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n什么是蛋白质什么是蛋白质?n蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽通过肽键键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物相连形成的高分子含氮化合物蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性1.1.蛋白质是生物蛋白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分分分布布广广：所所有有器器官官、组组织织都都含含有有蛋蛋白白质质；细胞的各个部分都含有蛋白质。细胞的各个部分都含有蛋白质。含含量量高高：蛋蛋白白质质是是细细胞胞内内最最丰丰富富的的有有机机分分子子，占占人人体体干干重重的的4545，某某些些组组织织含含量量更更高高，例如脾、肺及横纹肌等高达例如脾、肺及横纹肌等高达8080。1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2 2）代谢调节作用）代谢调节作用3 3）免疫保护作用）免疫保护作用4 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5 5）运动与支持作用）运动与支持作用6 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递2.2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能3.3.氧化供能氧化供能OUTLINEn第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成n第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构n第三节第三节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系n第四节第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质n第五节蛋白质的分离纯化第五节蛋白质的分离纯化第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成n 组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素q主要有主要有C C、H H、O O、N N和和S S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点q各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为1616。q n由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：致含量：100100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 (g%)(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.25100 6.251001/16%一、氨基酸一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位组成蛋白质的基本单位n存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300300余种，但组成人余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有体蛋白质的氨基酸仅有2020种，且均属种，且均属 L-L-氨基氨基酸（甘氨酸除外）。酸（甘氨酸除外）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式R1.1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2.2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.3.含芳香环的氨基酸含芳香环的氨基酸4.4.酸性氨基酸酸性氨基酸5.5.碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类*20*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸甘氨酸甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸缬氨酸 （Val,V）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）亮氨酸亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸异亮氨酸 （Ile,I）2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q）3.含芳香环的氨基酸含芳香环的氨基酸苯丙氨酸（苯丙氨酸（Phe,FPhe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trp,W）4.酸性氨基酸酸性氨基酸5.碱性氨基酸碱性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸谷氨酸 （Glu,E）赖氨酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸精氨酸 （Arg,R）组氨酸组氨酸 （His,H）非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸 GlyGly Ala Val Leu Ile Phe ProTrpTrp Ser Try Cys Ser Try Cys MetMet Asn Gln Thr Asn Gln ThrAsp GluAsp Glu Lys Arg HisLys Arg His 杂环氨基酸杂环氨基酸组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trg,W）含羟基或硫脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HHn注：二十种氨基酸的结构特点注：二十种氨基酸的结构特点n支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸n含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸n含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、n 甲硫氨酸（含硫甲基）甲硫氨酸（含硫甲基）n含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸n含胍基的氨基酸：精氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸n含咪唑基的氨基酸：组氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸n亚氨基酸：脯氨酸亚氨基酸：脯氨酸n含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺n含吲哚基的氨基酸：色氨酸含吲哚基的氨基酸：色氨酸n含含-氨基的氨基酸：赖氨酸氨基的氨基酸：赖氨酸（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质1.1.两性解离及等电点两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。于所处溶液的酸碱度。CHRCOONH2pH=pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH3+H+OH-+H+OH-(pK1)(pK2)当当氨氨基基酸酸溶溶液液在在某某一一定定pHpH值值时时，使使某某特特定定氨氨基基酸酸分分子子上上所所带带正正负负电电荷荷相相等等，成成为为两两性性离离子子，在在电电场场中中既既不不向向阳阳极极也也不不向向阴阴极极移移动动，此此时时溶溶液液的的pHpH值值即即为为该该氨氨基基酸酸的的等等电电点点(isoelctric point)isoelctric point)。Titration Curve for Glutamic AcidpK1 carboxylic acid=2.2 pK2 R group=4.3 pK3 amino group=9.7 pI=(pK1+pK2)/2 =3.25赖氨酸滴定曲线和等电点计算赖氨酸滴定曲线和等电点计算二氨基一羧基二氨基一羧基AAAA的的等电点计算等电点计算：pI=2pK2+pK3BpIpK3pK2pK1加入的加入的OH-mL数数pH2.2.紫外吸收紫外吸收3.3.茚三酮反应茚三酮反应 氨氨基基酸酸与与茚茚三三酮酮水水合合物物共共热热，可可生生成成蓝蓝紫紫色色化化合合物物，其其最最大大吸吸收收峰峰在在570nm570nm处处。由由于于此此吸吸收收峰峰值值与与氨氨基基酸酸的的含含量量存存在在正正比比关关系系，因因此此可可作作为为氨氨基基酸酸定定量量分分析析方方法法。（Pro)Pro)+3H20茚三酮茚三酮(无色无色)NH3CO2 RCHO+还原性茚三酮还原性茚三酮紫色化合物紫色化合物(弱酸弱酸)加热加热+2NH3+还原性茚三酮还原性茚三酮还原性茚三酮还原性茚三酮（三）蛋白质是由许多氨基酸残基组成（三）蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链的多肽链n*肽键肽键(peptide bond)(peptide bond)是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的-羧羧基与另一个氨基酸的基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的氨基脱水缩合而形成的化学键化学键+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键COHOCH3NH2HC+HOCOCH2NH2HC丙氨酸丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸COHOCH3HCCH2NH2HC肽键肽键NCOH二肽二肽丙苯氨丙氨酸丙苯氨丙氨酸氨基酸借肽键相连而形成的化合物称氨基酸借肽键相连而形成的化合物称肽肽(peptide)MetPhe二肽二肽LysMetPhe三肽三肽CysThrLysMetPhe五肽五肽氨基末端氨基末端(端端)羧基末端羧基末端(C 端端)CysMetPheLysSerThrValNH2COOH*由由十十个个以以内内氨氨基基酸酸相相连连而而成成的的肽肽称称为为寡寡肽肽(oligopeptide)，由由更更多多的的氨氨基基酸酸相相连连形形成成的的肽肽称称多多肽肽(polypeptide)。其其形形状状为为一一条条没没有有分分支支的的长长链链,又又称多肽链或肽链称多肽链或肽链.*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为团不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。氨基末端氨基末端(端端)羧基末端羧基末端(C 端端)CysMetPheLysSerThrValNH2COOH50N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶几种生物活性肽几种生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+解毒解毒,抗氧化抗氧化 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽高级高级结构结构第二节 蛋白质的分子结构n一级结构一级结构(primary structure)(primary structure)n二级结构二级结构(secondary structure)(secondary structure)n三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary structure)n四级结构四级结构(quaternary structure)(quaternary structure)蛋蛋白白质质结结构构的的主主要要层层次次一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structureTertiary structureTertiary structurequariernary structurequariernary structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondary structuresupersecondary structureStructure domanStructure doman一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构n定义定义q蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。n主要的化学键主要的化学键q肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键，有些蛋白质还包括二硫键CysMet Phe LysSer Thr ValNH2COOH一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。功能的基础。胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构n蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象涉及氨基酸残基侧链的构象 n主要的化学键：主要的化学键：氢键氢键 在肽键中，与相连的氧原子和在肽键中，与相连的氧原子和氢原子呈反式构型氢原子呈反式构型（反式）（反式）（顺式）（顺式）C CN NO OH HC CN NO OH H肽键的特点：肽键的特点：肽键的特点：肽键的特点：CN单键为0.149nmC=N双键为0.127nm具有部分双键性质具有部分双键性质不能自由旋转不能自由旋转肽键中键长为肽键中键长为0.132nm0.132nmC CN NO OH H肽键中的和均不能自由旋转肽键中的和均不能自由旋转肽键肽键(-CONH-)(-CONH-)中的个原子中的个原子个个碳原子碳原子(C(C)和和被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽单元构成一个肽单元(peptide unit)(peptide unit)。蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋螺旋 (-helix)-helix)-折叠折叠 (-pleated sheet)-pleated sheet)-转角转角 (-turn)-turn)无规卷曲无规卷曲 (random coil)(random coil)螺旋螺旋 (helix)helix)由肽键平面盘旋由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象形成的螺旋状构象1.1.概念概念2.2.螺旋的结构特征螺旋的结构特征(1)(1)以肽键平面为单位以肽键平面为单位,以以碳原子为转折盘旋形碳原子为转折盘旋形成成右手螺旋右手螺旋(2)(2)每每3.63.6个氨基酸残基个氨基酸残基 绕成一个螺圈绕成一个螺圈(360(3600 0)螺距为螺距为0.54nm0.54nm每个氨基酸上升每个氨基酸上升0.15nm0.15nm肽键平面与中心轴肽键平面与中心轴平行平行(3)(3)主链原子构成螺旋的主体主链原子构成螺旋的主体,侧链侧链在其外部在其外部(4)(4)肽键的肽键的COCO和和NHNH 都形成都形成氢键氢键是稳定螺旋的主要是稳定螺旋的主要作用力作用力氢键的方向与中心氢键的方向与中心轴大致平行轴大致平行,折叠折叠n肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称折叠折叠n常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在一起形成扇面状故又称一起形成扇面状故又称折叠片或折叠片或片层片层n折叠结构特点折叠结构特点q相邻肽键平面的夹角为相邻肽键平面的夹角为1100 1100，呈锯齿状排列；侧，呈锯齿状排列；侧链基团交错地分布在片层平面的两侧。链基团交错地分布在片层平面的两侧。n条肽段平行排列构成，肽段之间可顺向平行条肽段平行排列构成，肽段之间可顺向平行(均从均从N-C)N-C)，也可反向平行，也可反向平行 n由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴接近垂直。由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴接近垂直。转角转角(turn)turn)n肽链出现肽链出现18001800回折的转角处结构称为回折的转角处结构称为转角转角n结构特征结构特征q常见于球状蛋白质分子表面第一个残基的常见于球状蛋白质分子表面第一个残基的C=OC=O与第与第四个残基的四个残基的N-HN-H形成氢键形成氢键.无规卷曲无规卷曲(random coil)(random coil)n没有确定规律性的肽键构象没有确定规律性的肽键构象n常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲折叠折叠H2NCOOH无无规规则则卷卷曲曲示示意意图图无规则卷曲无规则卷曲细胞色素细胞色素C的三级结构的三级结构氨基酸残基的氨基酸残基的侧链对二二级结构形成的影响构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋螺旋或或-折叠，它就会出现相应的二级结构。折叠，它就会出现相应的二级结构。模体模体n在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体个特殊的空间构象，被称为模体(motif)(motif)。钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌指结构锌指结构 1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 -链链-迂回迂回回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构-迂回迂回结构域结构域n在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域这种相对独立的三维实体称为结构域纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域-螺旋螺旋-转角转角-折叠折叠二硫键二硫键结构域结构域1结构域结构域2三、蛋白质的三级结构n整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。n主要的化学键主要的化学键n疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van der WaalsVan der Waals力等。力等。目目 录录氢键氢键n负电性很强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共负电性很强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢键。键。疏水相互作用疏水相互作用n由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力的作用力离子键离子键n 由异性电荷间的静电吸引形成的键。由异性电荷间的静电吸引形成的键。肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端分子伴侣分子伴侣n分子伴侣分子伴侣(chaperon)(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构n分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。解聚后，再诱导其正确折叠。n分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。起了重要的作用。四、蛋白质的四级结构四、蛋白质的四级结构n有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基亚基 (subunit)(subunit)。n亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。键和离子键。血血红红蛋蛋白白的的四四级级结结构构 五、蛋白质的分类五、蛋白质的分类n(1)(1)依据蛋白质的外形分类依据蛋白质的外形分类n 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。质。n球状蛋白质：球状蛋白质：globular proteinglobular protein外形接近球形或椭圆外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。一类。n纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：fibrous proteinfibrous protein分子类似纤维或细分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。蛋白质。（2 2）按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白）按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白(simple protein)(simple protein)和结合蛋白和结合蛋白(conjugated(conjugated protein)protein)简单蛋白简单蛋白n又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的氨基酸组成的肽链，不含其它成分。肽链，不含其它成分。n1 1，清蛋白和球蛋白：，清蛋白和球蛋白：albumin and globulinalbumin and globulin广泛存在广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。溶于稀酸中。n2 2，谷蛋白，谷蛋白(glutelin)(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin)(prolamin)：植物：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70708080乙醇中。乙醇中。n3 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。n4 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。结合蛋白结合蛋白n由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，n色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。白、叶绿蛋白和细胞色素等。n糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。糖蛋白等。n脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清如血清-，-脂蛋白等。脂蛋白等。n核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。核糖核蛋白等。第三节第三节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系n一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 n（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性前体与活性蛋白质一级结构的关系前体与活性蛋白质一级结构的关系 n由由108108个氨基酸残基构成的前胰岛素原个氨基酸残基构成的前胰岛素原(pre-proinsulin(pre-proinsulin），在合），在合成的时候完全没有活性，当切去成的时候完全没有活性，当切去N-N-端的端的2424个氨基酸信号肽，形成个氨基酸信号肽，形成8484个氨基酸的胰岛素原（个氨基酸的胰岛素原（proinsulinproinsulin），胰岛素原也没活性，在），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，包装分泌时，A A、B B链之间的链之间的3333个氨基酸残基被切除，才形成具有个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。如图所示活性的胰岛素。如图所示:（二）一级结构相似的蛋白质具有相（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能似的高级结构与功能（三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病n例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。n所以，蛋白质一定的结构执行一定的功能。功所以，蛋白质一定的结构执行一定的功能。功能不同的蛋白质总是有着不同的序列；比较种能不同的蛋白质总是有着不同的序列；比较种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。生很大的变化。二、蛋白质的功能依赖特定空间结构n（一）血红蛋白与肌红蛋白结构相似（一）血红蛋白与肌红蛋白结构相似肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数数（称称百百分饱和度分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与影响与氧结合（二）血红蛋白的构象变化与影响与氧结合肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线O2血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环的的小小孔孔中中，继继而而引引起起肽肽链链位位置置的的变动。变动。肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线协同效应协同效应(cooperativity)(cooperativity)n一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。为协同效应。n如果是促进作用则称为正协同效应如果是促进作用则称为正协同效应 q(positive cooperativity)(positive cooperativity)n如果是抑制作用则称为负协同效应如果是抑制作用则称为负协同效应 q(negative cooperativity)(negative cooperativity)变构效应变构效应(allosteric effect(allosteric effect）蛋蛋白白质质空空间间结结构构的的改改变变伴伴随随其其功功能能的的变变化化，称称为为变构效应变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 n蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。n蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。n这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,(prion protein,PrP)PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrPPrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPPrPc c。PrPPrPc c在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPPrPscsc，从而致病。，从而致病。PrPPrPc c-螺旋螺旋PrPPrPscsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第四节第四节 蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化n一、理化性质一、理化性质 n（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 n蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条件下都可解离条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)isoelectric point,pI)n当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成正、负离时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的溶液的pHpH称为蛋白质的等电点。称为蛋白质的等电点。（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 n蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1 1万万至至100100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1 1100nm100nm，为胶粒范围之内为胶粒范围之内n蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素q颗粒表面电荷颗粒表面电荷q水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 n*蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)(denaturation)n在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。性的丧失。造成变性的因素造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等。变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。白质的一级结构。应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。质制剂（如疫苗等）的必要条件。若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，去去除除变变性性因因素素后后，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有的的构构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation)(renaturation)。天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀蛋白质沉淀在在一一定定条条件件下下，蛋蛋白白疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein(protein coagulation)coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。（四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的ODOD280280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可可作作蛋白质定量测定。蛋白质定量测定。（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法*透析透析(dialysis)(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。开的方法。*超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。第五节蛋白质的分离和纯化第五节蛋白质的分离和纯化（二）使蛋白质沉淀的方法（二）使蛋白质沉淀的方法(1)(1)盐析法盐析法(salting outsalting out)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称称 为盐析为盐析常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等作用原理作用原理:盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力。水化层，减少分子间静电斥力。特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。n(2)(2)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n 使蛋白质脱去水化层使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。聚集而沉淀。常用有机溶剂常用有机溶剂:甲醇甲醇、乙醇乙醇、丙酮丙酮缺点：常会使蛋白质变性缺点：常会使蛋白质变性注意事项注意事项:必须在低温下操作，尽量缩短处理的时必须在低温下操作，尽量缩短处理的时间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去n(3)(3)重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法n 重金属离子如重金属离子如Cu2+Cu2+、Hg2+Hg2+、Ag2+Ag2+、Pb2+Pb2+等带等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。n若溶液若溶液pHpH大于蛋白质的大于蛋白质的pIpI，沉淀更易发生，沉淀更易发生n缺点：此法常使蛋白质变性失活。缺点：此法常使蛋白质变性失活。n(4)(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法n 生生物物碱碱试试剂剂(如如鞣鞣酸酸、苦苦味味酸酸、钨钨酸酸等等)，某某些些酸酸类类(主主要要是是指指三三氯氯醋醋酸酸、磺磺酰酰水水杨杨酸酸和和硝硝酸酸等等)，与与带带正正电电的的蛋蛋白白质质 结结合合生生成成不不溶溶性性的的盐而沉淀。盐而沉淀。n缺点：常引起蛋白质变性缺点：常引起蛋白质变性注意事项注意事项:反应溶液的反应溶液的pHpIpHpI，确保蛋白质以，确保蛋白质以阳离子形式存在阳离子形式存在（三）电泳（三）电泳n蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的颗的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术技术,称为电泳称为电泳(elctrophoresis)(elctrophoresis)。n根据支撑物的不同，可分为根据支撑物的不同，可分为薄膜薄膜电泳、电泳、凝胶凝胶电电泳等。泳等。n醋酸纤维素薄膜电泳SDS-SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳电泳n常用于蛋白质分子量的测定常用于蛋白质分子量的测定等电聚焦电流与双向电泳（四）层析（四）层析n层析层析(chromatography)(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理q待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的到分离蛋白质的目的（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。及性质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)又称分子筛又称分子筛层析，层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。利用各蛋白质分子大小不同分离。亲和层析亲和层析带正电荷多蛋带正电荷多蛋白紧密结合白紧密结合带负电荷多蛋带负电荷多蛋白流过层析柱白流过层析柱阳阳离离子子交交换换树树脂脂工工作作示示意意图图亲亲和和层层析析工工作作示示意意图图蛋白质蛋白质载体载体介质介质配体配体结合结合洗脱洗脱洗脱介质洗脱介质（五）超速离心（五）超速离心n超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)(ultracentrifugation)既可以用既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。子量。n蛋白质在离心场中的行为用沉降系数蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)(sedimentation coefficient,S)表示表示,沉降沉降系数与蛋白质的密度和形状相关系数与蛋白质的密度和形状相关 三、多肽链中氨基酸序列分析三、多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列四、蛋白质空间结构测定四、蛋白质空间结构测定*二级结构测定二级结构测定通通常常采采用用圆圆二二色色光光谱谱(circular dichroism，CD)测测定定溶溶液液状状态态下下的的蛋蛋白白质质二二级级结结构构含含量量。-螺螺旋旋的的CDCD峰峰有有222nm222nm处处的的负负峰峰、208nm208nm处处的的负负峰峰和和198 198 nmnm处处的的正正峰峰三三个个成成分分；而而-折折叠叠的的CDCD谱不很固定。谱不很固定。*三级结构测定三级结构测定X射射线线衍衍射射法法(X-ray diffraction)和和核核磁磁共共振振技技术术(nuclear magnetic resonance,NMR)是是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。*用用分分子子力力学学、分分子子动动力力学学的的方方法法，根根据据物物理理化化学学的的基基本本原原理理，从从理理论论上上计计算算蛋蛋白白质质分分子子的空间结构。的空间结构。根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构*通通过过对对已已知知空空间间结结构构的的蛋蛋白白质质进进行行分分析析，找找出出一一级级结结构构与与空空间间结结构构的的关关系系，总总结结出出规规律律，用于新的蛋白质空间结构的预测。用于新的蛋白质空间结构的预测。
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