造血干细胞移植讲解课件

造血干细胞移植造血干细胞移植造血干细胞移植1造血干细胞移植造血干细胞移植(SCT)按其干细胞的按其干细胞的来源来源,分为：分为：（1）自体造血干细胞移植）自体造血干细胞移植(ASCT)（2）同种异基因造血干细胞移植）同种异基因造血干细胞移植(Allo-SCT)（3）异种造血干细胞移植）异种造血干细胞移植(SCT)。造血干细胞移植(SCT)按其干细胞的来源,分为：（1）自体2根据干细胞采集的部位又可分为：根据干细胞采集的部位又可分为：（1）骨髓移植）骨髓移植(BMT)（2）外周血造血干细胞移植）外周血造血干细胞移植(PBSCT)（3）脐血造血干细胞移植）脐血造血干细胞移植(NCSCT)（4）胎肝造血干细胞移植）胎肝造血干细胞移植(NLSCT)根据干细胞采集的部位又可分为：（1）骨髓移植(BMT)（3 骨骨 髓髓 移移 植植 骨 髓 移 植4 骨髓移植骨髓移植(简称简称BMT)BMT)是指对病是指对病人实施免疫抑制处理后人实施免疫抑制处理后,使机体失使机体失去排斥异体组织的能力去排斥异体组织的能力,通过移植通过移植骨髓中的多能造血干细胞给病人骨髓中的多能造血干细胞给病人,以重建造血和免疫功能以重建造血和免疫功能,从而达到从而达到治愈某些疾病的一种方法。治愈某些疾病的一种方法。骨髓移植(简称BMT)是指对病人实施免疫抑制处理后,5一、骨髓移植种类一、骨髓移植种类 根据骨髓的不同来源根据骨髓的不同来源,可将骨髓移可将骨髓移植分为：植分为：自体骨髓移植自体骨髓移植(ABMT)(ABMT)同种异基因骨髓移植同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)(Allo-BMT)同种同基因骨髓移植同种同基因骨髓移植(SBMT)(SBMT)异种骨髓移植异种骨髓移植一、骨髓移植种类 根据骨髓的不同来源,可将骨髓移植分6(一一)自体骨髓移植自体骨髓移植(ABMT)(ABMT)取患者自身骨髓进行保存。取患者自身骨髓进行保存。在其相应时间内在其相应时间内,用大剂量的放疗和用大剂量的放疗和/或化疗或化疗,最大限度地杀伤患者体内的肿瘤最大限度地杀伤患者体内的肿瘤细胞细胞,然后再输回自体骨髓然后再输回自体骨髓,恢复患者造血恢复患者造血功能。功能。此种移植不会出现排斥和移植物抗宿此种移植不会出现排斥和移植物抗宿主病主病(GVHD)(GVHD)等严重合并症等严重合并症,骨髓移植容易骨髓移植容易植活，但极易复发。植活，但极易复发。(一)自体骨髓移植(ABMT)取患者自身骨髓进行7ABMTABMT时必须注意以下几个方面时必须注意以下几个方面:肿瘤必须未累及骨髓肿瘤必须未累及骨髓,移植前骨盆未受过射线移植前骨盆未受过射线照射。照射。年龄不宜过大。年龄不宜过大。肿瘤必须对放、化疗敏感。肿瘤必须对放、化疗敏感。自体骨髓移植有利于保护骨髓自体骨髓移植有利于保护骨髓,免受放、化疗免受放、化疗影响。影响。不能防止放、化疗对心、肝、肾等脏器的毒性不能防止放、化疗对心、肝、肾等脏器的毒性损害。损害。ABMT时必须注意以下几个方面:肿瘤必须未累及骨髓,移8自体骨髓成功的关键是：自体骨髓成功的关键是：保存造血干细胞的活力和基本功能。保存造血干细胞的活力和基本功能。骨髓采集后如置于常温下骨髓采集后如置于常温下,骨髓在培养液骨髓在培养液或保存液内最长不能超过或保存液内最长不能超过7272小时。小时。因此大剂量放、化疗须在短时间内完因此大剂量放、化疗须在短时间内完成成,或者有时难以忍受。或者有时难以忍受。在在-196-196长期保存。长期保存。自体骨髓成功的关键是：保存造血干细胞的活力和基本功9对缓解期肿瘤对缓解期肿瘤(尤其是血液系统的白血尤其是血液系统的白血病和多发性骨髓瘤病和多发性骨髓瘤)进行进行BMT,BMT,采集的骨髓采集的骨髓最好能行体外净化最好能行体外净化,去除残存的肿瘤细胞去除残存的肿瘤细胞,否则移植后复发率极高。否则移植后复发率极高。移植后不出现移植后不出现GVHD,GVHD,就不会出现抗肿瘤就不会出现抗肿瘤效应效应,故复发率极高。故复发率极高。对缓解期肿瘤(尤其是血液系统的白血病和多发性骨髓瘤)进行B10（二）同种同基因骨髓移植（二）同种同基因骨髓移植(SBMT)(SBMT)在人类仅限于同卵双胎间的移植在人类仅限于同卵双胎间的移植,这这种机会极少。因无供受者间免疫方面的障种机会极少。因无供受者间免疫方面的障碍碍,无需免疫抑制处理无需免疫抑制处理,也不会出现排斥和也不会出现排斥和GVHD,GVHD,因而临床效果较好。因而临床效果较好。倘若用于治疗白血病、多发性骨髓瘤倘若用于治疗白血病、多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤等血液系统恶性肿瘤,移植后复发率比移植后复发率比Allo-BMTAllo-BMT要高要高,这可能与缺乏移植物抗肿这可能与缺乏移植物抗肿瘤效应作用有关。瘤效应作用有关。（二）同种同基因骨髓移植(SBMT)在人类仅限于同11（三）同种异基因骨髓移植（三）同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)(Allo-BMT)是指供一受者之间主要组织相容性复合物是指供一受者之间主要组织相容性复合物(简称简称MHC)MHC)相合的同种两个个体间的移植。相合的同种两个个体间的移植。目前开展的是基因型相同或基本相同的兄目前开展的是基因型相同或基本相同的兄弟姐妹间的移植弟姐妹间的移植,少数为亲子间的移植少数为亲子间的移植,也有人也有人类白细胞抗原类白细胞抗原(简称简称HLA)HLA)表型相同的无关人员之表型相同的无关人员之间移植，此种移植机会极少。间移植，此种移植机会极少。易并发易并发GVHD,GVHD,但其优点是移植后疗效比但其优点是移植后疗效比ABMTABMT和和SBMTSBMT佳。佳。（三）同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)是指供12二、供受者选择二、供受者选择:（一）受者（一）受者(患者患者)选择应注意选择应注意:(1)(1)年龄控制年龄控制2 25050周岁。周岁。(2)(2)选择合适的移植时机选择合适的移植时机,如：急淋高危组如：急淋高危组和急非淋和急非淋CRCR1 1后后,低危组急淋则在低危组急淋则在CRCR2 2后；慢后；慢性粒细胞性白血病在慢性期的早期性粒细胞性白血病在慢性期的早期(发病发病一年以内一年以内)，而重型再生障碍性贫血应尽，而重型再生障碍性贫血应尽早移植。早移植。二、供受者选择:（一）受者(患者)选择应注意:(1)年龄13(3)(3)无急慢性感染病灶。无急慢性感染病灶。(4)(4)左心室射血指数左心室射血指数5.05.0、用力肺活量、用力肺活量(forced vital capatity)60%(forced vital capatity)60%、一氧化、一氧化碳弥散能力碳弥散能力(DLCO)50%(DLCO)50%。(5)(5)血肌酐血肌酐110mol/L(2mg/dl)110mol/L(2mg/dl)和总胆和总胆红素红素18mol/L(18mol/L(2mg/dl2mg/dl）。）。(3)无急慢性感染病灶。(4)左心室射血指数5.0、用力14（二）供者选择（二）供者选择:首选首选HLAHLA配型相合的同胞兄弟姐配型相合的同胞兄弟姐妹为供者妹为供者,如有两个以上供者应选择如有两个以上供者应选择与患者与患者ABOABO血型或性别相同者。血型或性别相同者。也可选择单倍型相同的家庭成也可选择单倍型相同的家庭成员作为供者。员作为供者。（二）供者选择:首选HLA配型相合的同胞兄弟姐妹为15 选用选用HLAHLA表型相同或相似的无表型相同或相似的无关人员作供者关人员作供者,由于由于HLAHLA的高度多的高度多态性态性,使其概率甚小。使其概率甚小。选用HLA表型相同或相似的无关人员作供者,由于HLA的16三、同种异基因骨髓移植三、同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)(Allo-BMT)和同和同种同基因骨髓移植种同基因骨髓移植(SBMT)(SBMT)（一）移植步骤（一）移植步骤:1.1.供受者红细胞血型检测及供受者红细胞血型检测及HLAHLA配型配型,应用应用PCRPCR进行进行HLA-AHLA-A、B B、C C、DRDR抗原分型抗原分型,且且HLAHLA相同供受者进行混合淋巴细胞培养和相同供受者进行混合淋巴细胞培养和淋巴细胞毒交叉试验。淋巴细胞毒交叉试验。三、同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)和同种同基因骨髓移172.2.供者准备供者准备:详细询问供髓者的病史和全面体详细询问供髓者的病史和全面体检，对血、骨髓及心、肝、肾、免疫检，对血、骨髓及心、肝、肾、免疫功能等进行检查。骨髓检查包括常规功能等进行检查。骨髓检查包括常规分类、粒分类、粒-单集落形成测定单集落形成测定(GM-CFU)(GM-CFU)、染色体分析染色体分析,此外还应检查血清巨细胞此外还应检查血清巨细胞病毒等病毒抗体滴度和华康氏反应。病毒等病毒抗体滴度和华康氏反应。2.供者准备:详细询问供髓者的病史和全面体检，对18 如为同性供者应查红细胞同如为同性供者应查红细胞同工酶和血型工酶和血型(包括亚型包括亚型),),以此作为以此作为移植后骨髓是否植入的依据。移植后骨髓是否植入的依据。另外，供髓前另外，供髓前4 4周开始采用周开始采用自体血保存法储备自体血自体血保存法储备自体血600600800800毫升。毫升。如为同性供者应查红细胞同工酶和血型(包括亚型),以193.3.受者准备受者准备预处理前应仔细体检；预处理前应仔细体检；进行痰、尿、粪便、皮肤、耳、鼻、咽拭进行痰、尿、粪便、皮肤、耳、鼻、咽拭子细菌、真菌培养；子细菌、真菌培养；预处理前一周开始口服肠道抑菌剂预处理前一周开始口服肠道抑菌剂,；洗必泰液漱口洗必泰液漱口,洗必泰甘油涂鼻、外耳道洗必泰甘油涂鼻、外耳道,利福平眼药水滴双眼等；利福平眼药水滴双眼等；注意肛周清洁卫生。注意肛周清洁卫生。3.受者准备预处理前应仔细体检；进行痰、尿、粪便、皮肤、20 实验室检查主要包括骨髓、血实验室检查主要包括骨髓、血及心、肺、肝肾功能等检查。除做与及心、肺、肝肾功能等检查。除做与供者相同的项目外供者相同的项目外,还应查肺功能、还应查肺功能、X X线胸片、如有条件者可做有关内分泌线胸片、如有条件者可做有关内分泌方面的检查。方面的检查。实验室检查主要包括骨髓、血及心、肺、肝肾功能等检21 入层流室当天剪指甲入层流室当天剪指甲,剃尽全身毛剃尽全身毛发发,清洁淋浴后用洗必泰液药浴清洁淋浴后用洗必泰液药浴20203030分分钟钟,着无菌衣、帽、口罩着无菌衣、帽、口罩,用无菌单包裹送用无菌单包裹送入无菌层流室。入无菌层流室。入室后保持无菌环境入室后保持无菌环境,进无菌饮食进无菌饮食,热热量、蛋白质和维生素补充要足够。量、蛋白质和维生素补充要足够。工作人员严格进行反向隔离。工作人员严格进行反向隔离。入层流室当天剪指甲,剃尽全身毛发,清洁淋浴后用洗必224.4.骨髓移植前预处理骨髓移植前预处理 预处理目的是抑制受体免疫系预处理目的是抑制受体免疫系统统,不使移植的供体造血干细胞被不使移植的供体造血干细胞被受体所排斥。各疾病预处理的方案受体所排斥。各疾病预处理的方案很多。很多。4.骨髓移植前预处理 预处理目的是抑制受体免疫系统,23(1)(1)再障和非肿瘤性疾病再障和非肿瘤性疾病:方案一方案一:单一环磷酰胺单一环磷酰胺(CTX)(CTX)静滴。静滴。方案二方案二:环磷酰胺和全身照射环磷酰胺和全身照射(CTX+TBI(CTX+TBI）。）。(2)(2)白血病白血病:方案一方案一CTX+TBI CTX+TBI 方案二方案二:CTX+:CTX+柔红霉素柔红霉素+TBI+TBI(1)再障和非肿瘤性疾病:方案一:单一环磷酰胺(CTX)24骨髓采集骨髓采集 在手术室内对供者进行骨髓采集。在手术室内对供者进行骨髓采集。一般应用硬膜外麻醉一般应用硬膜外麻醉,采髓部位以骼采髓部位以骼后上棘为最佳后上棘为最佳,也可在骼前上棘或也可在骼前上棘或/和和胸骨或胸骨或/和棘突部位和棘突部位,儿童则需加胫骨儿童则需加胫骨处处,以多点和不同深度采髓以多点和不同深度采髓,每点采每点采101015ml15ml骨骼血骨骼血,总量总量101015ml/Kg(60015ml/Kg(6001000ml)1000ml)。骨髓采集 在手术室内对供者进行骨髓采集。一般应用25 移植骨髓所需的有核细胞数应按移植骨髓所需的有核细胞数应按受（患）者体重和根据供体来源而定：受（患）者体重和根据供体来源而定：（1 1）SBMTSBMT需需3.0-5.0103.0-5.0107 7/Kg/Kg（2 2）Allo-BMTAllo-BMT需需2.0-6.0102.0-6.0108 8/Kg /Kg 当采集到当采集到400ml400ml时时,应开始回输事应开始回输事先采集的自身贮备血先采集的自身贮备血,以防休克以防休克,术后术后需补充各种造血因子。需补充各种造血因子。移植骨髓所需的有核细胞数应按受（患）者体重和根据供体26（2 2）过滤）过滤 通过通过1717、1818号针头二次过滤号针头二次过滤,或或不锈钢网不锈钢网(孔径孔径0.2010.2010.307mm)0.307mm)过滤过滤后注射至血袋或采集瓶中。一般吸取后注射至血袋或采集瓶中。一般吸取的骨髓用生理盐水或的骨髓用生理盐水或16401640稀释液肝素稀释液肝素抗凝抗凝,每毫升骨髓血需含肝素每毫升骨髓血需含肝素15152020单位，以防骨髓血凝集。单位，以防骨髓血凝集。（2）过滤 通过17、18号针头二次过滤,或不锈钢27（3 3）骨髓回输）骨髓回输从受者锁骨下大静脉插管内输入。从受者锁骨下大静脉插管内输入。输入前将装有骨髓血的采血袋或采集输入前将装有骨髓血的采血袋或采集瓶倒置半小时瓶倒置半小时,使骨髓中脂肪浮于上层使骨髓中脂肪浮于上层,输注即将结束时输注即将结束时,弃去浮在上层的脂肪弃去浮在上层的脂肪滴滴,以防发生脂肪栓塞。以防发生脂肪栓塞。输毕后须应用采髓时所用肝素剂量的输毕后须应用采髓时所用肝素剂量的同等剂量鱼静蛋白同等剂量鱼静蛋白(1mg(1mg鱼精蛋白中和鱼精蛋白中和100100u u肝素肝素)。（3）骨髓回输从受者锁骨下大静脉插管内输入。输入前将28（二）（二）Allo-BMTAllo-BMT骨髓植活标准骨髓植活标准（1 1）植活的直接证据：）植活的直接证据：受者体内出现供者型的性染色体，标记受者体内出现供者型的性染色体，标记型染色体，型染色体，HLAHLA（I I、IIII、和、和IIIIII类）抗原，红细胞、类）抗原，红细胞、粒细胞和血小板抗原，粒细胞和血小板抗原，红细胞与白细胞同工酶，同种异型免疫红细胞与白细胞同工酶，同种异型免疫球蛋白以及其它基因标记等。球蛋白以及其它基因标记等。（二）Allo-BMT骨髓植活标准（1）植活的直接证据：29（2 2）植活的间接证据：受者发生急、）植活的间接证据：受者发生急、慢性慢性GVHDGVHD。（3 3）骨髓重建的证据：移植后）骨髓重建的证据：移植后2 24 4周，受者网织红细胞、粒细胞、淋巴周，受者网织红细胞、粒细胞、淋巴细胞和血小板迅速增高，并逐渐重建细胞和血小板迅速增高，并逐渐重建造血免疫功能。造血免疫功能。（2）植活的间接证据：受者发生急、慢性GVHD。（3）骨髓30四、自身骨髓移植四、自身骨髓移植（一）自身骨髓的采集和保存（一）自身骨髓的采集和保存 骨髓的采集在手术室内予以硬膜外麻骨髓的采集在手术室内予以硬膜外麻醉下进行，儿童则采用全身麻醉。穿刺部醉下进行，儿童则采用全身麻醉。穿刺部位选择在左、右前后髂上棘和胸骨，儿童位选择在左、右前后髂上棘和胸骨，儿童可选择胫骨上端等部位。可选择胫骨上端等部位。ABMT ABMT需有核细胞总数需有核细胞总数5.05.030.01030.0109 9（0.50.55.0105.0108 8/kg/kg体重），骨髓粒系祖体重），骨髓粒系祖细胞（细胞（CFUCFUC C）平均）平均1.01.04.0104.0104 4/kg/kg体体重。重。四、自身骨髓移植（一）自身骨髓的采集和保存 骨髓31 骨髓液按等量比例与保养液混和，骨髓液按等量比例与保养液混和，经不同孔径（经不同孔径（0.2010.2010.307mm0.307mm）的不）的不锈钢滤网，滤去骨髓中脂肪颗粒和碎锈钢滤网，滤去骨髓中脂肪颗粒和碎片。在混有红细胞和骨髓液中每亳升片。在混有红细胞和骨髓液中每亳升加入肝素加入肝素15-2015-20U U，4 4保存保存36364848小小时后回输。也可应用时后回输。也可应用1010二甲亚砜作二甲亚砜作为骨髓冷冻保护剂，使骨髓保存于为骨髓冷冻保护剂，使骨髓保存于196196的液氮中。的液氮中。骨髓液按等量比例与保养液混和，经不同孔径（0.2032（二）骨髓净化（二）骨髓净化 目前国际上将净化方法分为两大目前国际上将净化方法分为两大类：即负净化也称阴性选择：将肿瘤类：即负净化也称阴性选择：将肿瘤细胞从移植物中清除掉；正净化也称细胞从移植物中清除掉；正净化也称阳性选择：将正常造血干细胞从移植阳性选择：将正常造血干细胞从移植物中分离纯化。临床上应用方法多为物中分离纯化。临床上应用方法多为负净化。但无论是物理学、生物学或负净化。但无论是物理学、生物学或其他方法都还不够理想。其他方法都还不够理想。（二）骨髓净化 目前国际上将净化方法分为两大类：即负33（三）自身骨髓移植前预处理（三）自身骨髓移植前预处理 ABMT ABMT的预处理目的是：的预处理目的是：使骨髓使骨髓产生一定空间，使造血干细胞有植入产生一定空间，使造血干细胞有植入和增殖的场所；和增殖的场所；进一步清除体内肿进一步清除体内肿瘤细胞。瘤细胞。精典的方案精典的方案CTXCTX加全身照射加全身照射（TBITBI）或分次全身照射（）或分次全身照射（FTBIFTBI）进行）进行预处理。肺需要适当屏蔽。预处理。肺需要适当屏蔽。（三）自身骨髓移植前预处理 ABMT的预处理目的是：34（四）骨髓回输（四）骨髓回输：同前：同前（五）自身骨髓移植后造血功能恢（五）自身骨髓移植后造血功能恢复（植活标志）复（植活标志）ABMT ABMT后外周血白细胞从无恢复后外周血白细胞从无恢复到到1.0101.0109 9/L/L平均需平均需16162121天；血小天；血小板恢复板恢复501050109 9/L/L平均需平均需14142121天，天，粒细胞恢复粒细胞恢复0.510 0.510 9 9/l/l，平均，平均2121天。天。（四）骨髓回输：同前（五）自身骨髓移植后造血功能恢复（植活35外周血造血干细胞移植外周血造血干细胞移植外周血造血干细胞移植36一、外周血干细移植类型一、外周血干细移植类型 外周血造血干细胞移植可分为：外周血造血干细胞移植可分为：（1 1）自体外周血干细胞移植）自体外周血干细胞移植（APBSCTAPBSCT）（2 2）异基因外周血造血干细胞移植）异基因外周血造血干细胞移植（Allo-PBSCT)Allo-PBSCT)。供受体选择及移植前准备同骨髓供受体选择及移植前准备同骨髓移植。移植。一、外周血干细移植类型 外周血造血干细胞移植可分为：37二、外周血干细胞的动员与采集二、外周血干细胞的动员与采集（一）动员（一）动员 在正常生理条件下，外周血干细胞在正常生理条件下，外周血干细胞数量很少，只有骨髓造血干细胞量的数量很少，只有骨髓造血干细胞量的1 11010，因此，不能满足临床，因此，不能满足临床PBSCTPBSCT数量的需要。常用动员剂有以下几类：数量的需要。常用动员剂有以下几类：1 1重组人造血生长因子重组人造血生长因子 二、外周血干细胞的动员与采集（一）动员 在正常生理条件382 2抗肿瘤化疗药物抗肿瘤化疗药物 （1 1）最大限度地杀灭患者体内的肿瘤细）最大限度地杀灭患者体内的肿瘤细胞；胞；（2 2）在杀伤肿瘤细胞同时，也使正常造）在杀伤肿瘤细胞同时，也使正常造血细胞受到损害，但由于正常造血细胞恢血细胞受到损害，但由于正常造血细胞恢复时间比肿瘤细胞短，故当骨髓抑制解除复时间比肿瘤细胞短，故当骨髓抑制解除时和正常造血细胞恢复之际，外周血干细时和正常造血细胞恢复之际，外周血干细胞数量反馈性增加达胞数量反馈性增加达2525100100倍，从而起倍，从而起到了造血干细胞动员效果。国内常用药物到了造血干细胞动员效果。国内常用药物有环磷酰胺；阿糖胞苷。有环磷酰胺；阿糖胞苷。2抗肿瘤化疗药物（1）最大限度地杀灭患者体内的肿瘤细胞39 采集前动员方案选择要根据恶性肿瘤的采集前动员方案选择要根据恶性肿瘤的类型和患者的具体情况而定。类型和患者的具体情况而定。白血病或恶性淋巴瘤晚期等血液系恶性白血病或恶性淋巴瘤晚期等血液系恶性肿瘤作自身的肿瘤作自身的PBSCTPBSCT时，以选择抗肿瘤化疗时，以选择抗肿瘤化疗药物作为动员剂量为适宜。药物作为动员剂量为适宜。而对于而对于Allo-PBSCTAllo-PBSCT供者宜选用供者宜选用GMGMCSFCSF或或G GCSFCSF。采集前动员方案选择要根据恶性肿瘤的类型和患者的具体情况40（二）采集（二）采集1 1采集时机选择：采集时机选择：（1 1）动员化疗结束后）动员化疗结束后2 23 3周，外周血白细周，外周血白细胞计数升至（胞计数升至（1.0-2.0)101.0-2.0)109 9/L/L时。倘若单时。倘若单用用G-CSFG-CSF动员宜在白细胞计数升至（动员宜在白细胞计数升至（5.5-5.5-10.010.0）时，血小板计数时，血小板计数 501050109 9/L/L；（2 2）外周血）外周血CDCD3434阳性细胞阳性细胞 1 1（正常为（正常为0.20.2 0.10.1）。但采集时机仍需根据患者）。但采集时机仍需根据患者的当时情况而定。的当时情况而定。（二）采集1采集时机选择：（1）动员化疗结束后23周412 2方法：方法：运用血细胞分离机如运用血细胞分离机如Fenwall Fenwall CS3000CS3000，分离，分离3 34 4次或次或COBE COBE SPECTRASPECTRA分离分离1 12 2次，直至采集到次，直至采集到造血功能重建所需的细胞数。造血功能重建所需的细胞数。2方法：运用血细胞分离机如Fenwall CS342四、外周血干细胞净化四、外周血干细胞净化 净化方法有也是二种：阳性选择和净化方法有也是二种：阳性选择和阴性选择。阴性选择。五、外周血干细胞体外扩增五、外周血干细胞体外扩增 为了确保为了确保PBSCTPBSCT后成功的造血重建，后成功的造血重建，CDCD3434细胞不应低于细胞不应低于2.5102.5106 6/kg/kg。因此，。因此，可采用部分可采用部分CDCD3434细胞进行体对扩增。细胞进行体对扩增。四、外周血干细胞净化 净化方法有也是二种：阳性选择和阴性43六、外周血干细胞的冻存六、外周血干细胞的冻存 通常每次经血细胞分离机分离通常每次经血细胞分离机分离后所得的细胞悬液约后所得的细胞悬液约50ml50ml，可加入，可加入等量等量2020二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO）和）和RDMI1640RDMI1640保养液，使保养液，使DMSODMSO的最终浓的最终浓度调整至度调整至1010。然后分装于血液冻。然后分装于血液冻存袋内（每袋存袋内（每袋100ml100ml）。）。六、外周血干细胞的冻存 通常每次经血细胞分离机分离后44采取二步降温法：采取二步降温法：第一步先第一步先1/min1/min速率降至速率降至4545，第二步则以第二步则以5 510/min10/min降至降至80809090，程序结束后，最后将样品，程序结束后，最后将样品置于置于196196液氮中贮存。液氮中贮存。采取二步降温法：第一步先1/min速率降至45，第45 当需要应用时，回输前将冻存的外周当需要应用时，回输前将冻存的外周血干细胞悬液立即置入血干细胞悬液立即置入40404242水浴中水浴中3min3min内迅速解冻，内迅速解冻，然后低温离心去除含然后低温离心去除含DMSODMSO上清液。上清液。加等量加等量RPMI1640RPMI1640保养液稀释，每次输保养液稀释，每次输注注400400600ml600ml，在，在1 1小时内静脉输完毕。小时内静脉输完毕。当需要应用时，回输前将冻存的外周血干细胞悬液立即置入446七、外周血干细胞移植后植活特点七、外周血干细胞移植后植活特点 外周血干细胞移植后，其外周血移外周血干细胞移植后，其外周血移植后中性粒细胞（植后中性粒细胞（PMNPMN）上升常出现二个）上升常出现二个峰值。峰值。第一次峰值即在第一次峰值即在PMNPMN恢得到恢得到 0.5 0.510109 9/L/L，平均出现在移植后，平均出现在移植后1111天，随后呈一天，随后呈一度下降趋势，然后约在第度下降趋势，然后约在第3 34 4周时再次出周时再次出现第二峰值，至后白细胞恢得正常。现第二峰值，至后白细胞恢得正常。七、外周血干细胞移植后植活特点 外周血干细胞移植后47 目前认为第一次目前认为第一次PMNPMN峰的出峰的出现是由于外周血中较晚造血祖细现是由于外周血中较晚造血祖细胞增殖分化的结果；第二次峰值胞增殖分化的结果；第二次峰值的出现则是由于较原始造血干细的出现则是由于较原始造血干细胞增殖分化的结果。而血小板升胞增殖分化的结果。而血小板升至至 50.010 50.0109 9/L/L平均时间为平均时间为1313天。天。目前认为第一次PMN峰的出现是由于外周血中较晚造血48脐血造血干细胞移植脐血造血干细胞移植脐血造血干细胞移植49 70 70年代发现脐血中含有丰富造血年代发现脐血中含有丰富造血细胞、其数量和质量与骨髓相似。细胞、其数量和质量与骨髓相似。8080年代末则用脐血代替骨髓行造血干细年代末则用脐血代替骨髓行造血干细胞移植获得成功。因此许多国家相继胞移植获得成功。因此许多国家相继建立脐血库，我国也正在筹划之中，建立脐血库，我国也正在筹划之中，以期有可能解决异基因造血干细胞移以期有可能解决异基因造血干细胞移植中遇到的一些难题。植中遇到的一些难题。70年代发现脐血中含有丰富造血细胞、其数量和质量与50一、脐血的采集一、脐血的采集 脐血可通过脐静脉穿刺收集，有两脐血可通过脐静脉穿刺收集，有两种方式：种方式：(1)(1)胎盘娩出前收集；胎盘娩出前收集；(2)(2)胎盘娩出后收集。胎盘娩出后收集。采集脐血时，可用肝素、采集脐血时，可用肝素、ACDACD（枸橼（枸橼酸、枸橼酸盐和葡萄糖）和酸、枸橼酸盐和葡萄糖）和CPDCPD（枸橼酸（枸橼酸盐、磷酸盐和葡萄糖）作为抗凝剂。盐、磷酸盐和葡萄糖）作为抗凝剂。一、脐血的采集 脐血可通过脐静脉穿刺收集，有两种方51 每个胎盘可采集量为每个胎盘可采集量为4242240240（中位数（中位数103103）mlml，其中约含有核细胞，其中约含有核细胞1.01.02.010 2.010 9 9/l/l，单个核细胞，单个核细胞(MNC)1.010(MNC)1.0109 9,CD34,CD34细胞细胞1.0101.0107 7 理论上估测足可供体重理论上估测足可供体重5050公斤以内的患公斤以内的患者移植之用。者移植之用。每个胎盘可采集量为42240（中位数103）ml，其52二、脐血分离与保存二、脐血分离与保存脐带血中的造血细胞可通过羟乙脐带血中的造血细胞可通过羟乙基淀粉沉淀法、密度梯度分离法、流基淀粉沉淀法、密度梯度分离法、流式细胞仪分离法及单克隆抗体法等，式细胞仪分离法及单克隆抗体法等，物理生物学方法分离获得。物理生物学方法分离获得。冻存的主要步聚：冻存的主要步聚：(1)(1)程控加入程控加入2020DMSODMSO（每分钟加体积的（每分钟加体积的5 5，边加边搅，边加边搅拌）；（拌）；（2 2）程控降温、冻存。）程控降温、冻存。二、脐血分离与保存脐带血中的造血细胞可通过羟乙基淀粉沉53三、脐血造干血细胞扩增三、脐血造干血细胞扩增原因：原因：单个脐血中造血干细胞数量有限。单个脐血中造血干细胞数量有限。另外，在脐血样品分离、冻存、融化、处另外，在脐血样品分离、冻存、融化、处理和输注等各个环节中还要损耗一部分细理和输注等各个环节中还要损耗一部分细胞，因此不能满足成人造血细胞移植的需胞，因此不能满足成人造血细胞移植的需要。要。扩增过程还可清除移植物中残留扩增过程还可清除移植物中残留T T淋巴细胞淋巴细胞和肿瘤细胞的作用，减少和肿瘤细胞的作用，减少GVHDGVHD的发生率。的发生率。三、脐血造干血细胞扩增原因：单个脐血中造血干细胞数量有限54四、脐血造血干细胞移植后植活特点四、脐血造血干细胞移植后植活特点（1 1）受者外周血中性粒细胞绝对值）受者外周血中性粒细胞绝对值（ANCANC）5.0105.0109 9/L/L恢复所需时间：同胞恢复所需时间：同胞相关供者平均为相关供者平均为2222天，而无关供者平均为天，而无关供者平均为2424天。天。（2 2）血小板计数）血小板计数 5.0105.0109 9/L/L 恢复所需时恢复所需时间：同胞相关供者平均为间：同胞相关供者平均为4848天，而无关供天，而无关供者平均为者平均为5454天。天。四、脐血造血干细胞移植后植活特点（1）受者外周血中性粒细胞55胎肝造血干细胞移植胎肝造血干细胞移植胎肝造血干细胞移植56 1958 1958年年UphoffUphoff首先发现对致死剂量照首先发现对致死剂量照射小鼠输注胎肝细胞悬液后具有促进骨髓射小鼠输注胎肝细胞悬液后具有促进骨髓造血功能恢复的显著疗效。人们发现胎龄造血功能恢复的显著疗效。人们发现胎龄为为3 36 6个月胎肝含有极其丰富的造血干细个月胎肝含有极其丰富的造血干细胞，它和骨髓造血干细胞相比，有着类似胞，它和骨髓造血干细胞相比，有着类似的增殖分化和重建骨髓造血功能的能力，的增殖分化和重建骨髓造血功能的能力，且此时淋巴细胞量小于且此时淋巴细胞量小于2 2，且多为未完，且多为未完全分化成熟的全分化成熟的T T淋巴细胞淋巴细胞.因此，故移植后因此，故移植后GVHDGVHD的发生率低及严重程度轻。的发生率低及严重程度轻。1958年Uphoff首先发现对致死剂量照射小鼠输注胎57一、胎肝造血细胞制备一、胎肝造血细胞制备 人胎肝可以取自水囊引产、前列腺素人胎肝可以取自水囊引产、前列腺素引产正常胎儿。在无菌条件下，取得肝脏。引产正常胎儿。在无菌条件下，取得肝脏。将肝脏置于培养皿中剪成细小块。然后，将肝脏置于培养皿中剪成细小块。然后，投入装有双层或单层高压灭菌处理的铜网投入装有双层或单层高压灭菌处理的铜网（孔径（孔径100100200200目）的小烧杯，然后倒入目）的小烧杯，然后倒入约约20ml20ml的液体，并用的液体，并用10ml10ml注射器针芯将肝注射器针芯将肝组织块研磨成浆状，收集在无菌瓶中，并组织块研磨成浆状，收集在无菌瓶中，并通过带通过带4 4号针头的注射器制成单细胞悬液后号针头的注射器制成单细胞悬液后备用。备用。一、胎肝造血细胞制备 人胎肝可以取自水囊引产、前列58三、胎肝造血干细胞分离与贮存三、胎肝造血干细胞分离与贮存（一）胎肝造血干细胞分离（一）胎肝造血干细胞分离 在正常肝组织中近半数肝细在正常肝组织中近半数肝细胞和胞和1 1的的T T淋巴细胞，因此，分淋巴细胞，因此，分离除去这些非造血细胞有利于胎离除去这些非造血细胞有利于胎肝造血干细胞的超低温贮存。肝造血干细胞的超低温贮存。三、胎肝造血干细胞分离与贮存（一）胎肝造血干细胞分离 59 采用直径为采用直径为15mm15mm的的10ml10ml角度离心角度离心管以及聚蔗糖一泛影葡胺分层液，胎管以及聚蔗糖一泛影葡胺分层液，胎肝细胞在肝细胞在44下经非连续密度梯度离心下经非连续密度梯度离心（15001500转转/min/min）20min20min后，收集界面层后，收集界面层的单个核心细胞。此时，肝细胞已基的单个核心细胞。此时，肝细胞已基本被去除，而粒巨核细胞集落形成单本被去除，而粒巨核细胞集落形成单位（位（CFUCFUGMGM）回收率为）回收率为74748989。采用直径为15mm的10ml角度离心管以及聚蔗糖一60（二）胎肝造血干细胞贮存（二）胎肝造血干细胞贮存 将分离的胎肝细胞中的单个核细将分离的胎肝细胞中的单个核细胞悬液与二甲亚砜保存液胞悬液与二甲亚砜保存液1 1：1 1比例混比例混合后，置入低温贮存袋内，然后按二合后，置入低温贮存袋内，然后按二步降温法降温。步降温法降温。（二）胎肝造血干细胞贮存 将分离的胎肝细胞中的单个核61造血干细胞移植造血干细胞移植 合并症和并发症合并症和并发症造血干细胞移植 合并症和并发症62一、移植物抗宿主病一、移植物抗宿主病二、感染：在移植过程中感染是二、感染：在移植过程中感染是常见的合并症常见的合并症,也是移植失败的重也是移植失败的重要的原因之一。要的原因之一。三、间质性肺炎（三、间质性肺炎（IPNIPN）：是）：是AllAll0 0BMTBMT后仅次于后仅次于GVHDGVHD第二位致命性并发症，第二位致命性并发症，发生率约为发生率约为4040。一、移植物抗宿主病二、感染：在移植过程中感染是常见的合并症63四、肝静脉闭塞病四、肝静脉闭塞病 五、出出血性膀胱炎（五、出出血性膀胱炎（HEHE）六、渗透综合症（或称肺水肿综合症）六、渗透综合症（或称肺水肿综合症）七、移植排斥七、移植排斥八、出血八、出血九、其它：移植后出现的晚期并发症有白九、其它：移植后出现的晚期并发症有白内障、白质脑病、甲状腺功能低下、性腺内障、白质脑病、甲状腺功能低下、性腺功能低下、儿童生长发育迟缓、以及继发功能低下、儿童生长发育迟缓、以及继发第二肿瘤等。第二肿瘤等。四、肝静脉闭塞病 五、出出血性膀胱炎（HE）六、渗透64造血干细胞移植造血干细胞移植 适应症及临床应用适应症及临床应用 造血干细胞移植 适应症及临床应用 65一、适应症及临床应用一、适应症及临床应用（一）急性白血病（一）急性白血病（二）慢性粒细胞白血病（二）慢性粒细胞白血病（CGLCGL）（三）恶性淋巴瘤（三）恶性淋巴瘤（四）多发性骨髓瘤（四）多发性骨髓瘤（五）重型再生障碍性贫血（五）重型再生障碍性贫血（六）遗传性疾病（六）遗传性疾病（七）实体肿瘤（七）实体肿瘤一、适应症及临床应用（一）急性白血病（二）慢性粒细胞白血66脐血造血干细胞移植前景：脐血造血干细胞移植前景：(1)(1)脐血移植所需有核细胞数量较少，可供脐血移植所需有核细胞数量较少，可供儿童应用；若进一步增加采集量，改善处儿童应用；若进一步增加采集量，改善处理过程，其造血细胞数足敷成人移植之用。理过程，其造血细胞数足敷成人移植之用。(2)(2)脐血淋巴细胞大部分为幼稚型脐血淋巴细胞大部分为幼稚型T T淋巴细淋巴细胞，功能不成熟，胞，功能不成熟，HLAHLA不合的移植后，不合的移植后，GVHDGVHD较同类骨髓移植（较同类骨髓移植（BMTBMT）少而轻。）少而轻。脐血造血干细胞移植前景：(1)脐血移植所需有核细胞数量较少67结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End结束语68感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日 感谢聆听演讲人：XXXXXX 时 间：XX年69