷却凝固后置冰箱内备用，此种已制成的培养基于冰箱内保存亦不宜超过二周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。四.接种初发酵水样的培养皿，倒置于37培养24h，培养到长出明显菌落。五、结果与分析画图分析菌落形态。六、问题和讨论培养时，为什么要把已接种的培养基倒置保温培养？菌落厚，有金黄色光泽呈圆形状，可断定为金黄色葡萄球菌菌落边缘光滑，有点湿润、粘稠的圆形可断定为大肠杆菌菌落边缘褶皱不规则、淡黄色可断定为枯草芽孢杆菌菌落与菌苔菌落菌落菌苔菌苔 实验五实验五 细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于对细菌细胞进行分类。革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层脱水而孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。内容：学习革兰氏染色技术。二、实验材料和用具（1）大肠杆菌（E.coli）菌液（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、沙黄（番红）染色液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。三、操作步骤1、制片（1）涂菌滴一滴无菌水在载玻片中央，用接种环以无菌操作方法从培养基上挑取少许菌种与玻片上水滴混匀后，在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（2）干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。（3）固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。2、染色（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脱色，摇动玻片几下即倾去乙醇，重复23次至紫色不再后即水洗(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染滴加沙黄（番红）染色液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。3、结果革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。四、注意事项1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2在染色过程中，不可使染液干涸。3在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。五、结果报告绘图 大肠杆菌革兰氏染色视野图。并进行结果分析。六、问题和思考1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。实验六实验六 水中大肠杆菌群的测定水中大肠杆菌群的测定一、实验目的了解水中大肠杆菌群的检测方法。了解大肠杆菌群的形态数量及指标在水环境领域的重要性二、材料与器皿()培养基1、普通乳糖蛋白胨培养液蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL蒸馏水1000mLpH7.27.4 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.27.4，再加入1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每小试管10mL，121灭菌20min。2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每中试管15mL每小试管10mL。(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、锥形瓶、烧杯、棉塞三、方法与步骤(一)水样的采集供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4小时，在04下保存不应超过24小时，如不能在4小时内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。（1）自来水取样：应在水龙头打开放水5分钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。（2）接种和培养：以无菌操作分别吸取1mL水样于3支装有10mL的普通浓度乳糖蛋白胨培养液（接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡）小试管中，取1mL原水样于3支装有10mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液小试管中，另取2mL原水样于3支装有15mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液中试管中，小心混匀放入37培养箱中培养24小时后观察。（3）结果观察：37中培养24h后取出观察，观察有无气体（杜汉氏小管内有无气体）和酸产生（培养基有无变色）。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。四.结果纪录 五、实验报告五、实验报告 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的大肠杆菌的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。菌 名_ 放大倍数_总放大率_ 特殊结构_六、问题与思考1.测定水中大肠杆菌群有什么实际意义？2.实验过程中有什么问题，你认为原因何在，如何克服？实验安排第十二周周五开始，加上周六周日、连续做3天，每天4节课做实验，另每一次实验菌种培养二十四小时。实验顺序为：周五 实验二、实验三、四、六部分 周六 实验二、三、四、六部分 周日 实验五、实验一，实验六部分观看实验结果，打扫实验室卫生实验安排两个班分批做实验：1班上午，2班下午上午要求8点正到实验室，下午2:30到实验室地点：主教西裙楼2楼每班分10小组，实验前学习委员将分组名单交给老师记得带上10张报纸实验报告全部手写（写明班级、姓名、学号）总共6个实验，报告内容包括实验目的实验仪器和器材实验步骤注意事项实验结果思考题