蛋白质免疫印迹技术及常见问题课件

蛋白质免疫印迹技术及常见问题课件免疫印迹技术的基础免疫印迹技术的基础-免疫反应免疫反应 免疫测定(immunoassay)利用抗原抗体 反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性免疫印迹技术的基础-免疫反应 免疫测定(immunoassa+Western Blot原理简介+Western Blot一般流程+Western Blot常见问题分析内容概要内容概要 Western Blot原理简介内容概要 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot 原理原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析Western Blot 的应用的应用 目的蛋白的表达特性分析Western Blot 的应用+Western Blot原理简介+Western Blot一般流程+Western Blot常见问题分析内容概要内容概要 Western Blot原理简介内容概要Western Blot 流程流程蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜转膜封闭封闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色Western Blot 流程蛋白样品的制备转膜?通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂剂 。有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。乙醇、丙酮和丁醇等。?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 蛋白样品的制备蛋白样品的制备通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白蛋白样品的制备蛋白样品的定量蛋白样品的定量 BradfordBradford法法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm595nm处有最大吸收值，处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。TIANGENTIANGEN产品产品 BradfordBradford蛋白质定量试剂盒蛋白质定量试剂盒蛋白样品的定量Bradford法不连续的电泳缓冲体系。SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续的电泳缓冲体系。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶成分凝胶成分N,N-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成分N,N-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)15转膜转膜膜的选择膜的选择膜的选择膜的选择尼龙膜尼龙膜尼龙膜尼龙膜硝酸纤硝酸纤硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜维素膜维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格便宜价格便宜价格便宜价格便宜特殊要求下的选择特殊要求下的选择特殊要求下的选择特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：（尼龙膜：（尼龙膜：（尼龙膜：480g/cm480g/cm2 2 ；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80g/cm80g/cm2 2 ）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度需要更大的机械强度需要更大的机械强度需要更大的机械强度转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。转膜方法转膜方法湿法转膜方法丽春红丽春红S S染色染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。转膜后检测转膜后检测丽春红S染色转膜后检测转膜后的封闭转膜后的封闭 脱脂奶粉脱脂奶粉 BSABSA Western Blot Western Blot 膜封闭液膜封闭液 （生物试剂公司提供）（生物试剂公司提供）把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。转膜后的封闭脱脂奶粉 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或 一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育 一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法碱性磷酸酶法化学发光显色法AntiHis 二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法AntiHis 应用举例：用应用举例：用Western blot检测患者检测患者血清中的血清中的HIV病毒抗体病毒抗体Step1Step1Step1Step1：经电泳将：经电泳将：经电泳将：经电泳将HIVHIVHIVHIV混合抗原按分子量大小分离混合抗原按分子量大小分离混合抗原按分子量大小分离混合抗原按分子量大小分离Step2Step2Step2Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭Step3Step3Step3Step3：加入待检病人血清，漂洗：加入待检病人血清，漂洗：加入待检病人血清，漂洗：加入待检病人血清，漂洗Step4Step4Step4Step4：加入合适的、标记的二抗（：加入合适的、标记的二抗（：加入合适的、标记的二抗（：加入合适的、标记的二抗（HRPHRPHRPHRP或或或或APAPAPAP），漂洗），漂洗），漂洗），漂洗Step5Step5Step5Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测：加入显色底物（或放射自显影），显色检测：加入显色底物（或放射自显影），显色检测：加入显色底物（或放射自显影），显色检测应用举例：用Western blot检测患者Step1：经电+Western Blot原理简介+Western Blot一般流程+Western Blot常见问题分析内容概要内容概要 Western Blot原理简介内容概要Western blot常见问题常见问题SDS-PAGE电泳电泳1.胶不平？2.凝胶漏液？1.胶板洗刷干净2.加入AP和TEMED的量要合适3.加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀4.温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀5.两块玻璃板底部要对齐Western blot常见问题SDS-PAGE电泳胶不平1.条带比正常的窄？2.“微笑”或“倒微笑”条带？1.凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓2.拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲3.样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度4.胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适Western blot常见问题常见问题SDS-PAGE电泳电泳条带比正常的窄？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻1.1.凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？2.2.条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？3.3.单个或多个白点？单个或多个白点？4.4.转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？1.可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min2.电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的纸片3.确保膜和胶块之间没有气泡4.缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温Western blot常见问题常见问题转膜及抗体检测转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-11.蛋白分子量 10KD2.蛋白的等电点=83.SDS浓度不合适4.凝胶太厚1.蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜2.更换高pH值Buffer3.在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS 可提高转膜效率4.延长转膜时间Western blot常见问题常见问题蛋白转膜效率低蛋白转膜效率低蛋白分子量 10KD蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度Western blot常见问题常见问题显色背景高显色背景高膜没有均匀浸湿转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿ARWeste1.抗体保存不当2.抗原不充足3.膜的漂洗过度1.抗体长期保存应在70，使用前做效价检测2.增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照3.减少漂洗的时间和次数Western blot常见问题常见问题杂交信号弱杂交信号弱抗体保存不当抗体长期保存应在70，使用前做效价检测Wes1.一抗不是唯一特异的2.二抗出现非特异结合1.制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点2.设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合Western blot常见问题常见问题显现非特异性条带显现非特异性条带一抗不是唯一特异的制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位分子量Marker：确定蛋白条带的分子量已知量标准产物的正对照空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的内参：看家基因编码表达的蛋白 参照体系参照体系分子量Marker：确定蛋白条带的分子量参照体系TIANGEN产品结构产品结构底物显色液底物显色液HRP底物显色液底物显色液HRP-DAB底物显色试剂盒底物显色试剂盒增强型增强型HRP-DAB底物显色试剂盒底物显色试剂盒沉淀型单组分沉淀型单组分TMB底物溶液底物溶液可溶型单组分可溶型单组分TMB底物溶液底物溶液Pro-light HRP 化学发光检测试剂化学发光检测试剂 AP底物显色试剂底物显色试剂BCIP/NBT底物显色试剂盒底物显色试剂盒TIANGEN产品结构底物显色液HRP底物显色液HRP-DHRP-DAB底物显色试剂底物显色试剂盒盒Western blot中的应用中的应用HRP-DAB底物显色试剂底物显色试剂盒免疫组化中的应用盒免疫组化中的应用HRP-DABHRP-DAB底物显色试剂盒应用底物显色试剂盒应用HRP-DAB底物显色试剂盒Western blot中的应用Pro-light HRP 灵敏度检测试验灵敏度检测试验ProLight HRP 化学发光化学发光试剂盒检测结果试剂盒检测结果Pro-light HRP 灵敏度检测试验ProLightToll-free:800-810-2177 TIANGEN BIOTECHTIANGEN BIOTECH（BEIJINGBEIJING）CO.,LTD.CO.,LTD.Toll-free:800-810-2177 TIANG