高通量组学技术简介课件

高通量高通量组学技学技术简介介编辑ppt1高通量组学技术简介编辑ppt1目目录l代代谢组学及其相关技学及其相关技术l蛋白蛋白质组学及其相关技学及其相关技术l糖糖组学及其相关技学及其相关技术l脂脂质组学及其相关技学及其相关技术编辑ppt2目录代谢组学及其相关技术编辑ppt2代代谢组学学l代代谢物物组学学（metabolomics）是是在在后后基基因因组学学时代代兴起起的的一一门跨跨领域域学学科科，其其主主要要目目标是是定定量量的的研研究究生生命命体体对外外界界刺刺激激、病病理理生生理理变化化、以以及及本本身身基基因因突突变而而产生生的的其其体体内内代代谢物物水水平平的的多多元元动态反反应。l代代谢物物组学学诞生生于于上上个个世世纪末末，由由英英国国伦敦敦帝帝国国大大学学Jeremy Nicholson教教授授创立立，之之后后得得到到迅迅速速发展展并并渗渗透透到到多多项领域域，比比如如疾疾病病诊断断、医医药研研制制开开发、营养养食食品品科科学学、毒毒理理学学、环境境学学，植植物物学学等与等与人人类健康健康护理理密切相关的密切相关的领域。域。编辑ppt3代谢组学代谢物组学（metabolomics）是在后基因组学常用技常用技术手段手段l色色谱-质谱联用技用技术 l色色谱是是分分离离混混合合物物的的有有效效方方法法,但但难以以得得到到结构构信信息息,主主要要靠靠与与标样对比比来来达达到到未未知知物物结构构的的推推定定;质谱法法提提供供了了丰丰富富的的结构构信信息息,用用样又又是是几几种种谱学学方方法法中中用用量量最最少少的的。因因此此色色谱与与质谱的的结合合,成成为分分离离和和鉴定定复复杂样品品的的理理想想手手段段,这是是单独独采采用用色色谱、质谱所所不不及及的的,同同时也也不不存存在在类似似于于NMRNMR技技术灵灵敏敏度度低低、检测动态范范围窄窄弱弱点点,有有较高高的的灵灵敏敏度度和和专属性属性。编辑ppt4常用技术手段色谱-质谱联用技术 编辑ppt4l色色质质联联用用技技术术已已在在代代谢谢组组学学领领域域得得到到广广泛泛应应用用,特特别是是液液质质联联用用(LC-MS)(LC-MS)、气气质质联联用用(GC-MS)(GC-MS)以以及及毛毛细细管管电电泳泳-质谱联联用用技技术术(CE-MS)(CE-MS)。LC-MSLC-MS的的应用用涉涉及及毒毒理理、植植物物代代谢、遗传学学、真真菌菌的的代代谢等等诸多多领领域域的的不不同同类类小小分分子子物物质质的的定定性性与与定定量量。GC-MSGC-MS要要求求足足够的的蒸蒸气气压和和被被分分析析物物的的热稳定定性性好好,特特别对极极性性物物质质的的分分析析前前要要进进行行样样品品的的衍衍生生化化处处理理。但但其其高高效效、高高选选择择性性、高高灵灵敏敏度度、用用量量少少和和分分析析速速度快度快的的优优点是其得到广泛点是其得到广泛应应用的主要原因。用的主要原因。编辑ppt5色质联用技术已在代谢组学领域得到广泛应用,特别是液质联用(LlGCGC与与TOFTOF/MS/MS以以及及四四极极杆杆质谱的的联用用在在代代谢组学学的的研研究究中中发挥了了自自身身的的优越越性性。CE-MSCE-MS也也是是代代谢组学学中中强大大的的分分析析工工具具。SogaSoga等等分分析析了了细菌菌代代谢物物经三三重重CECE分分离离后后的的近近千千种种小小分分子子物物质,有有利利于于代代谢物物的的系系统性性分分析析。此此外外,毛毛细管管电色色谱(capillary(capillary electrochromatography,electrochromatography,CEC),CEC),与与质谱的的联用用在在蛋白、多蛋白、多肽、氨基酸和糖、氨基酸和糖类的分析中得到的分析中得到应用。用。编辑ppt6GC与TOF/MS以及四极杆质谱的联用在代谢组学的研究中发挥l核磁共振技核磁共振技术术 l核核磁磁共共振振(nuclearmagneticresonance,(nuclearmagneticresonance,NMRNMR)是是一一种种基基于于具具有有自自旋旋性性质的的原原子子核核在在核核外外磁磁场作作用用下下,吸吸收收射射频辐射射而而产生生能能级跃迁迁的的谱学学技技术。其其特特点点为为:不不破破坏坏样样品品的的结结构构和和性性质质,无无辐射射损伤;可可在在一一定定的的温温度度和和缓冲冲液液范范围内内选择实验条条件件,能能够在在接接近近生生理理条条件件下下进行行实验;可可设计多多种种编辑手手段段,实验方方法法灵灵活活多多样。基基于于这种种特特点点,核核磁磁共共振振技技术对完完整整器器官官或或组织细胞胞内内许多多微微量量代代谢组分分进行行检测,得到相得到相应的生物体代的生物体代谢物信息。物信息。编辑ppt7核磁共振技术 编辑ppt7l综综合合分分析析这这些些信信息息所所反反映映的的生生物物学学意意义义,可可了了解解生生物物体体代代谢的的规律律。二二维维和和多多维维的的核核磁磁共共振振技技术术也也成成为为了了代代谢谢组组学学研研究究领领域域的的重重要要技技术术。另另外外,NMR,NMR技技术还可可以以和和色色谱技技术联用用,充充分分发挥各各自自优势,达达到到更更为理理想想的的分分析析效效果果。相相关关的的高高性性能能联联用用技技术术将会用于小分子代将会用于小分子代谢谢物的定性与定量。物的定性与定量。编辑ppt8综合分析这些信息所反映的生物学意义,可了解生物体代谢的规律。代代谢组学的学的优势与劣与劣势编辑ppt9代谢组学的优势与劣势编辑ppt9蛋白蛋白质组学学l蛋蛋白白质组定定义为一一种种基基因因组所所表表达达的的全全部部蛋蛋白白质。因因蛋蛋白白质组具具有有时空空性性和和可可调节性性,蛋蛋白白质组的的概概念念实际指指在在特特定定时刻刻、特特定定环境境和和实验条条件件下下基基因因组所表达的所表达的全部全部蛋白蛋白质。编辑ppt10蛋白质组学蛋白质组定义为一种基因组所表达的全部蛋白质。因蛋白l蛋蛋白白质组学学的的核核心心在在于于大大规模模地地对蛋蛋白白质进行行综合合分分析析,通通过对某某种种物物种种、个个体体、器器官官、组织或或细胞胞的的全全部部蛋蛋白白质性性质(包包括括表表达达水水平平、结构构、分分布布、功功能能、丰丰度度变化化、翻翻译后后修修饰、细胞胞内内定定位位、蛋蛋白白质与与蛋蛋白白质的的相相互互作作用用、蛋蛋白白质与与疾疾病病的的关关联性性)的的研研究究,对蛋蛋白白功功能能做做出出精精细和和准准确确的的阐述述。蛋蛋白白质组学学最最有有价价值的的优势是是它它可可以以观察察在在特特定定的的时间下下一一个个完完整整的的蛋蛋白白质组或或蛋蛋白白亚型型在在某某种种生理或病理状生理或病理状态中中,发生的相生的相应的的变化。化。编辑ppt11蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析,通过对某种l蛋白蛋白质组质组学的研究内容主要有两方面学的研究内容主要有两方面:l结结构构蛋蛋白白质质组组学学和和功功能能蛋蛋白白质质组组学学。结结构构蛋蛋白白质质组组学学主主要要是是蛋蛋白白质质表表达达模模式式的的研研究究,包包括括蛋蛋白白质氨氨基酸序列分析及空基酸序列分析及空间结构的解析。构的解析。l蛋蛋白白质质表表达达模模式式的的研研究究是是蛋蛋白白质质组组学学研研究究的的基基础础内内容容,主主要要研研究究特特定定条条件件下下某某一一细胞胞或或组织的的所所有有蛋白蛋白质质的表征的表征问题问题。编辑ppt12蛋白质组学的研究内容主要有两方面:编辑ppt12l常常规规的的方方法法是是提提取取蛋蛋白白质质,经分分离离形形成成一一个个蛋蛋白白质质组组的的二二维维图图谱谱,通通过计算算机机图像像分分析析得得到到各各蛋蛋白白质的的等等电点点、分分子子量量、表表达达量量等等,再再结合合以以质谱分分析析为主主要要手手段段的的蛋蛋白白质鉴定定,建建立立起起细胞胞或或组织或或机机体在所体在所谓正常生理条件下的正常生理条件下的蛋白蛋白质图谱质图谱和和数据数据库库。编辑ppt13常规的方法是提取蛋白质,经分离形成一个蛋白质组的二维图谱,通l高效液相高效液相层层析析(HPLC)(HPLC)l虽虽然然HPLCHPLC在在蛋蛋白白组分分析析中中未未能能广广泛泛应用用,但但其其作作为分分离离蛋蛋白白质的的第第一一步步,仍仍具具有有很很好好的的前前景景。双双向向高高效效液液相相层析析(2D-HPLC)(2D-HPLC)也也是是一一种种很很好好的的蛋蛋白白质分分离离纯化化方方法法。其其第第一一相相根根据据分分子子大大小小分分离离蛋蛋白白质,第第二二相相是是反反向向层析析。2D 2D-HPLC-HPLC分分离离蛋蛋白白质的的容容量量比比2-DE2-DE大大,且且速速度度快快。而而毛毛细管管柱柱反反相相高高效效液液相相色色谱(RP-HPLC)(RP-HPLC)也也比比2-DE2-DE快快速速、分分辨辨率率高高1212。目目前前,又又出出现了了将将不不同同液液相相层析析联合合使使用用技技术,称称之之为连续液相液相层析析,其大大提高了液相其大大提高了液相层析的效率析的效率编辑ppt14高效液相层析(HPLC)编辑ppt14l亲和和层析析l亲和和层析析是是利利用用分分子子生生物物学学之之间具具有有的的专一一性性而而设计的的层析析技技术。一一些些生生物物分分子子和和其其配配基基之之间有有特特殊殊的的亲和和力力,如如抗抗原原与与抗抗体体、酶与与底底物物、激激素素与与受受体体等等,他他们在在一一定定条条件件下下能能结合合为复复合合物物。如如果果能能将将复复合合物物中中的的一一方方固固定定在在固固相相载体体上上,就就可可以以从从溶溶液液中中专一一性性的的提提纯另另一一方方。亲和和层析析特特异异性性强、简便便且且高高效效,对含含量量少少又又不不稳定定的的活活性性物物质更更为有效有效,并可得到高并可得到高产率的率的纯化化产物。物。l但但是是,由由于于并并非非所所有有的的生生物物分分子子都都具具有有特特定定的的配配基基,只只有有那那些些具具有有配配基基的的生生物物分分子子才才能能用用亲和和层析析分分离离,所所以以亲和和层析析应用范用范围受到一定的限制受到一定的限制编辑ppt15亲和层析编辑ppt15l毛毛细细管管电电泳泳l毛毛细细管管电电泳泳(capillary(capillary electrophoresis,electrophoresis,CE)CE)技技术是是在在高高电场强度度作作用用下下,对毛毛细管管内内径径(510Lm)(510Lm)中中的的样品品按按分分子子质量量电荷荷、电泳泳迁迁移移率率等等差差异异进行行有有效效分分离离,包包括括毛毛细管管区区电泳泳(CZE,(CZE,依依据据不不同同蛋蛋白白质的的电荷荷质量量比比差差异异进行行分分离离)、毛毛细管管等等电聚聚焦焦(CIEF,(CIEF,依依据据蛋蛋白白质等等电点点不不同同在在毛毛细管管内内形形成成pHpH梯梯度度实现分分离离)和和筛板板-SDS-SDS毛毛细管管电泳泳(依依据据SDS-SDS-蛋蛋白白质复复合合物物在在网网状状骨骨架架中中迁迁移移速速率率的的不不同同而而实现分分离离)等等技技术,其其优点点是是可可实现在在线自自动分分析析,可可用用于于相相对分分子子质量量范范围不不适适于于2-DE2-DE的的样品品,其缺点是存在其缺点是存在对复复杂样品分离不完全的品分离不完全的现象象编辑ppt16毛细管电泳编辑ppt16糖糖组学学l糖糖组学学（GlycomicsGlycomics）又又称称糖糖体体学学，是是生生物物学学的的一一个个学学门，专门研研究究寡寡糖糖类（oligosaccharideoligosaccharide）构构造造与与功功能能。用用来来表表示示生生物物个个体体内内拥有有的的所所有有碳碳水化合物。水化合物。l糖糖组学学研研究究技技术的的关关键在在于于糖糖蛋蛋白白的的分分离离和和富富集集。目目前前，糖糖蛋蛋白白和和聚聚糖糖分分离离策策略略主主要要途途径径；一一是是经典典的的凝凝集集素素亲和和色色谱“糖糖捕捕获”方方法法，另另一一种种是是二二维电泳泳结合特殊染色的分离技合特殊染色的分离技术。编辑ppt17糖组学糖组学（Glycomics）又称糖体学，是生物学的一个l植物凝集素探植物凝集素探针l植植物物凝凝集集素素是是一一类非非免免疫疫来来源源的的，无无酶活活性性的的，能能与与聚聚糖糖特特异异性性结合合的的蛋蛋白白质，它它想想探探针一一样可可以以捕捕获到到混混合合物物中中的的聚聚糖糖，为目目标细胞胞、组织或或集集体体的的糖糖组学学研研究究提提供供一一手手资料料。在在凝凝集集素素亲和和色色谱中中最最常常用用的的植植物物凝凝集集素素有有刀刀豆豆素素A A、半半乳乳糖糖凝凝集集素素、花花生生凝凝集集素素、橙橙黄黄网网胞胞盘菌菌凝凝集集素素等等。不不同同的的植植物物凝凝集集素素用用于于分分离离不不同同类型型的的糖糖蛋蛋白白和和糖糖肽，如如ConAConA和和GaL6GaL6特特异异吸吸附附高高甘甘露露糖糖型型和和复复杂型型N-N-聚聚糖糖；在在O-O-聚聚糖糖中中GaL6GaL6专门吸吸附附含含有有LacNAcLacNAc的的聚聚糖糖。显然然，在在糖糖捕捕获操操作作中中植植物物凝凝集集素素的的应用用还是有一定的限制的是有一定的限制的。编辑ppt18植物凝集素探针编辑ppt18l糖糖基基捕捕获的的过程程，利利用用植植物物凝凝集集素素亲和和柱柱捕捕获糖糖蛋蛋白白的的过程程：a a、植植物物凝凝集集素素亲和和柱柱1 1捕捕获一一组糖糖蛋蛋白白；b b、糖糖蛋蛋白白被被蛋蛋白白酶彻底底水水解解；c c、水水解解产物物在在经植植物物凝凝集集素素亲和和柱柱1 1捕捕获到到糖糖肽；e e、肽链和和糖糖链分分别经HPLC/MSHPLC/MS分分离离鉴定定；f f、获得得肽序序列列和和糖糖链分分子子质量量；g g、分分析析蛋蛋白白质序序列列并并查询数数据据库获得得相相关关遗传信信息息；h h、分分析析聚聚糖糖的的结构构获得得糖糖基基化化信信息息。使使用用不不同同的的植植物物凝凝集集素素柱柱进行行第第二二和和第第三三次次循循环，捕捕获其其他他类型型的的糖糖肽，可可以以对某某个个细胞核集体胞核集体进行行较全面的糖全面的糖组学研究。学研究。编辑ppt19糖基捕获的过程，利用植物凝集素亲和柱捕获糖蛋白的过程：a、植lPASPAS法法最最初初是是作作为寡寡糖糖的的荧光光标记发展展的的。后后来来PASPAS运运用用在在糖糖蛋蛋白白的的二二维电泳泳中中，后后修修饰染染色色和和鉴别染染色色技技术对糖糖蛋蛋白白与与肺肺汤蛋蛋白白的的差差异异染染色色，染染色色蛋蛋白白质在在胶胶内内水水解解用用质谱测定定准准确确的的相相对分分子子质量量。该方方法法灵灵敏敏度度较高高，检测限限可可达达到到300pg300pg，而而且且MSMS检测PAPA衍衍生生糖糖蛋蛋白白的的灵灵敏敏度度远高高于于非非衍衍生生糖蛋白。糖蛋白。编辑ppt20PAS法最初是作为寡糖的荧光标记发展的。后来PAS运用在糖蛋lSteinbergSteinberg等等使使用用高高碘碘酸酸将将糖糖蛋蛋白白的的聚聚糖糖氧氧化化成成醛，然然后后荧光光染染料料Pro-Emerald Pro-Emerald 300300共共价价结合合到到糖糖醛上上产生生高高荧光光共共轭化化合合物物。通通过2DE2DE分分离离蛋蛋白白质，2DE2DE凝凝胶胶用用SYPRORubySYPRORuby染染料料染染色色，所所有有蛋蛋白白质被被染染色色成成红色色，而而糖糖蛋蛋白白与与Pro-Emerald Pro-Emerald 300300的的共共轭化化合合物物在在530nm530nm呈呈绿色色，将将非非糖糖蛋蛋白白和和糖糖蛋蛋白白区区别开开。切下切下2DE2DE凝胶上糖蛋白点，可以凝胶上糖蛋白点，可以进行后行后续的的鉴定。定。编辑ppt21Steinberg等使用高碘酸将糖蛋白的聚糖氧化成醛，然后荧脂脂质组学学l脂脂质组学学是是对生生物物体体、组织或或细胞胞中中的的脂脂质以以及及与与其其相相互互作作用用的的分分子子进行行系系统分分析析的的一一门新新兴学学科科脂脂质具具有有多多种种重重要要的的生生物物功功能能，脂脂质代代谢异异常常可可引引发诸多多人人类疾疾病病，包包括括糖糖尿尿病病、肥肥胖胖症症、癌症以及神癌症以及神经退行性疾病等。退行性疾病等。l目目前前，脂脂质组学学研研究究已已成成为一一个个前前景景广广阔的的热门领域域，并并广广泛泛地地应用用到到包包括括药物物研研发、分分子子生生理理学学、分分子子病病理理学学、功功能能基基因因组学学、营养养学学以以及及环境与健康等重要境与健康等重要领域域编辑ppt22脂质组学脂质组学是对生物体、组织或细胞中的脂质以及与其相互作lTLCTLC法法是是最最早早应应用用于于脂脂质质分分析析的的色色谱谱法法。它它将将脂脂类类用用硅硅胶胶板板上上行行法法展展层层,展展开开后后的的板板上上喷脂脂质显色色剂。显色色剂有有碘碘蒸蒸气气、Dittmer-lesterDittmer-lester钼蓝、DragendorffDragendorff试剂、VaskovskyVaskovsky试剂和和茚三三酮等等。各各种种脂脂质在在TLCTLC板板上上展展开开后后,脂脂质的的定定量量可可采采用用薄薄层色色谱扫描描仪计算算积分分值,或或将将脂脂质的的斑斑点点刮刮下下来来,然然后后测定定其其含含量量(Peterson(Peterson and and Cummings,Cummings,2006)2006)。TLCTLC法分法分为单向和双向向和双向2 2种。种。编辑ppt23TLC法是最早应用于脂质分析的色谱法。它将脂类用硅胶板上行法l单单向向TLCTLC能能够同同时分分析析几几个个样品品,但但很很难将将组分分完完全全分分开开;双双向向TLCTLC可可将将脂脂类各各组分分完完全全分分开开,但但是是它它1 1次次只只能能分分析析1 1个个样品品。TLCTLC法法具具有有直直观、快快捷捷的的优点点,能能快快速速分分离离脂脂质,而而且且价价格格比比较便便宜宜。脂脂质经过TLCTLC初初步步分分离离后后也也可可以以用用气气相相色色谱和和高高效效液液相相色色谱做做进一步的分析。一步的分析。编辑ppt24单向TLC能够同时分析几个样品,但很难将组分完全分开;双l但但是是,TLCTLC法法需需要要的的样样品品量量大大,测定定的的灵灵敏敏度度和和分分辨辨率率都都很很低低。而而且且,由由于于TLCTLC板板上上的的斑斑点点在在切切除除过程程中中极极易易发生生不不饱饱和和脂脂类类氧氧化化,因因而而破破坏坏了了部部分分脂脂类结构构。另另外外,显显色色反反应应也也容容易易受受到到样样品品杂杂质质的干的干扰扰。编辑ppt25但是,TLC法需要的样品量大,测定的灵敏度和分辨率都很低l软软电电离离技技术术出出现现于于2020世世纪8080年年代代末末期期。这种种技技术的的特特征征是是可可以以使使生生物物分分子子在在无无碎碎片片断断裂裂的的情情况况下下进进行行离子化离子化。l其其优优点点一一是是可可不不需需要要衍衍生生化化而而直直接接对对高高分分子子量量和和不不挥挥发发性性的的混混合合物物进进行行检检测测;二二是是被被分分析析物物碎碎片片最少最少,有利于有利于对样品混合物的解析品混合物的解析。l通通过过软软电电离离质质谱谱技技术术进进行行脂脂质质组组学学分分析析在在动动物物和和微微生生物物中中应应用用较较早早,分分析析方方法法也也较为成成熟熟。但但是是,该方方法法在在植植物物上上应用用则相相对滞滞后后,主主要要因因为植植物物比比动物物含含有有更更多多的的难以以分分析析的的甘甘油油糖糖脂脂,如如MGDGMGDG、DGDGDGDG、SQDGSQDG等。等。编辑ppt26软电离技术出现于20世纪80年代末期。这种技术的特征是可以使l电喷雾电电喷雾电离离质谱质谱(ESI-MSESI-MS)法法l电电喷喷离离子子化化法法(ESI)(ESI)是是目目前前脂脂质组学学分分析析中中应用用最最多多的的软电离离法法。该该方方法法是是将将含含有有分分析析物物的的洗洗脱脱液液通通过过高高电电压压的的针针尖尖喷喷射射出出来来,带电的的雾滴滴再再被被加加热使使溶溶剂蒸蒸发,最最后后分分析析物物分分子子形形成成气气相相的的离离子子(Kebarle andHo,1997)(Kebarle andHo,1997)。lFennFenn等等(1989)(1989)最最早早将将ESIESI技技术应用用于于大大量量混混合合物物的的分分析析。根根据据分分析析方方法法不不同同,可可将将ESI-MSESI-MS定定量量分分析析脂脂质的的方方法法分分为3 3类:ESI-MSESI-MS直直接接定定量量法法、ESI-ESI-MS/MSMS/MS定量法及定量法及HPLC-ESI-MSHPLC-ESI-MS定量法。定量法。编辑ppt27电喷雾电离质谱(ESI-MS)法编辑ppt27Thank you.编辑ppt28Thank you.编辑ppt28